论文部分内容阅读
摘 要：通过详细的外部形态观察、内部显微结构比对以及分子系统发育分析相结合的方法，鉴定出江西九岭山国家级自然保护区毒蘑菇的一个新记录种——日本红菇（Russula japonica）。该种的鉴别特征为菌盖乳白色，漏斗状;菌肉洁白厚实，伤不变色;菌柄白色，圆柱形，向下渐细;孢子淡黄色，近球形，具刺，淀粉质。
关键词：日本红菇;毒蘑菇;新记录种;九岭山
红菇属是常见的外生菌根菌[1-4]，全球已知约有800个物种[5]，我国已报道160余种[6-7]，江西省已报道35种[8]。菌根菌在森林生态系统中，对于水分、碳素以及其他养分转化和能量循环起着重要作用[9]。另外，红菇属真菌多数可食用，如正红菇（R.vinosa）、美味红菇（R.delica）在全国各地被广泛食用，味道鲜美，富含蛋白质、脂肪酸、维生素等营养成分[10]。该属也不乏毒菇，如亚稀褶红菇（R.subnigricans），中毒事件时有发生[11]。同时，部分红菇属真菌，如血红菇（R.sanguinea）、毒红菇（R.emetica）则具有一定的药用价值，具有抗肿瘤、抗病毒和促进免疫等功效[12]。
本文发现并描述了江西九岭山国家级自然保护区（下称九岭山保护区）红菇属真菌一新记录种——日本红菇（Russula japonica），该物种为毒蘑菇，2020年被当地群众误食导致胃肠炎型中毒，患者在靖安县中医院就诊后，因病情轻微自愈。
1 材料与方法
1.1 供试标本
标本于2020年10月采集于九岭山保护区，拍摄新鲜标本生境照片，采样时尽量保证其完整性。详细记录标本形态特征及生境后，将其放置于烘箱中，60 ℃烘干，经干燥后保存于中国科学院昆明植物研究所隐花植物标本馆，同时保存与之配套的硅胶干燥材料，用于分子实验。
1.2 研究方法
1.2.1 形态学鉴定
标本的外部形态特征根据野外发现的子实体观察记录，包括采集地点、生境特点、采集时间以及子实体各部位结构的特征等。
标本的内部显微特征依据对烘干标本的徒手切片观察，使用5%的氢氧化钾溶液为载浮剂，在显微镜下放大100倍（油镜）下观察得到。分别随机选取30个孢子和担子进行测量，记录其形状、大小和颜色等。
1.2.2 分子系统学研究
采用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒对硅胶干燥的分子材料进行DNA提取。在查阅相关的文献资料和进行预实验的基础上[13-15]，本研究选用ITS4/ITS5引物对内转录间隔区（ITS）序列进行扩增。扩增产物经凝胶电泳检测后送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测得的ITS序列采用BioEdit v7.0.9打开检查序列峰形图，核对碱基是否读取正确，同时采用NCBI的在线软件BLAST对所得序列与GenBank数据库中的序列进行比对，以确保所得序列与研究对象相互对应，并按照BLAST比对结果选取重建系统发育树的基因序列。采用MEGA v7.0以最大似然法（Maximum Likelihood）和邻接法（Neighbor joining）进行系统发育分析，经1 000次重复获得统计学支持[16-18]。
2 结果与分析
2.1 形态特征
日本红菇（Russula japonica），子实体中到大型，菌盖6～14 cm，初半球形，后呈漏斗状，边缘无条纹;乳白色，表面光滑，潮湿时略黏，常伴有淡黄色至褐色的污漬。菌褶近离生，密集，幼嫩时乳白色，成熟后淡赭色，有小菌褶。菌柄圆柱形，中生，长4～6 cm，粗1.5～2 cm，由上至下渐细，基部不膨大，内部白色，海绵质。孢子长5.5～7.5 μm，宽5.0～7.0 μm，淡黄色，近球状，表面具刺，淀粉质。担子长30～45 μm，宽7.0～11 μm，长棒状，具4小梗。模式产地为日本，夏秋季散生或群生于阔叶林地上，分布于日本[19]、中国[20]。研究标本于2020年10月10日采于江西宜春、九岭山保护区海拔300 m处。
2.2 分子系统发育分析
采自江西的标本ITS序列通过GenBank数据库中BLAST序列比对，与Russula japonica序列同源性达97%。运用MEGA 7.0软件，以最大似然法（Maximum Likelihood）和邻接法（Neighbor Joining）构建系统发育树，结果表明，两种方法建立的系统发育树型非常接近，图2为采用最大似然法建立的系统发育树。系统发育分析结果显示，采自江西的标本与Russula japonica聚在同一分枝上，支持率为99%。
3 结论
结合形态特征比对和分子系统发育分析的结果，最终确定本研究采集的标本（HKAS 105290）为日本红菇（Russula japonica），可导致肠胃型中毒。其与可食用的白乳菇（Lactarius piperatus）形态特征十分相似而容易被误食，但后者伤后泌出白色乳液、味辣[21-25]。建议在当地开展较广泛的科普宣传教育，提升群众食品安全认知，同时避免蘑菇中毒事件的发生。
参考文献
[1]李国杰，李赛飞，赵东，等.红菇属研究进展[J].菌物学报，2015，34（5）：821-848.
[2]LOONEY B P，RYBERG M，HAMPE F，et al.Into and out of the tropics： global diversification patterns in a hyperdiverse clade of ectomycorrhizal fungi[J].Molecular Ecology，2016，25（2）：630-647. [3]温祝桂，陈亚华.中国外生菌根真菌研究进展[J].生物技术通报，2013，4（2）：22-30.
[4]BUYCK B，ZOLLER S，HOFSTETTER V.Walking the thin line… ten years later： the dilemma of above-versus below-ground features to support phylogenies in the Russulaceae （Basidiomycota）[J].Fungal Diversity，2018，89（1）：267-292.
[5]杨智，王华伟，沙涛.外生菌根真菌的研究进展[J].中国食用菌，2016，35（1）：1-7.
[6]李国杰，邓春英，史路瑶，等.中国红菇属乳菇状亚组的三个新种[J].菌物学报，2020，39（4）：618-636.
[7]姜旭萌，李杨坤，梁俊峰，等.中国红菇属2个新记录种[J].福建农林大学学报（自然科学版），2017，46（1）：103-108.
[8]张俊波，宋海燕，胡殿明.江西大型真菌名录调查初报[J].生物灾害科学，2016，39（1）：1-13.
[9]杨云礼，徐明，邹晓，等.我国南方地区外生菌根真菌研究进展[J].西部林业科学，2019，48（5）：131-142.
[10]戴玉成，周丽伟，杨祝良，等.中国食用菌名录[J].菌物学报，2010，29（1）：1-21.
[11]LI H，ZHANG H，ZHANG Y，et al.Mushroom Poisoning Outbreaks—China， 2019[J].China CDC Weekly，2020，2（2）：19-24.
[12]赵永勋，吴晶.红菇属真菌研究进展[J].林业科技，2012，37（2）：47-49.
[13]ODA T，TANAKA C，TSUDA M.Molecular phylogeny of Japanese Amanita species based on nucleotide sequences of the internal transcribed spacer region of nuclear ribosomal DNA[J].Mycoscience，1999，40（1）：57-64.
[14]王向华.红菇科可食真菌的若干分类问题[J].菌物学报，2020，39（9）：1617-1639.
[15]LEE H，PARK M S，Jung P E，et al.Re-evaluation of the taxonomy and diversity of Russula section Foetentinae （Russulales， Basidiomycota） in Korea[J].Mycoscience，2017，58（5）：351-360.
[16]赵宽，方洁钰，曾青青.江西省毒蘑菇新记录种：赤脚鹅膏[J].江西科技师范大学学报，2020，4（6）：85-88.
[17]冯云利，马明，岳万松，等.云南市场易混淆红菇的系统发育分析[J].中国食用菌，2020，39（11）：78-82.
[18]LI G J，ZHAO R L，ZHANG C L，et al.A preliminary DNA barcode selection for the genus Russula （Russulales， Basidiomycota）[J].Mycology，2019，10（2）：61-74.
[19]李玉，李泰輝，杨祝良，等.中国大型菌物资源图鉴[M].郑州：中原农民出版社，2015.
[20]霍光华，颜俊清，张林平，等.江西大型真菌图鉴[M].南昌：江西科学技术出版社，2020.
[21]图力古尔，包海鹰，李玉.中国毒蘑菇名录[J].菌物学报，2014，33（3）：517-548.
[22]张汉武，宋文霞.甘肃常见毒蘑菇及其中毒类型[J].食用菌，2017，39（4）：17-19.
[23]宋相金，黄秋菊，宋斌，等.车八岭自然保护区大型食药用菌及毒菇资源调查[J].食用菌，2018，40（2）：24-28.
[24]王和，徐康平，谭桂山.乳菇属真菌研究概况[J].中南药学，2018，16（4）：504-512.
[25]高晓烨，方洁钰，温怡琳，等.江西省大型真菌多样性研究现状[J].食药用菌，2020，28（3）：166-169.
关键词：日本红菇;毒蘑菇;新记录种;九岭山
红菇属是常见的外生菌根菌[1-4]，全球已知约有800个物种[5]，我国已报道160余种[6-7]，江西省已报道35种[8]。菌根菌在森林生态系统中，对于水分、碳素以及其他养分转化和能量循环起着重要作用[9]。另外，红菇属真菌多数可食用，如正红菇（R.vinosa）、美味红菇（R.delica）在全国各地被广泛食用，味道鲜美，富含蛋白质、脂肪酸、维生素等营养成分[10]。该属也不乏毒菇，如亚稀褶红菇（R.subnigricans），中毒事件时有发生[11]。同时，部分红菇属真菌，如血红菇（R.sanguinea）、毒红菇（R.emetica）则具有一定的药用价值，具有抗肿瘤、抗病毒和促进免疫等功效[12]。
本文发现并描述了江西九岭山国家级自然保护区（下称九岭山保护区）红菇属真菌一新记录种——日本红菇（Russula japonica），该物种为毒蘑菇，2020年被当地群众误食导致胃肠炎型中毒，患者在靖安县中医院就诊后，因病情轻微自愈。
1 材料与方法
1.1 供试标本
标本于2020年10月采集于九岭山保护区，拍摄新鲜标本生境照片，采样时尽量保证其完整性。详细记录标本形态特征及生境后，将其放置于烘箱中，60 ℃烘干，经干燥后保存于中国科学院昆明植物研究所隐花植物标本馆，同时保存与之配套的硅胶干燥材料，用于分子实验。
1.2 研究方法
1.2.1 形态学鉴定
标本的外部形态特征根据野外发现的子实体观察记录，包括采集地点、生境特点、采集时间以及子实体各部位结构的特征等。
标本的内部显微特征依据对烘干标本的徒手切片观察，使用5%的氢氧化钾溶液为载浮剂，在显微镜下放大100倍（油镜）下观察得到。分别随机选取30个孢子和担子进行测量，记录其形状、大小和颜色等。
1.2.2 分子系统学研究
采用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒对硅胶干燥的分子材料进行DNA提取。在查阅相关的文献资料和进行预实验的基础上[13-15]，本研究选用ITS4/ITS5引物对内转录间隔区（ITS）序列进行扩增。扩增产物经凝胶电泳检测后送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测得的ITS序列采用BioEdit v7.0.9打开检查序列峰形图，核对碱基是否读取正确，同时采用NCBI的在线软件BLAST对所得序列与GenBank数据库中的序列进行比对，以确保所得序列与研究对象相互对应，并按照BLAST比对结果选取重建系统发育树的基因序列。采用MEGA v7.0以最大似然法（Maximum Likelihood）和邻接法（Neighbor joining）进行系统发育分析，经1 000次重复获得统计学支持[16-18]。
2 结果与分析
2.1 形态特征
日本红菇（Russula japonica），子实体中到大型，菌盖6～14 cm，初半球形，后呈漏斗状，边缘无条纹;乳白色，表面光滑，潮湿时略黏，常伴有淡黄色至褐色的污漬。菌褶近离生，密集，幼嫩时乳白色，成熟后淡赭色，有小菌褶。菌柄圆柱形，中生，长4～6 cm，粗1.5～2 cm，由上至下渐细，基部不膨大，内部白色，海绵质。孢子长5.5～7.5 μm，宽5.0～7.0 μm，淡黄色，近球状，表面具刺，淀粉质。担子长30～45 μm，宽7.0～11 μm，长棒状，具4小梗。模式产地为日本，夏秋季散生或群生于阔叶林地上，分布于日本[19]、中国[20]。研究标本于2020年10月10日采于江西宜春、九岭山保护区海拔300 m处。
2.2 分子系统发育分析
采自江西的标本ITS序列通过GenBank数据库中BLAST序列比对，与Russula japonica序列同源性达97%。运用MEGA 7.0软件，以最大似然法（Maximum Likelihood）和邻接法（Neighbor Joining）构建系统发育树，结果表明，两种方法建立的系统发育树型非常接近，图2为采用最大似然法建立的系统发育树。系统发育分析结果显示，采自江西的标本与Russula japonica聚在同一分枝上，支持率为99%。
3 结论
结合形态特征比对和分子系统发育分析的结果，最终确定本研究采集的标本（HKAS 105290）为日本红菇（Russula japonica），可导致肠胃型中毒。其与可食用的白乳菇（Lactarius piperatus）形态特征十分相似而容易被误食，但后者伤后泌出白色乳液、味辣[21-25]。建议在当地开展较广泛的科普宣传教育，提升群众食品安全认知，同时避免蘑菇中毒事件的发生。
参考文献
[1]李国杰，李赛飞，赵东，等.红菇属研究进展[J].菌物学报，2015，34（5）：821-848.
[2]LOONEY B P，RYBERG M，HAMPE F，et al.Into and out of the tropics： global diversification patterns in a hyperdiverse clade of ectomycorrhizal fungi[J].Molecular Ecology，2016，25（2）：630-647. [3]温祝桂，陈亚华.中国外生菌根真菌研究进展[J].生物技术通报，2013，4（2）：22-30.
[4]BUYCK B，ZOLLER S，HOFSTETTER V.Walking the thin line… ten years later： the dilemma of above-versus below-ground features to support phylogenies in the Russulaceae （Basidiomycota）[J].Fungal Diversity，2018，89（1）：267-292.
[5]杨智，王华伟，沙涛.外生菌根真菌的研究进展[J].中国食用菌，2016，35（1）：1-7.
[6]李国杰，邓春英，史路瑶，等.中国红菇属乳菇状亚组的三个新种[J].菌物学报，2020，39（4）：618-636.
[7]姜旭萌，李杨坤，梁俊峰，等.中国红菇属2个新记录种[J].福建农林大学学报（自然科学版），2017，46（1）：103-108.
[8]张俊波，宋海燕，胡殿明.江西大型真菌名录调查初报[J].生物灾害科学，2016，39（1）：1-13.
[9]杨云礼，徐明，邹晓，等.我国南方地区外生菌根真菌研究进展[J].西部林业科学，2019，48（5）：131-142.
[10]戴玉成，周丽伟，杨祝良，等.中国食用菌名录[J].菌物学报，2010，29（1）：1-21.
[11]LI H，ZHANG H，ZHANG Y，et al.Mushroom Poisoning Outbreaks—China， 2019[J].China CDC Weekly，2020，2（2）：19-24.
[12]赵永勋，吴晶.红菇属真菌研究进展[J].林业科技，2012，37（2）：47-49.
[13]ODA T，TANAKA C，TSUDA M.Molecular phylogeny of Japanese Amanita species based on nucleotide sequences of the internal transcribed spacer region of nuclear ribosomal DNA[J].Mycoscience，1999，40（1）：57-64.
[14]王向华.红菇科可食真菌的若干分类问题[J].菌物学报，2020，39（9）：1617-1639.
[15]LEE H，PARK M S，Jung P E，et al.Re-evaluation of the taxonomy and diversity of Russula section Foetentinae （Russulales， Basidiomycota） in Korea[J].Mycoscience，2017，58（5）：351-360.
[16]赵宽，方洁钰，曾青青.江西省毒蘑菇新记录种：赤脚鹅膏[J].江西科技师范大学学报，2020，4（6）：85-88.
[17]冯云利，马明，岳万松，等.云南市场易混淆红菇的系统发育分析[J].中国食用菌，2020，39（11）：78-82.
[18]LI G J，ZHAO R L，ZHANG C L，et al.A preliminary DNA barcode selection for the genus Russula （Russulales， Basidiomycota）[J].Mycology，2019，10（2）：61-74.
[19]李玉，李泰輝，杨祝良，等.中国大型菌物资源图鉴[M].郑州：中原农民出版社，2015.
[20]霍光华，颜俊清，张林平，等.江西大型真菌图鉴[M].南昌：江西科学技术出版社，2020.
[21]图力古尔，包海鹰，李玉.中国毒蘑菇名录[J].菌物学报，2014，33（3）：517-548.
[22]张汉武，宋文霞.甘肃常见毒蘑菇及其中毒类型[J].食用菌，2017，39（4）：17-19.
[23]宋相金，黄秋菊，宋斌，等.车八岭自然保护区大型食药用菌及毒菇资源调查[J].食用菌，2018，40（2）：24-28.
[24]王和，徐康平，谭桂山.乳菇属真菌研究概况[J].中南药学，2018，16（4）：504-512.
[25]高晓烨，方洁钰，温怡琳，等.江西省大型真菌多样性研究现状[J].食药用菌，2020，28（3）：166-169.