探讨大鼠施万细胞与成纤维细胞(Fb)联合移植对大鼠失神经支配穿支皮瓣神经再生的影响及其机制。
方法(1)从2只孕14～16 d SD大鼠胚胎躯干分离培养Fb并观察细胞形态，取第3代细胞用于后续实验。免疫组织化学法观察细胞纤维粘连蛋白和Ephrin-B2蛋白的表达，实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ephrin-B2 mRNA的表达(样本数为3)。(2)从45只出生1～3 d SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经分离培养施万细胞并观察细胞形态，取第3代细胞用于后续实验。免疫荧光法及流式细胞仪检测S100阳性细胞率，样本数分别为9、3。(3)于DMEM高糖培养基中，取1×105个/mL Fb、施万细胞各1 mL共培养，设为施万细胞＋Fb共培养组；另取1×105个/mL施万细胞2 mL单独培养，设为施万细胞单独培养组。每组5孔细胞。培养6、24 h于倒置相差显微镜下观察2组施万细胞的成簇群情况并计数，另用免疫荧光法观察培养24 h时施万细胞＋Fb共培养组施万细胞的成簇群情况，蛋白质印迹法检测培养24 h时2组施万细胞EphB2、Sox2和N-钙黏蛋白的蛋白表达(样本数为20)。(4)取100只8周龄雄性SD大鼠，每只大鼠腹壁制成1个原位回植失神经支配穿支皮瓣，按随机数字表法分为单纯皮瓣组、Fb单独移植组、施万细胞单独移植组、施万细胞＋Fb共移植组，每组25只。Fb单独移植组、施万细胞单独移植组大鼠皮瓣分别注射0.4 mL Fb、施万细胞(均为2×106个)，施万细胞＋Fb共移植组大鼠皮瓣注射0.4 mL Fb与施万细胞混合细胞(共2×106个，细胞数量比为1∶1)，单纯皮瓣组大鼠皮瓣注射等体积的DMEM高糖培养基。注射后2、5、7、9、14 d，按随机数字表法每组分别取5只大鼠，取皮瓣组织，免疫荧光法观察再生神经数量、直径及排列。对数据行完全随机设计t检验、重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正。
结果(1)从大鼠胚胎躯干分离培养的第3代细胞大小、形态较均一，呈长梭形，细胞核所占比例较大；细胞内纤维粘连蛋白及Ephrin-B2蛋白呈强阳性表达，Ephrin-B2 mRNA的表达量为0.004 1±0.000 8。细胞鉴定为Fb。(2)从新生大鼠坐骨神经和臂丛神经分离的原代细胞培养5 d后可见胞体拉长，呈巢状、栅栏状或旋涡状生长；第3代细胞经免疫荧光法及流式细胞仪检测显示，S100阳性细胞率分别为(95.9±1.0)%和(95.8±1.1)%。细胞鉴定为施万细胞。(3)培养6、24 h，施万细胞＋Fb共培养组施万细胞成簇群数均明显高于施万细胞单独培养组(t＝6.500、10.614，P<0.01)。培养24 h，施万细胞＋Fb共培养组施万细胞聚集成簇群，Fb分散围绕在施万细胞簇群周围，施万细胞EphB2、N-钙黏蛋白和Sox2蛋白表达均明显高于施万细胞单独培养组(t＝2.975、19.717、11.159，P<0.05或P<0.01)。(4)注射后2 d，4组大鼠皮瓣组织内均见少量散在、排列较杂乱、较短而细的神经纤维。注射后5～14 d，施万细胞＋Fb共移植组大鼠皮瓣组织中神经纤维数量逐渐增多，且直径较粗大、排列有序；施万细胞单独移植组大鼠皮瓣组织内神经纤维数量有所增加，但直径细小、排列杂乱，数量较施万细胞＋Fb共移植组少；单纯皮瓣组和Fb单独移植组大鼠皮瓣组织内神经纤维逐渐发生溃变，数量逐渐减少甚至消失。
结论大鼠Fb与施万细胞联合移植可通过激活Ephrin/Eph-Sox2-N-钙黏蛋白信号通路调控施万细胞迁移使其聚集成簇群，从而促进大鼠失神经支配穿支皮瓣神经有序再生。