【摘 要】
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目的构建参与唇腭部发育的重要蛋白ESCRTⅢ的单分子检测体系。方法分析ESCRTⅢ蛋白的结构，选取不影响结构稳定和纤丝形成的氨基酸进行突变，体外提取突变蛋白检测蛋白的稳定性，吸收光谱检测突变蛋白荧光标记的效率，负染电镜观察突变蛋白形成纤丝的能力，负染电镜观察和离心沉淀分析突变体蛋白形成的纤丝被Vps4解聚的能力。结果选取了ESCRTⅢ蛋白Snf7上的5个位点，K57，G58，N59，G120和D1
【机 构】
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生物膜国家重点实验室 结构生物学高精尖创新中心 清华大学生命科学学院，北京 100084,结构生物学高精尖创新中心 清华大学生命科学学院，北京 100084,生物膜国家重点实验室 结构生物学高精尖创新
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目的构建参与唇腭部发育的重要蛋白ESCRTⅢ的单分子检测体系。
方法分析ESCRTⅢ蛋白的结构，选取不影响结构稳定和纤丝形成的氨基酸进行突变，体外提取突变蛋白检测蛋白的稳定性，吸收光谱检测突变蛋白荧光标记的效率，负染电镜观察突变蛋白形成纤丝的能力，负染电镜观察和离心沉淀分析突变体蛋白形成的纤丝被Vps4解聚的能力。
结果选取了ESCRTⅢ蛋白Snf7上的5个位点，K57，G58，N59，G120和D122，分别突变为半胱氨酸，其中K57C突变体蛋白不稳定聚沉，G58C突变体蛋白荧光标记效率低，N59C和G120C突变体蛋白影响纤丝形成，只有D122C突变体蛋白稳定，标记效率高，且标记后的蛋白能正常形成纤丝并被Vps4蛋白解聚。
结论筛选出了Snf7 D122C突变体适用于利用单分子技术检测ESCRTⅢ纤丝的解聚动态过程，从而为进一步在细胞水平和体内研究ESCRT系统对腭部发育的作用提供支持。
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