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[摘要]目的 建立母液中3-甲基黄嘌呤含量的测定方法。 方法 采用高效液相色谱法，分析柱为C18色谱柱，进行等度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长：273 nm，柱温为35℃。 结果 3-甲基黄嘌呤浓度在100～800mg/L范围内呈良好线形关系，实验有较好的精密度，其RSD为0.21%。平均回收率为98.38%，RSD为0.29%。 结论 该检测方法操作性强、灵敏度高、准确、重复性好，可用于生产母液中3-甲基黄嘌呤的含量测定。
[关键词]高效液相色谱法；3-甲基黄嘌呤
[中图分类号] R917 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）07-110-03
Determination of 3-methyl xanthine by High Perfoumance Liquid Chromatography
LIU Hui1 SHI Lei2 WANG Lin2
1. CSPC Innovation Pharmaceutical Co.，Ltd.， Luancheng 051430， China； 2. Department of Pharmaceutical Engineering， Hebei Chemical and Pharmaceutical College， Shijiazhuang 050026， China
[Abstract] Objective To establish an HPLC method for determine of 3- methyl xanthine in mother liquor. Methods The chromatographic analysis was carried out using a Merck RP-18 colum at 35℃， The mobile phase was 5g/L potassium dihydrogen phosphate solution- methanol （80∶20， V/V）， at a flow rate of 1.0mL/min and UV detection at 273 nm. Results The line arrange was 100-800 mg/L， The precision is good with RSD of 0.21%.The average recovery of 3- methyl xanthine was 99.38% and RSD was 0.29%. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible.
[Key words] High performance liquied chromatography； 3- methyl xanthine
3-甲基黄嘌呤（3- methylxanthine；结构式见图1）属于嘌呤类化合物，在医药工业中是合成嘌呤类衍生物的重要医药中间体，如MRS 1754和DMPTX[1-3]，已酮可可碱（舒安灵）[4]，也可通过其钠盐的甲基化生产可可碱[5]、咖啡因等黄嘌呤系列产品；同时3-甲基黄嘌呤作为一种母核，在其他领域也有着较为广泛的应用[6-7]。
目前，全球可可碱的市场需求量约1000吨/年，主要由印度和中国生产，通过3-甲基黄嘌呤甲基化生产可可碱[8]，是国内外化学合成方法生产可可碱的主要方式，因此作为主原料的3-甲基黄嘌呤的成本就决定了可可碱的成本。检测母液中3-甲基黄嘌呤含量并建立回收方法可以降低企业生产成本，减轻环保压力。
图1 3-甲基黄嘌呤
企业在化学合成生产3-甲基黄嘌呤过程中会产生大量3-甲基黄嘌呤母液，母液中含有较多色素，同时由于与3-甲基黄嘌呤结构相似、极性相近的杂质共存于母液中，不易分离，不能使用滴定法和紫外分光光度法进行定量分析。参阅文献[9-13]，本分析方法采用液相法（外标法），利用反相色谱柱可以快速、准确测定母液中3-甲基黄嘌呤的含量。
目前，对于从生产母液中检测3-甲基黄嘌呤的分析方法尚未见到相关报道，故该方法具有一定创新性。
1 实验部分
1.1 试样与试剂
3-甲基黄嘌呤对照品（石药集团新诺威提供，纯度99%）；甲醇（天津四友精细化学品公司，色谱级）；氢氧化钠（北京化工厂，分析纯），其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与色谱条件
高效液相色谱仪（安捷伦1200系列，包括G1314型单元泵、VWD型可变波长检测器、7725i型手动进样器、安捷伦1200系列工作站，美国安捷伦公司）；柱温箱（CBL Model 100型柱温箱，美国Photoelectron Technology公司）。
色谱柱：Agilent extend RP-C18（4.6×250 mm，5μm）；柱箱温度：35℃；流动相：4.5g/L；磷酸二氢钾水溶液-甲醇 = 80∶20；检验波长：273nm；进样量：20?L。
1.3 对照溶液制备
精密称量3-甲基黄嘌呤对照品50mg至100mL容量瓶中，并用0.2mol/L的氢氧化钠溶液5mL溶解，然后用纯化水定容至标准刻度，可以得到浓度约为500mg/L的3-甲基黄嘌呤对照液。
1.4 样品处理
由于3-甲基黄嘌呤在碱性条件下，水溶性增加，而在酸性条件下在水中溶解度降低。所以量取一定量的3-甲基黄嘌呤母液，调节母液的pH值在8.0～8.5之间，用纯化水稀释相应倍数并经 0.45μm膜滤过后备用。另外，在该pH条件下 做3-甲基黄嘌呤稳定性实验，室温放置48h后观察检测，其质量浓度和色谱纯度没有明显变化，证明3-甲基黄嘌呤母液在该条件下稳定并符合实验要求。 2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
本实验选用4.5g/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇作流动相，以4.5g/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇按80︰20，60︰40，50︰50比例混合后进行实验。发现当4.5g/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇 =为80︰20时，3-甲基黄嘌呤的分离效果理想，保留时间在10min内。
2.2 标准曲线
准确称取3-甲基黄嘌呤对照品100mg，置于100mL容量瓶中，用少量0.2mol/L的氢氧化钠溶液溶解并纯化水定容，摇匀。精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mL于10mL容量瓶中，纯化水稀释定容，各取20μL进样测定，记录色谱图。以溶液质量浓度（c）对峰面积（y）绘制标准曲线，得回归方程：y=2.0228×104c+1.411 2，r=0.999 1，3-甲基黄嘌呤在100～800mg/L内线性关系良好。
2.3 精密度实验
取1.3项下对照品溶液，每次20μL，分别重复进样6次，测得6个峰面积，其RSD值为 0.21%。
2.4 稳定性实验
取相同批号的待测样品，每1h 取样1次，每次进样20 μL，共取样8次，记录色谱图，其RDS 值为1.11%。说明待测样品在8 h内稳定。
2.5 回收率实验
精密量取同批样品各5份（已知浓度）分别置于25mL容量瓶中，各个加入1250mg/L对照品液1、2、4、6、8mL，稀释定容并检测，计算平均回收率为99.52%，RSD值为0.79%。
2.6 样品测定
按照样品欲处理要求进行处理后，分别吸取对照液、样品溶液各20μL进样测定，3 批样品的含量结果分别为 3120、3070、3150mg/L，其RSD 分别为 0.27%、0.31%、0.28%。
3 结论
本文基本建立了采用高效液相色谱法来测定生产母液中3-甲基黄嘌呤的含量，待测样品液虽呈弱碱性，但基本在pH 8.5以下，属于可控范围，不影响检测结果，由此可知样品只需简单用0.45?m膜过滤后即可测定。但由于生产母液中杂质含量较高，较大量进样后容易造成柱压增高，同时考虑流动相中的盐溶液对色谱柱的影响，故采用流动相—20%甲醇—60%甲醇—100%甲醇清洗色谱柱效果较好。
经过以上实验，可知该检测方法线性关系较好， 利用本方法测定样品中3-甲基黄嘌呤的含量，该检测方法具有较快速、简捷、灵敏度高、重复性好，适用于在3-甲基黄嘌呤生产及母液回收过程中含量的测定，具有一定的工业化参考价值。
[参考文献]
[1] Maria Carmen Balo，Jose Brea.Synthesis and pharma-cological evaluation of novel 1- and 8-substituted-3-fu-ruryl xanthines as adenosine receptor antagonists[J].Med Chem，2009，17：6755-6760.
[2] Ma Dong.Synthesis of 8-substituted xanthines via 5，6-diaminouracils：An efficient route to A2Aadenosine re-ceptor antagonists[J].Tetrahedron Letters，2008，49：4633-4635.
[3] Maria Isabel Nieto.Synthesis of novel 1-alkyl-8-substi-tuted-3-（3-methoxypropyl） xanthines as putative A2Areceptor antagonists[J].Med Chem，2009，17：3426-3432.
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[4] 宋丽华，谢业兴.己酮可可碱的合成工艺改进[J].山东医药工业，2011，20（5）：4.
[5] 李兴泰，舒瑞友，丰宇胜.可可碱生产方法[P].中国专利，CN101896484A，2010-11-24.
[6] 刘晖，刘琨，赵会娟.一种3-甲基-7-丙基黄嘌呤的制备方法[P].中国专利，CN102718764A，2012-10-10.
[7] 舒瑞友.丙戊茶碱的合成[J].齐鲁药事，2004，23（4）：48-50.
[8] 李兴泰，舒瑞友，丰宇胜.3-甲基黄嘌呤二钠盐甲化制备可可碱的新方法[P].中国专利，CN101220032，2008-07-06.
[9] 王靖宇，姚尧，张颖，等.简化RP-HPLC法同时测定茶碱和可可碱的含量[J].化学世界，2010，51（1）：12-15.
（收稿日期：2014-01-02）
[关键词]高效液相色谱法；3-甲基黄嘌呤
[中图分类号] R917 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）07-110-03
Determination of 3-methyl xanthine by High Perfoumance Liquid Chromatography
LIU Hui1 SHI Lei2 WANG Lin2
1. CSPC Innovation Pharmaceutical Co.，Ltd.， Luancheng 051430， China； 2. Department of Pharmaceutical Engineering， Hebei Chemical and Pharmaceutical College， Shijiazhuang 050026， China
[Abstract] Objective To establish an HPLC method for determine of 3- methyl xanthine in mother liquor. Methods The chromatographic analysis was carried out using a Merck RP-18 colum at 35℃， The mobile phase was 5g/L potassium dihydrogen phosphate solution- methanol （80∶20， V/V）， at a flow rate of 1.0mL/min and UV detection at 273 nm. Results The line arrange was 100-800 mg/L， The precision is good with RSD of 0.21%.The average recovery of 3- methyl xanthine was 99.38% and RSD was 0.29%. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible.
[Key words] High performance liquied chromatography； 3- methyl xanthine
3-甲基黄嘌呤（3- methylxanthine；结构式见图1）属于嘌呤类化合物，在医药工业中是合成嘌呤类衍生物的重要医药中间体，如MRS 1754和DMPTX[1-3]，已酮可可碱（舒安灵）[4]，也可通过其钠盐的甲基化生产可可碱[5]、咖啡因等黄嘌呤系列产品；同时3-甲基黄嘌呤作为一种母核，在其他领域也有着较为广泛的应用[6-7]。
目前，全球可可碱的市场需求量约1000吨/年，主要由印度和中国生产，通过3-甲基黄嘌呤甲基化生产可可碱[8]，是国内外化学合成方法生产可可碱的主要方式，因此作为主原料的3-甲基黄嘌呤的成本就决定了可可碱的成本。检测母液中3-甲基黄嘌呤含量并建立回收方法可以降低企业生产成本，减轻环保压力。
图1 3-甲基黄嘌呤
企业在化学合成生产3-甲基黄嘌呤过程中会产生大量3-甲基黄嘌呤母液，母液中含有较多色素，同时由于与3-甲基黄嘌呤结构相似、极性相近的杂质共存于母液中，不易分离，不能使用滴定法和紫外分光光度法进行定量分析。参阅文献[9-13]，本分析方法采用液相法（外标法），利用反相色谱柱可以快速、准确测定母液中3-甲基黄嘌呤的含量。
目前，对于从生产母液中检测3-甲基黄嘌呤的分析方法尚未见到相关报道，故该方法具有一定创新性。
1 实验部分
1.1 试样与试剂
3-甲基黄嘌呤对照品（石药集团新诺威提供，纯度99%）；甲醇（天津四友精细化学品公司，色谱级）；氢氧化钠（北京化工厂，分析纯），其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与色谱条件
高效液相色谱仪（安捷伦1200系列，包括G1314型单元泵、VWD型可变波长检测器、7725i型手动进样器、安捷伦1200系列工作站，美国安捷伦公司）；柱温箱（CBL Model 100型柱温箱，美国Photoelectron Technology公司）。
色谱柱：Agilent extend RP-C18（4.6×250 mm，5μm）；柱箱温度：35℃；流动相：4.5g/L；磷酸二氢钾水溶液-甲醇 = 80∶20；检验波长：273nm；进样量：20?L。
1.3 对照溶液制备
精密称量3-甲基黄嘌呤对照品50mg至100mL容量瓶中，并用0.2mol/L的氢氧化钠溶液5mL溶解，然后用纯化水定容至标准刻度，可以得到浓度约为500mg/L的3-甲基黄嘌呤对照液。
1.4 样品处理
由于3-甲基黄嘌呤在碱性条件下，水溶性增加，而在酸性条件下在水中溶解度降低。所以量取一定量的3-甲基黄嘌呤母液，调节母液的pH值在8.0～8.5之间，用纯化水稀释相应倍数并经 0.45μm膜滤过后备用。另外，在该pH条件下 做3-甲基黄嘌呤稳定性实验，室温放置48h后观察检测，其质量浓度和色谱纯度没有明显变化，证明3-甲基黄嘌呤母液在该条件下稳定并符合实验要求。 2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
本实验选用4.5g/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇作流动相，以4.5g/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇按80︰20，60︰40，50︰50比例混合后进行实验。发现当4.5g/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇 =为80︰20时，3-甲基黄嘌呤的分离效果理想，保留时间在10min内。
2.2 标准曲线
准确称取3-甲基黄嘌呤对照品100mg，置于100mL容量瓶中，用少量0.2mol/L的氢氧化钠溶液溶解并纯化水定容，摇匀。精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mL于10mL容量瓶中，纯化水稀释定容，各取20μL进样测定，记录色谱图。以溶液质量浓度（c）对峰面积（y）绘制标准曲线，得回归方程：y=2.0228×104c+1.411 2，r=0.999 1，3-甲基黄嘌呤在100～800mg/L内线性关系良好。
2.3 精密度实验
取1.3项下对照品溶液，每次20μL，分别重复进样6次，测得6个峰面积，其RSD值为 0.21%。
2.4 稳定性实验
取相同批号的待测样品，每1h 取样1次，每次进样20 μL，共取样8次，记录色谱图，其RDS 值为1.11%。说明待测样品在8 h内稳定。
2.5 回收率实验
精密量取同批样品各5份（已知浓度）分别置于25mL容量瓶中，各个加入1250mg/L对照品液1、2、4、6、8mL，稀释定容并检测，计算平均回收率为99.52%，RSD值为0.79%。
2.6 样品测定
按照样品欲处理要求进行处理后，分别吸取对照液、样品溶液各20μL进样测定，3 批样品的含量结果分别为 3120、3070、3150mg/L，其RSD 分别为 0.27%、0.31%、0.28%。
3 结论
本文基本建立了采用高效液相色谱法来测定生产母液中3-甲基黄嘌呤的含量，待测样品液虽呈弱碱性，但基本在pH 8.5以下，属于可控范围，不影响检测结果，由此可知样品只需简单用0.45?m膜过滤后即可测定。但由于生产母液中杂质含量较高，较大量进样后容易造成柱压增高，同时考虑流动相中的盐溶液对色谱柱的影响，故采用流动相—20%甲醇—60%甲醇—100%甲醇清洗色谱柱效果较好。
经过以上实验，可知该检测方法线性关系较好， 利用本方法测定样品中3-甲基黄嘌呤的含量，该检测方法具有较快速、简捷、灵敏度高、重复性好，适用于在3-甲基黄嘌呤生产及母液回收过程中含量的测定，具有一定的工业化参考价值。
[参考文献]
[1] Maria Carmen Balo，Jose Brea.Synthesis and pharma-cological evaluation of novel 1- and 8-substituted-3-fu-ruryl xanthines as adenosine receptor antagonists[J].Med Chem，2009，17：6755-6760.
[2] Ma Dong.Synthesis of 8-substituted xanthines via 5，6-diaminouracils：An efficient route to A2Aadenosine re-ceptor antagonists[J].Tetrahedron Letters，2008，49：4633-4635.
[3] Maria Isabel Nieto.Synthesis of novel 1-alkyl-8-substi-tuted-3-（3-methoxypropyl） xanthines as putative A2Areceptor antagonists[J].Med Chem，2009，17：3426-3432.
（下转第页）
（上接第页）
[4] 宋丽华，谢业兴.己酮可可碱的合成工艺改进[J].山东医药工业，2011，20（5）：4.
[5] 李兴泰，舒瑞友，丰宇胜.可可碱生产方法[P].中国专利，CN101896484A，2010-11-24.
[6] 刘晖，刘琨，赵会娟.一种3-甲基-7-丙基黄嘌呤的制备方法[P].中国专利，CN102718764A，2012-10-10.
[7] 舒瑞友.丙戊茶碱的合成[J].齐鲁药事，2004，23（4）：48-50.
[8] 李兴泰，舒瑞友，丰宇胜.3-甲基黄嘌呤二钠盐甲化制备可可碱的新方法[P].中国专利，CN101220032，2008-07-06.
[9] 王靖宇，姚尧，张颖，等.简化RP-HPLC法同时测定茶碱和可可碱的含量[J].化学世界，2010，51（1）：12-15.
（收稿日期：2014-01-02）