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摘要：【目的】明確除草活性菌株HZ-011的发酵培养基各因素配比及最适发酵条件，为该菌作为除草剂的研发和农田应用提供理论依据。【方法】以产孢量为目标，通过固体培养基筛选确定菌株HZ-011生长的基础培养基;采用单因素试验优化菌株HZ-011的发酵培养基和最佳发酵条件;利用中心组合设计（Central composite design，CCD）原理对菌株HZ-011的液体培养基成分及配比进行优化;通过响应面法分析培养基各成分间的交互作用;用菌株HZ-011发酵液对盆栽杂草（藜、密花香薷、冬葵和反枝苋）进行致病性试验。【结果】经过优化，菌株HZ-011的培养基最佳配比为蔗糖48.744 g/L、蛋白胨15.626 g/L、NaCl 0.214 g/L和K2HPO4 0.428 g/L，最佳发酵条件为pH 7、温度25 ℃、培养时间5 d、装液量180 mL和转速180 r/min。盆栽试验结果表明，菌株HZ-011对藜和反枝苋全部致死，对密花香薷的致病率为75%，对冬葵的致病率为40%。【结论】优化后的培养基提高了菌株HZ-011的产孢量，为该菌株应用于农田杂草生物防治打下基础。
关键词： 菌株HZ-011;除草活性;发酵条件;单因素;产孢量;响应面
中图分类号： S451.1;S476 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1931-11
Screening of fermentation medium for herbicidal active strain HZ-011 and optimization of its conditions
LIN Ze-rong1，2，3，4， ZHU Hai-xia2，3，4*
（1Qinghai University， Xining， 810016， China; 2Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Xining 810016， China; 3Xining Crop Pest Scientific Observation and Experiment Station of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xining 810016， China; 4Qinghai Provincial Key Laboratory of Comprehensive Management of
Agricultural Pests， Xining 810016， China）
Abstract：【Objective】Todetermine the ratio of various factors of the fermentation medium and the optimal fermentation conditions of strain HZ-011 that has herbicidal effect on weeds， andprovide theoretical basis for development of HZ-011 herbicide and application in farmland. 【Method】The basic medium for the growth of strain HZ-011 was selected by solid medium with the goal of spore production. Single factor experiment was used to optimize the fermentation medium and fermentation conditions of strain HZ-011. The liquid medium composition and ratio of strain HZ-011 were optimized by using the principle of central composite design （CCD）. The interaction between the components of the medium was analyzed by response surface methodology. The pathogenicity of potted weeds（Chenopodium album， Amaranthus retroflexus， Elsholtzia densa and Malva crispa） was tested with HZ-011 fermentation broth. 【Result】After optimization， the optimal proportion of culture medium of strain HZ-011 was sucrose 48.744 g/L， peptone 15.626 g/L， NaCl 0.214 g/L and K2HPO4 0.428 g/L. The optimum fermentation conditions were pH 7， temperature 25 ℃， culture time 5 days， liquid loa-ding 180 ml and rotating speed 180 r/min. The results of pot experiment showed that strain HZ-011 killed all C. album and A. retroflexus， and the pathogenicity of E. densa was 75%， then the pathogenic rate of winter sunflower was 40%. 【Conclusion】The optimized medium increased the spore production of strain HZ-011， which lays a foundation for the application of the strain in the biological control of farmland weeds. Key words： strain HZ-011; herbicidal activity; fermentation conditions; single factor; sporulation; response surface
Foundation item： Qinghai Applied Basic Research Project（2019-ZJ-7057）
0 引言
【研究意義】杂草是田间病虫害传播和寄居的主要介质，杂草增加了农田管理的劳动成本，并与作物争资源，是影响作物产量和品质的主要生物因素（陈世国和强胜，2015;李香菊，2018;周挺等，2020）。目前，农田以化学农药为主导的植物病虫草害防治带来的农药残留超标、病虫草抗药性增强及破坏生态平衡等问题逐渐加剧（Behnam et al.，2007;Ongena and Jacques，2008;Figueroa-López et al.，2016），而微生物防治杂草表现出的无污染、无公害、长效性、易人工培养和寄主专一等优势（霍沁建等，2007;林英等，2014;吴翔等，2019;朱海霞和马永强，2020），使得生防技术成为控制田间杂草的最佳选择（Che et al.，2018;Dong et al.，2018）。本课题组前期在自然感病的巴天酸模叶片中分离得到一株葡萄孢属（Botrytis）真菌HZ-011，在筛菌过程中发现其对藜、密花香薷、反枝苋和冬葵等有致病效果，因此，明确菌株HZ-011的最佳发酵培养基及最适发酵条件，可为菌株HZ-011应用于杂草的生物防治提供科学依据。【前人研究进展】前人在生物防治杂草方面取得了一些研究成果。霍达等（2017）在自然感病的小飞蓬叶片中分离到分枝杆菌属菌株XFP-9，该菌株发酵液对黑麦草（Lolium perenne L.）和欧洲菊苣（Cichorium intybus L.）种子萌发的抑制率均可达90%以上。晶雪（2017）研究发现，菌株AM-8和AM-17的发酵液对豚草幼苗具有明显的抑制效果，且菌株AM-17对繁缕幼苗的须根数产生明显的抑制作用。郭冉（2019）研究发现，具有除草活性的Ha1菌株发酵液与化学除草剂复配对杂草马唐、稗草和苘草有较好的防除效果。马永强和朱海霞（2019）发现菌株GD-9发酵液对野燕麦具有较好的致病效果，对野燕麦种子发芽的抑制率达90.1%。田媛媛（2019）研究发现，菌株NEAU-240的发酵液稀释100倍后对盆栽稗草、反枝苋和狗牙草的主根抑制率大于90%，对茎的抑制率大于30%。吴志美等（2019）采用单因素试验和正交试验对除草活性成团泛菌ZLSY20菌株进行发酵条件优化，在发酵时间24 h、培养温度32 ℃、pH 8、接菌量0.05%、通气量20 mL/250 mL、转速200 r/min的条件下菌株生长最好。杨莹等（2019）采用单因素试验和响应面法对出芽短梗霉菌PA-2菌株的液体培养基进行优化，在最佳发酵条件下提高了产孢量，并对杂草藜的鲜重防效达75.0%。梁玎玎（2020）研究发现，草茎点霉SYAU-06发酵制备水乳剂对盆栽3～4叶期的鸭拓草防效达51.38%，田间施药21 d后的鲜重防效达50.78%。张奇等（2020）从桉树根际土壤中筛选出一株能产生伶香豆酸、柠檬醛和胡椒碱化感物质结构类似物的真菌，使得该菌株发酵液具有很强的抑草效果。【本研究切入点】葡萄孢属菌株大多以病原物的形式危害作物，而用于生防除草的研究仅有少量报道。【拟解决的关键问题】以前期从自然感病的巴天酸模叶片中分离得到的具有除草活性的真菌菌株HZ-011为材料，以产孢量为目标，筛选菌株HZ-011的基础培养基，采用单因素试验和响应面试验优化菌株HZ-011的发酵培养基和最佳发酵条件，为该菌作为除草剂的研发和农田应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 供试菌种
菌株HZ-011从自然感病的巴天酸模中分离获得，经鉴定确定为葡萄孢属真菌，保存在青海省农林科学院植物保护研究所有害生物综合防治实验室。将实验室保存的菌株HZ-011接种到PDA培养基中，于25 ℃条件下培养5 d，用于试验。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 固体培养基筛选 从7种培养基（表1）中筛选菌株HZ-011生长的基础固体培养基。取活化的菌种打菌饼（Φ=8 mm），接种于各培养基中央，置于25 ℃的恒温培养箱中培养，培养2和4 d后测量菌落直径，并观察菌株HZ-011在7种培养基中的菌落形态，重复3次。选择菌落直径较大的培养基为固体基础培养基。
1. 2. 2 液体培养基筛选 取活化的菌种打菌饼（Φ=8 mm）接种于7种液体培养基中，每50 mL接1块菌饼，于25 ℃条件下170 r/min摇床培养，在发酵培养的第1、2、3、4、5、6和7 d分别测定产孢量，重复3次。选择产孢量较大的培养基为优化的基础培养基。
1. 2. 3 培养基优化单因素试验 将培养基中活化的菌饼接种于基础培养基培养液中（250 mL三角瓶），于25 ℃条件下170 r/min摇床培养7 d，采用分光光度法测定菌液在640 nm波长处的OD值，重复3次。培养基成分及水平见表2。
1. 2. 4 培养基成分及配比优化 根据中心组合设计原理，对主要因素碳源、氮源及无机盐的配比进行优化，以单因素试验结果为中心点，菌株HZ-011的OD值为响应值（Y），设计3因素3水平的响应面试验（表3）。
1. 2. 5 发酵条件优化试验 以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同初始发酵时间（1、2、3、4、5、6和7 d）、装液量（100、120、140、160、180、200和220 mL/瓶）、培养温度（15、20、25、30和35 ℃）、pH（5、6、7、8和9）和摇床转速（140、160、180、200和220 r/min）对菌株HZ-011 OD值的影响，每处理3次重复。 1. 3 菌株HZ-011对杂草的致病作用
将田间8～9叶期正常生长的藜、冬葵、密花香薷和反枝苋移栽至花盆（Φ=15 cm），于温室内培养。每盆接种25 mL浓度为1.0×105～1.0×107个/mL的菌株HZ-011发酵液，加入0.4%吐温20。接种后的杂草植株置于室温，用JBX-3.5离心式工业加湿器保持相对湿度为60%，12 h光暗交替培养。培养7 d后调查杂草发病程度，计算发病率。
1. 4 统计分析
采用Excel 2010、Design Expert 11和DPS 9.01对试验数据进行统计分析，运用新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2. 1 培养基优化结果
2. 1. 1 固体培养基筛选 由表4和图1可知，菌株HZ-011在PDA培养基、培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和察氏培养基中营养菌丝发达，产生黄色色素;在孟加拉红培养基和燕麦片培养基中气生菌丝发达，呈雪花状;在培养基Ⅲ中气生菌丝不发达，边缘整齐。
菌株HZ-011在7种培养基中的菌落直径大小见表5。培养2 d后，菌株HZ-011在PDA培养基中的菌落直径最大，为4.52 cm，其次为培养基Ⅰ和培养基Ⅲ，菌落直径分别为4.34和4.20 cm，三者间菌落直径差异不显著（P>0.05，下同）;孟加拉红培养基中的菌落直径最小，为2.00 cm，显著小于其他6种培养基中的菌落直径（P<0.05，下同）。培养4 d后，菌株HZ-011在培养基Ⅰ中的菌落直径最大，为7.52 cm，其次为培养基Ⅱ，菌落直径为7.24 cm，二者间菌落直径差异不显著;燕麦片培养基中的菌落直径最小，为3.42 cm，显著小于在PDA、培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅲ中的菌落直径。
2. 1. 2 液体培养基筛选 由表6可知，菌株HZ-011在培养基Ⅰ中培养第5 d时的产孢量最大，为45.40×106 个/mL，明显高于在其他培养基中的产孢量，因此，结合菌落的形态特征和直径大小，选择培养基Ⅰ为菌株HZ-011的产孢培养基。
2. 2 培养基优化单因素试验结果
2. 2. 1 蔗糖 由图2可知，随着蔗糖含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降，当蔗糖含量达50 g/L时的OD值最大，与其他蔗糖含量的OD值间差异显著，随后缓慢下降。因此，选择初始蔗糖添加量50 g/L为菌株HZ-011发酵的最适碳源量。
2. 2. 2 蛋白胨 由图3可知，随着蛋白胨含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降再缓慢上升，当蛋白胨含量达15 g/L时的OD值最大，与其他蛋白胨含量的OD值间差异显著。因此，选择初始蛋白胨添加量15 g/L为菌株HZ-011发酵的最适氮源量。
2. 2. 3 K2HPO4 由图4可知，随着K2HPO4含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后缓慢下降，当K2HPO4含量达0.4 g/L时OD值达最大，且与其他K2HPO4含量的OD值间差异显著。因此，菌株HZ-011发酵培养基的最佳K2HPO4含量为0.4 g/L。
2. 2. 4 NaCl 由图5可知，随着NaCl含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降，再上升后缓慢下降，当NaCl含量达0.2 g/L时OD值达最大，且与其他添加量的OD值间差异显著。因此，菌株HZ-011发酵培养基的最佳NaCl含量为0.2 g/L。
2. 3 中心组合试验优化结果
根据单因素试验结果，对菌株HZ-011的液体培养基条件，利用Design Expert 11的CCD设计原理进行3因素3水平试验设计，结果见表7。
以菌株HZ-011发酵培养基OD值（Y）為响应值，根据中心组合试验结果，对表7数据进行分析，得到OD值与蔗糖（A）、蛋白胨（B）和无机盐（C）的二次多项回归方程：Y=-4.8069+0.1498A+0.1950B+2.1420C-0.0006AB-0.0043AC+0.0225BC-0.0014A2-0.0057B2-1.7794C2。
对回归模型进行方差分析和可信度分析，结果见表8。模型的F=55.37，P<0.0001，说明该回归方程极显著（P<0.01，下同）;失拟项不显著，说明该模型模拟性较好;模型的复相关系数R2=0.9861，调整复相关系数R2=0.9683，预测复相关系数R2=0.8368，调整复相关系数与预测复相关系数的差值小于0.2，说明该模型具有较好的回归性;模型信噪比>4，表明该模型具有足够的信号响应设计。因此，该模型能对菌株HZ-011的OD值进行分析和预测。
模型数据显示，一次项A、B、C和交互项BC影响显著，二次项A2、B2、C2影响极显著，各因子的影响主次顺序为C>A>B>BC>AB>AC。
利用Design Expert 11制作试验因素间交互效应三维立体响应面和等高线图，在确定1个因素的情况下，观察其他2个因素对OD值的影响，结果如图6～图8所示。蔗糖含量、蛋白胨含量和无机盐含量三者交互作用响应面具有较好的对称性，均开口向下，且交互效应的等高线形状为圆形，说明三者存在交互作用。根据回归方程得到菌株HZ-011发酵培养基产孢量的培养基条件为： 蔗糖48.744 g/L，蛋白胨15.626 g/L，无机盐0.642 g/L（其中NaCl 0.214 g/L，K2HPO4 0.428 g/L），预测菌株HZ-011的OD值最大为0.952。
根据模型求出的培养基最优条件配比进行3次以上试验验证，菌株HZ-011的平均OD值为0.893。与预测值差异较小，原因可能是培养基在发酵过程中外界条件的影响或孢子数的变化引起转速、温度和含氧量发生变化所致，说明该模型可用于优化菌株HZ-011的培养基。 2. 4 培养基发酵条件优化结果
2. 4. 1 时间 由图9可知，菌株HZ-011的OD值随发酵时间的延长呈先上升后缓慢下降的变化趋势，在发酵第5 d时OD值达最大，且显著高于其他发酵时间的OD值。因此，菌株HZ-011在培养基上的最适发酵时间为5 d。
2. 4. 2 装液量 锥形瓶中装液量不同引起菌株HZ-011的OD值不同。由图10可知，菌株HZ-011的OD值随装液量的增加呈先下降后上升再下降的变化趋势，当装液量为180 mL时OD值达最大，且显著高于其他装液量的OD值。因此，选择180 mL为菌株HZ-011的最适装液量。
2. 4. 3 温度 由图11可看出，在发酵温度为15～25 ℃时，菌株HZ-011的OD值呈上升趋势，25 ℃时OD值达最大，发酵温度超过25 ℃后OD值快速下降。因此，选择25 ℃作为菌株HZ-011发酵的最佳温度。
2. 4. 4 pH 由图12可知，菌株HZ-011的OD值随pH的增大呈先上升后下降的变化趋势，当pH=7时OD值达最大，pH>7时OD值开始下降。因此，pH 7为菌株HZ-011发酵的最佳pH。
2. 4. 5 摇床转速 由图13可知，当摇床转速为140～180 r/min时菌株HZ-011的OD值呈上升趋势，在180 r/min时达最大值，当转速超过180 r/min后OD值缓慢下降。因此，选择180 r/min作为菌株HZ-011发酵的最佳摇床转速。
2. 5 菌株HZ-011对杂草的致病作用
对杂草接种优化后菌株HZ-011的发酵液，结果见表9。接种1 d后，藜叶片出现病斑，叶缘卷曲;反枝苋叶片萎蔫，叶缘干枯;冬葵从根部往上的叶片逐渐开始发黄;密花香薷有零星小病斑，无明显萎蔫现象。接种4 d后，藜有一半的叶片萎蔫并且枯死，发病率达51%;反枝苋接近2/3的叶片失绿呈现褐色，部分叶片枯死;冬葵25%的叶片变黄色;密花香薷35%的叶片叶缘干枯，叶片产生褐色斑点。接种7 d后，藜和反枝苋叶片全部死亡;密花香薷有75%的叶片枯死;冬葵只有40%的发病率，且症状为整片叶的一半发黄。
3 讨论
葡萄孢属真菌是很少见的生防除草菌，本研究中的葡萄孢属真菌HZ-011分离于自然感病的巴天酸模叶片。菌株HZ-011对青海省主要作物青稞、小麦、豌豆和油菜均无致病作用;优化后的菌株HZ-011发酵液对盆栽杂草藜和反枝苋可达到100%的致病效果;对密花香薷的致病率为75%;对冬葵的致病率为40%，是一株具有除草活性的菌株。
微生物除草剂是通过孢子侵入杂草气孔并破坏气孔组织从而发挥致病作用。而孢子是微生物发酵过程中的一个中间体，其质量、数量和发酵产量均受发酵条件和环境的綜合影响（许丽娟等，2008）。研究微生物发酵所需的培养基配方和发酵条件是提高产孢量的重要途径（苗莉云等，2013;李浩浩等，2018;周春元等，2019）。培养基成分对生物量的多少和粗提物的产量均有影响（刘宁等，2009）。通过培养基和发酵条件优化来提高孢子产量，可为工业化生产和应用生防菌剂提供保障（Sharifyazda and Karim，2017）。利用植物病原菌除草可减少农药的使用及对环境的污染。
碳源占微生物细胞干物质的51%，而氮源的主要功能是构成微生物细胞和含氮代谢产物，有些氮源物质可参与活性物质前体的合成，有些代谢产物可起到特殊的调节作用（刘宁等，2009）。氮源微生物发酵受多种生物和非生物因子的影响，发酵时间、装液量、初始pH、培养时间和培养温度等因素是发酵过程中极为关键的控制和检测参数，可直接影响菌体生长和产物合成（Liu et al.，2015;Zhao et al.，2016;Kot et al.，2017;蒋晶晶等，2019）。本研究发现蔗糖最有利于葡萄孢属真菌HZ-011产孢，葡萄糖也能促进产孢，与杜艳丽等（2019）的研究结果一致;蛋白胨作为氮源可提高菌株产孢量，与杨莹等（2019）的研究结果一致;无机氮源不利于孢子形成，与高智谋等（2009）的研究结果一致;K2HPO4和NaCl中的阴阳离子可调节细胞的渗透压，作为某些酶的辅助因子维持细胞功能（张艳等，2006），可间接促进代谢物的产生。
在发酵条件优化试验中，葡萄孢属真菌HZ-011在中性条件下生长最快，与尹艳楠等（2020）的研究结果相似。菌株HZ-011的最适发酵时间为5 d，比朱海霞等（2017）研究结果中多孢木霉HZ-31的发酵时间短，究其原因可能是菌株HZ-011的生长周期较多孢木霉HZ-31的短。菌株HZ-011在25 ℃条件下生长，产孢量最大，与李聪丽等（2017）的研究结果相似，在20～25 ℃下生长产孢量最大。本研究还发现，常温下当转速为180 r/min、装液量180 mL时，菌株HZ-011的产孢量最大。本研究仅以菌落直径和OD值为指标来反映菌株HZ-011的孢子量，具有一定的局限性，今后应进一步研究各因素对孢子萌发和菌核形成等的影响。对于菌株HZ-011的发酵工艺而言，最适的优化配方和条件是发酵的理论基础，但是否满足工业生产和田间杂草防除还需要大量的发酵数据来验证。
4 结论
菌株HZ-011的培养基最佳配比为蔗糖48.744 g/L、蛋白胨15.626 g/L、NaCl 0.214 g/L和K2HPO4 0.428 g/L;最佳发酵条件为pH 7、温度25 ℃、培养时间5 d、装液量180 mL和转速180 r/min。优化后的培养基提高了菌株HZ-011的产孢量，为该菌株应用于农田杂草生物防治打下基础。
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（責任编辑 麻小燕）
关键词： 菌株HZ-011;除草活性;发酵条件;单因素;产孢量;响应面
中图分类号： S451.1;S476 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1931-11
Screening of fermentation medium for herbicidal active strain HZ-011 and optimization of its conditions
LIN Ze-rong1，2，3，4， ZHU Hai-xia2，3，4*
（1Qinghai University， Xining， 810016， China; 2Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Xining 810016， China; 3Xining Crop Pest Scientific Observation and Experiment Station of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xining 810016， China; 4Qinghai Provincial Key Laboratory of Comprehensive Management of
Agricultural Pests， Xining 810016， China）
Abstract：【Objective】Todetermine the ratio of various factors of the fermentation medium and the optimal fermentation conditions of strain HZ-011 that has herbicidal effect on weeds， andprovide theoretical basis for development of HZ-011 herbicide and application in farmland. 【Method】The basic medium for the growth of strain HZ-011 was selected by solid medium with the goal of spore production. Single factor experiment was used to optimize the fermentation medium and fermentation conditions of strain HZ-011. The liquid medium composition and ratio of strain HZ-011 were optimized by using the principle of central composite design （CCD）. The interaction between the components of the medium was analyzed by response surface methodology. The pathogenicity of potted weeds（Chenopodium album， Amaranthus retroflexus， Elsholtzia densa and Malva crispa） was tested with HZ-011 fermentation broth. 【Result】After optimization， the optimal proportion of culture medium of strain HZ-011 was sucrose 48.744 g/L， peptone 15.626 g/L， NaCl 0.214 g/L and K2HPO4 0.428 g/L. The optimum fermentation conditions were pH 7， temperature 25 ℃， culture time 5 days， liquid loa-ding 180 ml and rotating speed 180 r/min. The results of pot experiment showed that strain HZ-011 killed all C. album and A. retroflexus， and the pathogenicity of E. densa was 75%， then the pathogenic rate of winter sunflower was 40%. 【Conclusion】The optimized medium increased the spore production of strain HZ-011， which lays a foundation for the application of the strain in the biological control of farmland weeds. Key words： strain HZ-011; herbicidal activity; fermentation conditions; single factor; sporulation; response surface
Foundation item： Qinghai Applied Basic Research Project（2019-ZJ-7057）
0 引言
【研究意義】杂草是田间病虫害传播和寄居的主要介质，杂草增加了农田管理的劳动成本，并与作物争资源，是影响作物产量和品质的主要生物因素（陈世国和强胜，2015;李香菊，2018;周挺等，2020）。目前，农田以化学农药为主导的植物病虫草害防治带来的农药残留超标、病虫草抗药性增强及破坏生态平衡等问题逐渐加剧（Behnam et al.，2007;Ongena and Jacques，2008;Figueroa-López et al.，2016），而微生物防治杂草表现出的无污染、无公害、长效性、易人工培养和寄主专一等优势（霍沁建等，2007;林英等，2014;吴翔等，2019;朱海霞和马永强，2020），使得生防技术成为控制田间杂草的最佳选择（Che et al.，2018;Dong et al.，2018）。本课题组前期在自然感病的巴天酸模叶片中分离得到一株葡萄孢属（Botrytis）真菌HZ-011，在筛菌过程中发现其对藜、密花香薷、反枝苋和冬葵等有致病效果，因此，明确菌株HZ-011的最佳发酵培养基及最适发酵条件，可为菌株HZ-011应用于杂草的生物防治提供科学依据。【前人研究进展】前人在生物防治杂草方面取得了一些研究成果。霍达等（2017）在自然感病的小飞蓬叶片中分离到分枝杆菌属菌株XFP-9，该菌株发酵液对黑麦草（Lolium perenne L.）和欧洲菊苣（Cichorium intybus L.）种子萌发的抑制率均可达90%以上。晶雪（2017）研究发现，菌株AM-8和AM-17的发酵液对豚草幼苗具有明显的抑制效果，且菌株AM-17对繁缕幼苗的须根数产生明显的抑制作用。郭冉（2019）研究发现，具有除草活性的Ha1菌株发酵液与化学除草剂复配对杂草马唐、稗草和苘草有较好的防除效果。马永强和朱海霞（2019）发现菌株GD-9发酵液对野燕麦具有较好的致病效果，对野燕麦种子发芽的抑制率达90.1%。田媛媛（2019）研究发现，菌株NEAU-240的发酵液稀释100倍后对盆栽稗草、反枝苋和狗牙草的主根抑制率大于90%，对茎的抑制率大于30%。吴志美等（2019）采用单因素试验和正交试验对除草活性成团泛菌ZLSY20菌株进行发酵条件优化，在发酵时间24 h、培养温度32 ℃、pH 8、接菌量0.05%、通气量20 mL/250 mL、转速200 r/min的条件下菌株生长最好。杨莹等（2019）采用单因素试验和响应面法对出芽短梗霉菌PA-2菌株的液体培养基进行优化，在最佳发酵条件下提高了产孢量，并对杂草藜的鲜重防效达75.0%。梁玎玎（2020）研究发现，草茎点霉SYAU-06发酵制备水乳剂对盆栽3～4叶期的鸭拓草防效达51.38%，田间施药21 d后的鲜重防效达50.78%。张奇等（2020）从桉树根际土壤中筛选出一株能产生伶香豆酸、柠檬醛和胡椒碱化感物质结构类似物的真菌，使得该菌株发酵液具有很强的抑草效果。【本研究切入点】葡萄孢属菌株大多以病原物的形式危害作物，而用于生防除草的研究仅有少量报道。【拟解决的关键问题】以前期从自然感病的巴天酸模叶片中分离得到的具有除草活性的真菌菌株HZ-011为材料，以产孢量为目标，筛选菌株HZ-011的基础培养基，采用单因素试验和响应面试验优化菌株HZ-011的发酵培养基和最佳发酵条件，为该菌作为除草剂的研发和农田应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 供试菌种
菌株HZ-011从自然感病的巴天酸模中分离获得，经鉴定确定为葡萄孢属真菌，保存在青海省农林科学院植物保护研究所有害生物综合防治实验室。将实验室保存的菌株HZ-011接种到PDA培养基中，于25 ℃条件下培养5 d，用于试验。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 固体培养基筛选 从7种培养基（表1）中筛选菌株HZ-011生长的基础固体培养基。取活化的菌种打菌饼（Φ=8 mm），接种于各培养基中央，置于25 ℃的恒温培养箱中培养，培养2和4 d后测量菌落直径，并观察菌株HZ-011在7种培养基中的菌落形态，重复3次。选择菌落直径较大的培养基为固体基础培养基。
1. 2. 2 液体培养基筛选 取活化的菌种打菌饼（Φ=8 mm）接种于7种液体培养基中，每50 mL接1块菌饼，于25 ℃条件下170 r/min摇床培养，在发酵培养的第1、2、3、4、5、6和7 d分别测定产孢量，重复3次。选择产孢量较大的培养基为优化的基础培养基。
1. 2. 3 培养基优化单因素试验 将培养基中活化的菌饼接种于基础培养基培养液中（250 mL三角瓶），于25 ℃条件下170 r/min摇床培养7 d，采用分光光度法测定菌液在640 nm波长处的OD值，重复3次。培养基成分及水平见表2。
1. 2. 4 培养基成分及配比优化 根据中心组合设计原理，对主要因素碳源、氮源及无机盐的配比进行优化，以单因素试验结果为中心点，菌株HZ-011的OD值为响应值（Y），设计3因素3水平的响应面试验（表3）。
1. 2. 5 发酵条件优化试验 以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同初始发酵时间（1、2、3、4、5、6和7 d）、装液量（100、120、140、160、180、200和220 mL/瓶）、培养温度（15、20、25、30和35 ℃）、pH（5、6、7、8和9）和摇床转速（140、160、180、200和220 r/min）对菌株HZ-011 OD值的影响，每处理3次重复。 1. 3 菌株HZ-011对杂草的致病作用
将田间8～9叶期正常生长的藜、冬葵、密花香薷和反枝苋移栽至花盆（Φ=15 cm），于温室内培养。每盆接种25 mL浓度为1.0×105～1.0×107个/mL的菌株HZ-011发酵液，加入0.4%吐温20。接种后的杂草植株置于室温，用JBX-3.5离心式工业加湿器保持相对湿度为60%，12 h光暗交替培养。培养7 d后调查杂草发病程度，计算发病率。
1. 4 统计分析
采用Excel 2010、Design Expert 11和DPS 9.01对试验数据进行统计分析，运用新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2. 1 培养基优化结果
2. 1. 1 固体培养基筛选 由表4和图1可知，菌株HZ-011在PDA培养基、培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和察氏培养基中营养菌丝发达，产生黄色色素;在孟加拉红培养基和燕麦片培养基中气生菌丝发达，呈雪花状;在培养基Ⅲ中气生菌丝不发达，边缘整齐。
菌株HZ-011在7种培养基中的菌落直径大小见表5。培养2 d后，菌株HZ-011在PDA培养基中的菌落直径最大，为4.52 cm，其次为培养基Ⅰ和培养基Ⅲ，菌落直径分别为4.34和4.20 cm，三者间菌落直径差异不显著（P>0.05，下同）;孟加拉红培养基中的菌落直径最小，为2.00 cm，显著小于其他6种培养基中的菌落直径（P<0.05，下同）。培养4 d后，菌株HZ-011在培养基Ⅰ中的菌落直径最大，为7.52 cm，其次为培养基Ⅱ，菌落直径为7.24 cm，二者间菌落直径差异不显著;燕麦片培养基中的菌落直径最小，为3.42 cm，显著小于在PDA、培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅲ中的菌落直径。
2. 1. 2 液体培养基筛选 由表6可知，菌株HZ-011在培养基Ⅰ中培养第5 d时的产孢量最大，为45.40×106 个/mL，明显高于在其他培养基中的产孢量，因此，结合菌落的形态特征和直径大小，选择培养基Ⅰ为菌株HZ-011的产孢培养基。
2. 2 培养基优化单因素试验结果
2. 2. 1 蔗糖 由图2可知，随着蔗糖含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降，当蔗糖含量达50 g/L时的OD值最大，与其他蔗糖含量的OD值间差异显著，随后缓慢下降。因此，选择初始蔗糖添加量50 g/L为菌株HZ-011发酵的最适碳源量。
2. 2. 2 蛋白胨 由图3可知，随着蛋白胨含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降再缓慢上升，当蛋白胨含量达15 g/L时的OD值最大，与其他蛋白胨含量的OD值间差异显著。因此，选择初始蛋白胨添加量15 g/L为菌株HZ-011发酵的最适氮源量。
2. 2. 3 K2HPO4 由图4可知，随着K2HPO4含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后缓慢下降，当K2HPO4含量达0.4 g/L时OD值达最大，且与其他K2HPO4含量的OD值间差异显著。因此，菌株HZ-011发酵培养基的最佳K2HPO4含量为0.4 g/L。
2. 2. 4 NaCl 由图5可知，随着NaCl含量的增加，菌株HZ-011的OD值先上升后下降，再上升后缓慢下降，当NaCl含量达0.2 g/L时OD值达最大，且与其他添加量的OD值间差异显著。因此，菌株HZ-011发酵培养基的最佳NaCl含量为0.2 g/L。
2. 3 中心组合试验优化结果
根据单因素试验结果，对菌株HZ-011的液体培养基条件，利用Design Expert 11的CCD设计原理进行3因素3水平试验设计，结果见表7。
以菌株HZ-011发酵培养基OD值（Y）為响应值，根据中心组合试验结果，对表7数据进行分析，得到OD值与蔗糖（A）、蛋白胨（B）和无机盐（C）的二次多项回归方程：Y=-4.8069+0.1498A+0.1950B+2.1420C-0.0006AB-0.0043AC+0.0225BC-0.0014A2-0.0057B2-1.7794C2。
对回归模型进行方差分析和可信度分析，结果见表8。模型的F=55.37，P<0.0001，说明该回归方程极显著（P<0.01，下同）;失拟项不显著，说明该模型模拟性较好;模型的复相关系数R2=0.9861，调整复相关系数R2=0.9683，预测复相关系数R2=0.8368，调整复相关系数与预测复相关系数的差值小于0.2，说明该模型具有较好的回归性;模型信噪比>4，表明该模型具有足够的信号响应设计。因此，该模型能对菌株HZ-011的OD值进行分析和预测。
模型数据显示，一次项A、B、C和交互项BC影响显著，二次项A2、B2、C2影响极显著，各因子的影响主次顺序为C>A>B>BC>AB>AC。
利用Design Expert 11制作试验因素间交互效应三维立体响应面和等高线图，在确定1个因素的情况下，观察其他2个因素对OD值的影响，结果如图6～图8所示。蔗糖含量、蛋白胨含量和无机盐含量三者交互作用响应面具有较好的对称性，均开口向下，且交互效应的等高线形状为圆形，说明三者存在交互作用。根据回归方程得到菌株HZ-011发酵培养基产孢量的培养基条件为： 蔗糖48.744 g/L，蛋白胨15.626 g/L，无机盐0.642 g/L（其中NaCl 0.214 g/L，K2HPO4 0.428 g/L），预测菌株HZ-011的OD值最大为0.952。
根据模型求出的培养基最优条件配比进行3次以上试验验证，菌株HZ-011的平均OD值为0.893。与预测值差异较小，原因可能是培养基在发酵过程中外界条件的影响或孢子数的变化引起转速、温度和含氧量发生变化所致，说明该模型可用于优化菌株HZ-011的培养基。 2. 4 培养基发酵条件优化结果
2. 4. 1 时间 由图9可知，菌株HZ-011的OD值随发酵时间的延长呈先上升后缓慢下降的变化趋势，在发酵第5 d时OD值达最大，且显著高于其他发酵时间的OD值。因此，菌株HZ-011在培养基上的最适发酵时间为5 d。
2. 4. 2 装液量 锥形瓶中装液量不同引起菌株HZ-011的OD值不同。由图10可知，菌株HZ-011的OD值随装液量的增加呈先下降后上升再下降的变化趋势，当装液量为180 mL时OD值达最大，且显著高于其他装液量的OD值。因此，选择180 mL为菌株HZ-011的最适装液量。
2. 4. 3 温度 由图11可看出，在发酵温度为15～25 ℃时，菌株HZ-011的OD值呈上升趋势，25 ℃时OD值达最大，发酵温度超过25 ℃后OD值快速下降。因此，选择25 ℃作为菌株HZ-011发酵的最佳温度。
2. 4. 4 pH 由图12可知，菌株HZ-011的OD值随pH的增大呈先上升后下降的变化趋势，当pH=7时OD值达最大，pH>7时OD值开始下降。因此，pH 7为菌株HZ-011发酵的最佳pH。
2. 4. 5 摇床转速 由图13可知，当摇床转速为140～180 r/min时菌株HZ-011的OD值呈上升趋势，在180 r/min时达最大值，当转速超过180 r/min后OD值缓慢下降。因此，选择180 r/min作为菌株HZ-011发酵的最佳摇床转速。
2. 5 菌株HZ-011对杂草的致病作用
对杂草接种优化后菌株HZ-011的发酵液，结果见表9。接种1 d后，藜叶片出现病斑，叶缘卷曲;反枝苋叶片萎蔫，叶缘干枯;冬葵从根部往上的叶片逐渐开始发黄;密花香薷有零星小病斑，无明显萎蔫现象。接种4 d后，藜有一半的叶片萎蔫并且枯死，发病率达51%;反枝苋接近2/3的叶片失绿呈现褐色，部分叶片枯死;冬葵25%的叶片变黄色;密花香薷35%的叶片叶缘干枯，叶片产生褐色斑点。接种7 d后，藜和反枝苋叶片全部死亡;密花香薷有75%的叶片枯死;冬葵只有40%的发病率，且症状为整片叶的一半发黄。
3 讨论
葡萄孢属真菌是很少见的生防除草菌，本研究中的葡萄孢属真菌HZ-011分离于自然感病的巴天酸模叶片。菌株HZ-011对青海省主要作物青稞、小麦、豌豆和油菜均无致病作用;优化后的菌株HZ-011发酵液对盆栽杂草藜和反枝苋可达到100%的致病效果;对密花香薷的致病率为75%;对冬葵的致病率为40%，是一株具有除草活性的菌株。
微生物除草剂是通过孢子侵入杂草气孔并破坏气孔组织从而发挥致病作用。而孢子是微生物发酵过程中的一个中间体，其质量、数量和发酵产量均受发酵条件和环境的綜合影响（许丽娟等，2008）。研究微生物发酵所需的培养基配方和发酵条件是提高产孢量的重要途径（苗莉云等，2013;李浩浩等，2018;周春元等，2019）。培养基成分对生物量的多少和粗提物的产量均有影响（刘宁等，2009）。通过培养基和发酵条件优化来提高孢子产量，可为工业化生产和应用生防菌剂提供保障（Sharifyazda and Karim，2017）。利用植物病原菌除草可减少农药的使用及对环境的污染。
碳源占微生物细胞干物质的51%，而氮源的主要功能是构成微生物细胞和含氮代谢产物，有些氮源物质可参与活性物质前体的合成，有些代谢产物可起到特殊的调节作用（刘宁等，2009）。氮源微生物发酵受多种生物和非生物因子的影响，发酵时间、装液量、初始pH、培养时间和培养温度等因素是发酵过程中极为关键的控制和检测参数，可直接影响菌体生长和产物合成（Liu et al.，2015;Zhao et al.，2016;Kot et al.，2017;蒋晶晶等，2019）。本研究发现蔗糖最有利于葡萄孢属真菌HZ-011产孢，葡萄糖也能促进产孢，与杜艳丽等（2019）的研究结果一致;蛋白胨作为氮源可提高菌株产孢量，与杨莹等（2019）的研究结果一致;无机氮源不利于孢子形成，与高智谋等（2009）的研究结果一致;K2HPO4和NaCl中的阴阳离子可调节细胞的渗透压，作为某些酶的辅助因子维持细胞功能（张艳等，2006），可间接促进代谢物的产生。
在发酵条件优化试验中，葡萄孢属真菌HZ-011在中性条件下生长最快，与尹艳楠等（2020）的研究结果相似。菌株HZ-011的最适发酵时间为5 d，比朱海霞等（2017）研究结果中多孢木霉HZ-31的发酵时间短，究其原因可能是菌株HZ-011的生长周期较多孢木霉HZ-31的短。菌株HZ-011在25 ℃条件下生长，产孢量最大，与李聪丽等（2017）的研究结果相似，在20～25 ℃下生长产孢量最大。本研究还发现，常温下当转速为180 r/min、装液量180 mL时，菌株HZ-011的产孢量最大。本研究仅以菌落直径和OD值为指标来反映菌株HZ-011的孢子量，具有一定的局限性，今后应进一步研究各因素对孢子萌发和菌核形成等的影响。对于菌株HZ-011的发酵工艺而言，最适的优化配方和条件是发酵的理论基础，但是否满足工业生产和田间杂草防除还需要大量的发酵数据来验证。
4 结论
菌株HZ-011的培养基最佳配比为蔗糖48.744 g/L、蛋白胨15.626 g/L、NaCl 0.214 g/L和K2HPO4 0.428 g/L;最佳发酵条件为pH 7、温度25 ℃、培养时间5 d、装液量180 mL和转速180 r/min。优化后的培养基提高了菌株HZ-011的产孢量，为该菌株应用于农田杂草生物防治打下基础。
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（責任编辑 麻小燕）