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摘要：通过花粉管通道将高丹草总DNA导入玉米自交系，获得遗传改变的突变体。突变体第1代穗柄明显增长，结实双穗，第2代长穗柄性状消失，双穗性状保持，第3代双穗性状保持，株高发生分化。经纯化选择，获得遗传稳定的饲草玉米种质新材料，株高增高，叶片变细长，双穗发育良好，饲用品质改善，全株干物质含量提高。
关键词：花粉管通道技术;高丹草;总DNA提取;饲草玉米;种质资源
草牧业是农业的重要组成部分，是一个国家农业现代化水平的重要标志。欧美发达国家畜牧产值的60%以上由饲草转化而来，美国饲料蛋白的50%以上来自饲草[1]。任继周院士指出，制约我国草业发展的瓶颈是品种问题。优良种质资源匮乏是制约我国饲草品种选育的重要因素之一。草料是草食牲畜的必需饲料组分，过量使用粮食饲养，不仅增加草食牲畜的养殖成本，而且会造成草食牲畜免疫力降低，增加发病机会。玉米是重要的粮食和饲料作物，2015年中央一号文件提出“粮改饲”工程，青贮玉米是工程推荐的首选草种。
利用花粉管通道转导外源DNA是我国科学家首创的植物转基因技术，1981年首次利用该技术培育出抗枯萎病的棉花新品种[2]。随后，众多科学家以不同植物为对象进行了大量研究，取得一批重要成果[3]。祁永红等将大豆DNA导入玉米自交系，获得具有广泛变异的不同类型[4]。张秀君等将含高赖氨酸蛋白质基因的cDNA导入玉米，使籽粒干物质中赖氨酸含量提高18.75%[5]。孙学辉等将高赖氨酸基因导入玉米自交系，获得种子中粗蛋白含量11.05%、赖氨酸含量提高16.00%的转化植株[6]。王丰等将稗草总DNA和玉米总DNA导入水稻，获得抗稻瘟病转化植株[7]。王罡等将Bt抗虫毒蛋白基因转导到玉米自交系，获得玉米抗虫育种优良抗源[8]。曹阳等研究获得抗虫转基因高粱[9]。侯文胜等成功将人工合成的雪花莲凝聚素基因sgna导入优良小麦品系[10]。乐锦华等将广谱抗真菌的菜豆基因与烟草基因导入棉花育成抗枯萎病、耐黄萎病的抗病新品系[11]。张茂银等将新疆大赖草DNA导入普通春小麦获得大穗、多粒、晚熟变异株[12]。邹冬生等将玉米DNA导入水稻，获得单穗总粒数、千粒质量显著增加的超质量类型[13]。李建粤等将大豆总DNA导入水稻，提高了稻米的蛋白质含量和总氨基酸、赖氨酸含量[14]。
本研究采用花粉管通道技术将植株分蘖力强、产草量高的乐食高丹草总DNA导入玉米自交系，以期获得在营养体生物产量、品质、抗性、再生性等方面有所突破的饲草玉米新种质，丰富饲草玉米育种的亲本选择。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验草种为乐食高丹草，市售;自46玉米自交系由四川省农业科学院牧业研究中心提供。
1.2 试验方法
1.2.1 试验地概况 试验地位于四川省南充市顺庆区潆溪镇（106°12′E，31°06′N），海拔高度为 305 m，年日照时数为1 062 h;年均气温为17.6 ℃，极端最低温度为-2.8 ℃，极端最高温度为 42.1 ℃，10 ℃以上年积温为5 206.9 ℃，平均气温10 ℃以上的天数为232 d;无霜期为307 d;年降水量为1 060 mm。紫色土壤，0～20 cm耕作层土壤pH值为7.94，有机质含量为42.8 g/kg，含全氮 5.1 g/kg、硝态氮178.82 mg/kg、速效钾 163.66 mg/kg、有效磷 11.96 mg/kg。
1.2.2 植物基因组DNA提取 乐食高丹草种子用培养箱25 ℃催芽，剪取幼苗幼嫩茎叶，用天根生化科技（北京）有限公司的DP305型试剂盒提取基因组总DNA;核酸测定仪NanoDrop 2000测定浓度，内切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ20 ℃酶解8 h，用柠檬酸钠（SSC）缓冲液稀释至300 μg/mL，4 ℃保存备用。
1.2.3 外源DNA转导入玉米自交系 2014年4月9日，田间种植自46玉米自交系，穴播，行距 100 cm、株距40 cm，苗高15 cm时间苗，每穴留壮苗1株。开花前夕用硫酸纸袋分别套住雌花和雄花，避免田间自然传粉污染。每天观察开花进度，雌花盛开时人工收集花粉自交授粉，然后继续套袋保护。人工授粉15～24 h后，剪去距穗轴顶部1～2 cm 以上的苞叶和花丝，用移液器将乐食高丹草DNA溶液滴在花丝剪口处，每穗300 μL。继续套袋保护直至玉米成熟，单穗收种。
1.2.4 种植调查 转基因处理玉米单穗收种，翌年按穗行播种，同时播种未处理的自46自交系作对照，全生育期观察比较生长发育情况，发掘性状变异株。变异后代隔离种植，调查其生物学性状、农艺学性状及遗传分化情况。转化第1代只发现1株变异株，作单株调查;其他各代均分别测定5个单株计算算术平均值。叶长、叶宽测量自上而下第7张叶;株高、叶长、叶宽、穗位、穗长、穗围粗用卷尺测量;茎粗用游标卡尺在基部第2茎节“十”字方向测量2次;全株干物质含量测定在籽粒1/2乳线期收割（留茬高度为5 cm），105 ℃杀青30 min后65 ℃烘干测定。
1.2.5 数据处理 采用Excel 2007进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 乐食高丹草基因组DNA提取
经检测，所提取的DNA D260 nm/D280 nm值为 1.83，满足试验要求。
2.2 变异材料发掘
经种植观察，处理材料第1代和对照在种子出苗率、生长发育速度、株高、茎粗、株型、叶片大小、叶色、穗位等指标均未发现明显变异。在处理材料的08穗行发现1株变异（命名为46优），单株结实双穗，穗柄明显增长，穗柄长26 cm（图1）;籽粒變大，百粒质量增加，约为38 g，与对照相比增加约33.33%（表1）。
2.3 变异材料继代 3.4 研究成果的实践意义
本研究采用花粉管通道技术，突破种属限制，将同科异属的高丹草DNA转导入玉米自交系中，获得了株高增高、叶形变得细长、双穗性状突出、干物质含量提高的饲草玉米新种质，增加了饲草玉米育种的素材选择。植株形态的改变表明的确有外源基因整合到受体基因组中，引发了可稳定遗传的变异;双穗发育良好，增加了玉米籽粒在收获物种的比例，饲用品质提高。但研究还只是初步的，新材料的生理生化变异及转化基因的分子检测尚待深入进行，新材料的育种价值更需试验验证。本研究的重要实践意义不在于获得了1份突变新材料，更在于将花粉管通道转基因技术引入饲草育种研究中，为饲草种质资源创新增添了一条行之有效的新途径。
3.5 结论
饲草核心骨干种质资源匮乏及优良品种不足严重制约我国畜牧业的发展。对广大一线育种工作者而言，花粉管通道转基因技术是创新种质资源的一种有效手段，已在其他作物育种中广泛应用，取得可喜成绩，但在饲草育种上几乎还是空白。本研究成功将高丹草DNA转导到饲草玉米中，获得有益突变新材料，展现了花粉管通道转基因技术在饲草种质资源创新中的可行性，为创制出量多质优的饲草种质新资源提供参考。
参考文献：
[1]刘忠宽，秦文利，智建飞. 河北省农牧结合战略研究[J]. 河北农业科学，2006，10（2）：26-30.
[2]龚蓁蓁. 植物“分子育种”的创始人——周光宇[J]. 生命科学，2007，19（3）：254-256.
[3]黄骏麒，钱思颖，刘桂铨，等. 外源抗枯萎病棉DNA导入感病棉的抗性转移[J]. 中国农业科学，1986，19（3）：32-36，97.
[4]祁永红，韩玉珠，李春秋，等. 玉米自交系授粉后外源DNA的导入转化及性状变异的研究初报[J]. 玉米科学，1996，4（1）：19-21.
[5]张秀君，刘俊起，赵 倩，等. 用基因枪将高赖氨酸基因导入玉米及转基因植株的检测[J]. 农业生物技术学报，1999，7（4）：363-367.
[6]孙学辉，敖光明，于静娟，等. 经高赖氨酸基因导入玉米自交系的研究[J]. 农业生物技术学报，2001，9（2）：156-158.
[7]王 丰，柳武革，李金华，等. 水稻外源DNA导入系的创建及主要性状分析[J]. 分子植物育种，2004，2（4）：489-494.
[8]王 罡，张艳贞，魏松红，等. 花粉管通道法将Bt毒蛋白基因导入优良玉米自交系[J]. 吉林农业大学学报，2002，24（4）：40-44.
[9]曹 阳，赵东利，王仁军，等. 高粱花粉管通道法导入抗虫基因的研究[J]. 大连大学学报，2001，22（6）：47-52.
[10]侯文胜，郭三堆，路 明. 利用花粉管通道法获得转雪花莲凝集素基因（sgna）小麦[J]. 植物学通报，2003，20（2）：198-204.
[11]乐锦华，祝建波，崔百明，等. 利用目的基因转化技术培育棉花抗病新品种[J]. 石河子大学学报（自然科学版），2002，6（3）：173-178.
[12]张茂银，刘庆昌，王子霞，等. 用花粉管通道法将新疆大赖草DNA导入普通小麦的研究[J]. 农业生物技术学报，2000，8（2）：165-168.
[13]邹冬生，万文举，彭克勤. 遗传工程水稻研究（二）——玉米DNA导入水稻引起的遗传变异[J]. 湖南农业科学，1993（2）：8-10.
[14]李建粤，范士靖，邹 震，等. 大豆DNA导入引起稻米蛋白质含量变异的遗传稳定性及赖氨酸含量分析[J]. 种子，2001，119（6）：3-7.
[15]杜志宏，张福耀，平俊爱，等. 我国青贮玉米育种研究进展及发展趋势[J]. 山西农业科学，2010，38（2）：85-87，70.
[16]孟昭河，刘新军，王玉菊，等. 利用花粉管通道法将外源DNA导入水稻之研究进展[J]. 中国农学通报，2006，22（6）：52-56.
[17]李长缨，简元才. 花粉管通道法在植物遺传转化中的应用[J]. 生物学杂志，2000，17（1）：9-10.
[18]邓德旺，郭三堆，杨志民. 棉花花粉管通道法转基因的分子细胞学机理研究[J]. 云南大学学报（自然科学版），1999，21（6）：124-125.
[19]王永锋，栾雨时，高晓蓉. 花粉管通道法在植物转基因中的研究与应用[J]. 东北农业大学学报，2004，35（6）：764-768.
[20]彭慧娟，刘国华. 花粉管通道法在植物遗传转化中的研究与应用[J]. 作物研究，2005（增刊1）：317-321.
[21]刘源霞，兰进好，赵延明. 基因工程在玉米遗传育种中的应用[J]. 玉米科学，2007，15（增刊1）：146-149.
[22]祁永红. 花粉管通道法在玉米自交系改良中的应用[J]. 黑龙江农业科学，2006（3）：17-19.
[23]李向龙，张中保，张 春，等. 通过去除花丝确定玉米花粉管通道形成时间[J]. 江苏农业科学，2018，46（22）：80-82.
[24]张雅君，陈钦坚，孙 毅，等. 玉米花粉管伸长的时空进程[J]. 玉米科学，2015，23（4）：98-103.
[25]祁永红. 大豆DNA直接导入玉米自交系的研究[J]. 玉米科学，2000，8（1）：34-36.韩 丹，余文华，张 蓉，等. 贵州麻江分布小弧斑姬蛙的分子鉴定[J]. 江苏农业科学，2020，48（12）：145-150.
关键词：花粉管通道技术;高丹草;总DNA提取;饲草玉米;种质资源
草牧业是农业的重要组成部分，是一个国家农业现代化水平的重要标志。欧美发达国家畜牧产值的60%以上由饲草转化而来，美国饲料蛋白的50%以上来自饲草[1]。任继周院士指出，制约我国草业发展的瓶颈是品种问题。优良种质资源匮乏是制约我国饲草品种选育的重要因素之一。草料是草食牲畜的必需饲料组分，过量使用粮食饲养，不仅增加草食牲畜的养殖成本，而且会造成草食牲畜免疫力降低，增加发病机会。玉米是重要的粮食和饲料作物，2015年中央一号文件提出“粮改饲”工程，青贮玉米是工程推荐的首选草种。
利用花粉管通道转导外源DNA是我国科学家首创的植物转基因技术，1981年首次利用该技术培育出抗枯萎病的棉花新品种[2]。随后，众多科学家以不同植物为对象进行了大量研究，取得一批重要成果[3]。祁永红等将大豆DNA导入玉米自交系，获得具有广泛变异的不同类型[4]。张秀君等将含高赖氨酸蛋白质基因的cDNA导入玉米，使籽粒干物质中赖氨酸含量提高18.75%[5]。孙学辉等将高赖氨酸基因导入玉米自交系，获得种子中粗蛋白含量11.05%、赖氨酸含量提高16.00%的转化植株[6]。王丰等将稗草总DNA和玉米总DNA导入水稻，获得抗稻瘟病转化植株[7]。王罡等将Bt抗虫毒蛋白基因转导到玉米自交系，获得玉米抗虫育种优良抗源[8]。曹阳等研究获得抗虫转基因高粱[9]。侯文胜等成功将人工合成的雪花莲凝聚素基因sgna导入优良小麦品系[10]。乐锦华等将广谱抗真菌的菜豆基因与烟草基因导入棉花育成抗枯萎病、耐黄萎病的抗病新品系[11]。张茂银等将新疆大赖草DNA导入普通春小麦获得大穗、多粒、晚熟变异株[12]。邹冬生等将玉米DNA导入水稻，获得单穗总粒数、千粒质量显著增加的超质量类型[13]。李建粤等将大豆总DNA导入水稻，提高了稻米的蛋白质含量和总氨基酸、赖氨酸含量[14]。
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1 材料与方法
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试验草种为乐食高丹草，市售;自46玉米自交系由四川省农业科学院牧业研究中心提供。
1.2 试验方法
1.2.1 试验地概况 试验地位于四川省南充市顺庆区潆溪镇（106°12′E，31°06′N），海拔高度为 305 m，年日照时数为1 062 h;年均气温为17.6 ℃，极端最低温度为-2.8 ℃，极端最高温度为 42.1 ℃，10 ℃以上年积温为5 206.9 ℃，平均气温10 ℃以上的天数为232 d;无霜期为307 d;年降水量为1 060 mm。紫色土壤，0～20 cm耕作层土壤pH值为7.94，有机质含量为42.8 g/kg，含全氮 5.1 g/kg、硝态氮178.82 mg/kg、速效钾 163.66 mg/kg、有效磷 11.96 mg/kg。
1.2.2 植物基因组DNA提取 乐食高丹草种子用培养箱25 ℃催芽，剪取幼苗幼嫩茎叶，用天根生化科技（北京）有限公司的DP305型试剂盒提取基因组总DNA;核酸测定仪NanoDrop 2000测定浓度，内切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ20 ℃酶解8 h，用柠檬酸钠（SSC）缓冲液稀释至300 μg/mL，4 ℃保存备用。
1.2.3 外源DNA转导入玉米自交系 2014年4月9日，田间种植自46玉米自交系，穴播，行距 100 cm、株距40 cm，苗高15 cm时间苗，每穴留壮苗1株。开花前夕用硫酸纸袋分别套住雌花和雄花，避免田间自然传粉污染。每天观察开花进度，雌花盛开时人工收集花粉自交授粉，然后继续套袋保护。人工授粉15～24 h后，剪去距穗轴顶部1～2 cm 以上的苞叶和花丝，用移液器将乐食高丹草DNA溶液滴在花丝剪口处，每穗300 μL。继续套袋保护直至玉米成熟，单穗收种。
1.2.4 种植调查 转基因处理玉米单穗收种，翌年按穗行播种，同时播种未处理的自46自交系作对照，全生育期观察比较生长发育情况，发掘性状变异株。变异后代隔离种植，调查其生物学性状、农艺学性状及遗传分化情况。转化第1代只发现1株变异株，作单株调查;其他各代均分别测定5个单株计算算术平均值。叶长、叶宽测量自上而下第7张叶;株高、叶长、叶宽、穗位、穗长、穗围粗用卷尺测量;茎粗用游标卡尺在基部第2茎节“十”字方向测量2次;全株干物质含量测定在籽粒1/2乳线期收割（留茬高度为5 cm），105 ℃杀青30 min后65 ℃烘干测定。
1.2.5 数据处理 采用Excel 2007进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 乐食高丹草基因组DNA提取
经检测，所提取的DNA D260 nm/D280 nm值为 1.83，满足试验要求。
2.2 变异材料发掘
经种植观察，处理材料第1代和对照在种子出苗率、生长发育速度、株高、茎粗、株型、叶片大小、叶色、穗位等指标均未发现明显变异。在处理材料的08穗行发现1株变异（命名为46优），单株结实双穗，穗柄明显增长，穗柄长26 cm（图1）;籽粒變大，百粒质量增加，约为38 g，与对照相比增加约33.33%（表1）。
2.3 变异材料继代 3.4 研究成果的实践意义
本研究采用花粉管通道技术，突破种属限制，将同科异属的高丹草DNA转导入玉米自交系中，获得了株高增高、叶形变得细长、双穗性状突出、干物质含量提高的饲草玉米新种质，增加了饲草玉米育种的素材选择。植株形态的改变表明的确有外源基因整合到受体基因组中，引发了可稳定遗传的变异;双穗发育良好，增加了玉米籽粒在收获物种的比例，饲用品质提高。但研究还只是初步的，新材料的生理生化变异及转化基因的分子检测尚待深入进行，新材料的育种价值更需试验验证。本研究的重要实践意义不在于获得了1份突变新材料，更在于将花粉管通道转基因技术引入饲草育种研究中，为饲草种质资源创新增添了一条行之有效的新途径。
3.5 结论
饲草核心骨干种质资源匮乏及优良品种不足严重制约我国畜牧业的发展。对广大一线育种工作者而言，花粉管通道转基因技术是创新种质资源的一种有效手段，已在其他作物育种中广泛应用，取得可喜成绩，但在饲草育种上几乎还是空白。本研究成功将高丹草DNA转导到饲草玉米中，获得有益突变新材料，展现了花粉管通道转基因技术在饲草种质资源创新中的可行性，为创制出量多质优的饲草种质新资源提供参考。
参考文献：
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