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摘 要：目的：分析亲权二联体亲子鉴定中 STR 出现一步突变基因座的原因。方法：应用多重 PCR 扩增技术及毛细管电泳技术进行基因座分型，进行DNA 检测分析。结果：常染色体 STR 检测结果中 D6S1043 基因座存在对样一步突变，其他 STR 基因座均符合遗传规律。结论：亲权鉴定时发现基因座出现一步突变，必须增加 STR 位点检测，计算累计亲权指数， 正确判断亲权关系。
关键词：亲权鉴定;短串联重复序列;突变
短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR） 是人类的重要的遗传标记之一。在法医学亲子鉴定及遗传病学分析中具有有重要作用[1]。STR 基因座突变的现象是亲子鉴定中普遍存在的，突变的要机制与复制滑动突变密切相关。
所謂一步突变是指只涉及一个基序的加或减称为一步突变，约占 STR 基因座的 90%，约有10%的个体涉及多个序列突变，称多步突变 [3]。最多突变步数为四步。STR 核心序列的变异可能导致亲子鉴定的误判 [4]。因此法医物证人员，尤其关注 STR 基因座突变。现对 1 例出现一步基因座突变的亲子鉴定案件进行分析，报告如下。
1 仪器、试剂及方法
1.1仪器及试剂
1.1.1 GeneAmp 9700 热循环仪、3500xl 型遗传分析仪（美国应用生物系统公司）。
1.1.2试剂：21Plex 系统荧光标记检测试剂盒（ 2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA 聚合酶、 PCR Grade Water、Orange-500 。江苏苏博医学科技南京有限公司）。AGCU EX 21+1 荧光检测试剂盒 （ ReactionMix、Primers、Taq 酶、Allelic Ladder、 AGCU MarkerSIZ-500;无锡中德美联生物技 术有限公司）;X-STR 系统荧光标记检测试 剂盒（包括 5×PCR 反应缓冲液Ⅳ、5×17X 引物混合 物、去离子水、ORG-500;基点认知技术（北京） 有限公司）。
1.1.3标本：选择直径 1 cm 大小血斑一份，常温晾干后存储于 -20 ℃冰箱。
1.2方法： PCR 扩增和电泳分型：PCR 扩增体系和扩增程序依据各试剂盒说明书严格操作，PCR 扩增采用血斑直接扩增。扩增阳性和阴性对照方法如下：每次扩增以阳性对照 DNA作阳性对照，阴性对照扩增管中加入纯水。扩增产物应用 ABI3500xl 型遗传分析仪进行毛细管电泳，由Data Collection v3.0 数据收集软件收集电泳数据信息，电泳完成后把生成的数据导入 GeneMapper ID-X v1.5 软件中分析查看各基因座的基因型。
1.3 统计学分析： 根据中国汉族人群 STR 基因座的等位基因频率，根据规范推荐突变率，μ 为平均突变率 0.002，进行亲权指数、累积亲权指数的计算。所有操作均按照法医物证鉴定 X-STR 检验规范》、《 亲权鉴定技术规范书》执行。
2 结果
2.1 常染色体 STR 基因座分型结果
亲子鉴定案件运用 21Plex 系统检测 21 个基因座 分型结果是否符合遗传规律。在该例亲子鉴定的案 件中，发现存在一步突变的可能，涉及的 STR 基因座 为 D6S1043，其余 20 个基因座的检测结果全部符合遗 传规律（图 1）。
父亲 D6S1043 基因型为11，20”，孩子 D6S1043 基因型为“19，21”，孩子位点“21”与父亲 位点“20”相差一个重复单位考虑有一步突变的可能。D3S1358等20个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父排除概率大于0.9999。综上检验结果分析，除D6S1043基因座外，父亲均能提供给孩子必需的等位基因。在D6S1043基因座，孩子的基因型为“19，21”父亲的基因型为“11，20”，父亲不能提供给孩子必需的等位基因“19，21”，不符合遗传规律。按照GB/T 37223-2018《亲权鉴定技术规范》中不符合遗传规律情形时亲权指数的计算方法，D6S1043基因座的亲权指数为0.0396。综上20个STR基因座的累积亲权指数为19872.9500。
2.2 新增基因座分型结果
采用 AGCU EX21+1 试剂盒进一步检测，包含 21 个 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 检测系 统中也包含， 采用 AGCU EX21+1 试剂盒进一步检测，包含 21 个 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 检测系 统中也包含， D6S474等21个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父排除概率大于0.9999。父亲F在D6S474，D12ATA63和D1S1677等基因座不能提供给孩子必需的等位基因（图 2）。经计算，累积亲权指数为9.9965×10-20（注：小于0.0001）。
2.3 应用 GoldeneyeTM DNA 身份鉴定系统 17X 试剂盒，这 16 个 X-STR 基因座在女性群体的累积个人识别率为 0.999 999 999 999 992，在男性群体的累积个人识别率为 0.999 999 996 577 712，在三联体中的累积非父排除率为 0.999 999 971，在二联体中的累积非父排除率为 0.999 992 574。 这 16 个X-STR 基因座达到了法医物证学应用要求，尤其对特殊的亲权鉴定案件具有重要的应用价值。X-STR 基因座上的分型结果： 本案例又增加检测了17 个 X-STR 基因座，被 检标本 C 与被检标本 F 的X-STR 基因座大部分不一致，结果如表 1 所示。 2.4依据人类染色体遗传规律，孩子的遗传基因一 定来自亲生父母双方 [2]。综上检验结果分析，D3S1358等40个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父排除概率大于0.9999。综上检验结果分析，父亲F在D6S1043，D6S474和D12ATA63等基因座不能提供给孩子必需的等位基因。经计算，累积亲权指数为5.2314×10-19（注：小于0.0001）。40个常染色体STR基因座分型后 CPI 值为5.2314×10-19（注：小于0.0001）。案例突变 基因座位点和 PI 计算结果见表 2。
3讨论：所谓的突变均是建立于在认定亲权关系的假设 上。STR 基因座突变与遗传多态性程度有着一定的 关系，其主要机制为复制滑动。复制滑动突变主要表 现为 STR 基因座等位基因重复单位的增加或减少 [3]。 序列结构比较均一的基因座容易发生突变，而等位基 因中含有不完全序列的基因座发生突变的概率较低，扩增片段较大的 STR 基因座更容易发生突变，这可 能是由于重复单位多的基因座其长度也较长，必然多 态性程度也较高，其突变概率会随之增加 [4]。
司法鉴定技术规范要求累计亲权指数大于 10 000 时，支持被检测男子（或被检测女子）是孩子 生物学父亲（或母亲），累计亲权指数小于 0.000 1 支持被检测男子（或被检测女子）不是孩子生物学父亲 （或母亲）。如果只有 1～2 个基因座不符合遗传规律，累计亲权指数在 0.000 1～10 000 之间应增加检测 其他高度多态性且遗传稳定的 STR 基因座，以避免 由于 STR 基因座突变导致错误地排除亲权关系。 该二联体案例首先用 21Plex 体系检测 20 个常染色体STR，出现一个矛盾基因座 D6S1043 ，父亲F为（19，21）， 孩子 C 为（11，20），相差 一个重复单位，累计亲权指数 19872.9500。考虑到是父女鉴定，使 用 X-STR 试剂盒进一步扩增检测，被检样本 F 与样 本C的 X-STR 基因型不相同，说明二人不符合同一母系 遗传规律。因为 X-STR 基因座具有伴性遗传的特征，女性在X-STR基因座具有两个等位基因，一个来自于父亲，一个来自于母亲;男性在X-STR基因座仅具有一个等位基因，且来自于母亲 ， 不同基因座中存在连锁的可能。本案例虽然检测了 17个 X -STR 基因座，但是部分基因座之间存在连锁 不平衡，鉴于不同的群体中连锁状态不相同，群体遗 传学数据有限，检测结果只是作为参考，未计算亲权 指数。 STR 基因座等位基因的突变与性别也有着一定 的相关性。研究发现，来源于父亲的突变多于来源于 母亲的突变。基因的突变率与细胞分裂次数密切相关。由于男性精原细胞在发育成为精子前要经过 多次分离，且分裂次数远远多于女性卵原细胞分裂的 次数，因而 DNA 复制发生滑动错配的机会就增多，突 变概率相应增加。除此之外，年龄等因素的影响也会 导致男性 DNA 突变率高于女性 [4]。
总之，常染色体20个STR基因座 检测结果中 D6S1043 基因座存在一步突变，其他 STR 基因座均符合遗传规律，虽然累计亲权指数大于 10 000 时，支持被检测男子（或被检测女子）是孩子 生物学父亲（或母亲），如果只有 1～2 个基因座不符合遗传规 律，累计亲权指数大于 10 000 时，应增加其他高度多态性且遗传稳定的 STR 基因座的检测，以避免 由于 STR 基因座突变导致错误地排除亲权关系。必须增加 STR 位点检测，计算累计亲权指数， 正确判断亲权关系。
参考文献
[1] He G， Gao B， Guo J， et al. Genetic diversity and forensic characteristics of 15 autosomal short tandem repeats in Tibet highland and Guangdong lowland Han Chinese populations[J].Ann Hum Biol，2019，46（2）：181-186.
[2] 康冰 ，曾昭书，王红丹，等.同一染色体中罕见三个短串联重复 序列基因座突变分析 [J]. 中国优生与遗传杂志 ，2016，24（2）：35-36.
[3] Xiao C， Peng Z， Chen F， et al. Mutation analysis of 19 commonly used short tandem repeat loci in a Guangdong Han population[J].Leg Med （Tokyo），2018，32：92-97.
[4] 杨玉有，张丹妍，杨智曦，等.亲子鉴定中D18S51基因座突变分 析与应对[J]中西医结合心血管病杂志（电子版 ），2018，6（16）：187-188.
河南省生殖健康科學技术研究院 河事缘法医物证司法鉴定所 河南郑州 450003
关键词：亲权鉴定;短串联重复序列;突变
短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR） 是人类的重要的遗传标记之一。在法医学亲子鉴定及遗传病学分析中具有有重要作用[1]。STR 基因座突变的现象是亲子鉴定中普遍存在的，突变的要机制与复制滑动突变密切相关。
所謂一步突变是指只涉及一个基序的加或减称为一步突变，约占 STR 基因座的 90%，约有10%的个体涉及多个序列突变，称多步突变 [3]。最多突变步数为四步。STR 核心序列的变异可能导致亲子鉴定的误判 [4]。因此法医物证人员，尤其关注 STR 基因座突变。现对 1 例出现一步基因座突变的亲子鉴定案件进行分析，报告如下。
1 仪器、试剂及方法
1.1仪器及试剂
1.1.1 GeneAmp 9700 热循环仪、3500xl 型遗传分析仪（美国应用生物系统公司）。
1.1.2试剂：21Plex 系统荧光标记检测试剂盒（ 2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA 聚合酶、 PCR Grade Water、Orange-500 。江苏苏博医学科技南京有限公司）。AGCU EX 21+1 荧光检测试剂盒 （ ReactionMix、Primers、Taq 酶、Allelic Ladder、 AGCU MarkerSIZ-500;无锡中德美联生物技 术有限公司）;X-STR 系统荧光标记检测试 剂盒（包括 5×PCR 反应缓冲液Ⅳ、5×17X 引物混合 物、去离子水、ORG-500;基点认知技术（北京） 有限公司）。
1.1.3标本：选择直径 1 cm 大小血斑一份，常温晾干后存储于 -20 ℃冰箱。
1.2方法： PCR 扩增和电泳分型：PCR 扩增体系和扩增程序依据各试剂盒说明书严格操作，PCR 扩增采用血斑直接扩增。扩增阳性和阴性对照方法如下：每次扩增以阳性对照 DNA作阳性对照，阴性对照扩增管中加入纯水。扩增产物应用 ABI3500xl 型遗传分析仪进行毛细管电泳，由Data Collection v3.0 数据收集软件收集电泳数据信息，电泳完成后把生成的数据导入 GeneMapper ID-X v1.5 软件中分析查看各基因座的基因型。
1.3 统计学分析： 根据中国汉族人群 STR 基因座的等位基因频率，根据规范推荐突变率，μ 为平均突变率 0.002，进行亲权指数、累积亲权指数的计算。所有操作均按照法医物证鉴定 X-STR 检验规范》、《 亲权鉴定技术规范书》执行。
2 结果
2.1 常染色体 STR 基因座分型结果
亲子鉴定案件运用 21Plex 系统检测 21 个基因座 分型结果是否符合遗传规律。在该例亲子鉴定的案 件中，发现存在一步突变的可能，涉及的 STR 基因座 为 D6S1043，其余 20 个基因座的检测结果全部符合遗 传规律（图 1）。
父亲 D6S1043 基因型为11，20”，孩子 D6S1043 基因型为“19，21”，孩子位点“21”与父亲 位点“20”相差一个重复单位考虑有一步突变的可能。D3S1358等20个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父排除概率大于0.9999。综上检验结果分析，除D6S1043基因座外，父亲均能提供给孩子必需的等位基因。在D6S1043基因座，孩子的基因型为“19，21”父亲的基因型为“11，20”，父亲不能提供给孩子必需的等位基因“19，21”，不符合遗传规律。按照GB/T 37223-2018《亲权鉴定技术规范》中不符合遗传规律情形时亲权指数的计算方法，D6S1043基因座的亲权指数为0.0396。综上20个STR基因座的累积亲权指数为19872.9500。
2.2 新增基因座分型结果
采用 AGCU EX21+1 试剂盒进一步检测，包含 21 个 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 检测系 统中也包含， 采用 AGCU EX21+1 试剂盒进一步检测，包含 21 个 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 检测系 统中也包含， D6S474等21个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父排除概率大于0.9999。父亲F在D6S474，D12ATA63和D1S1677等基因座不能提供给孩子必需的等位基因（图 2）。经计算，累积亲权指数为9.9965×10-20（注：小于0.0001）。
2.3 应用 GoldeneyeTM DNA 身份鉴定系统 17X 试剂盒，这 16 个 X-STR 基因座在女性群体的累积个人识别率为 0.999 999 999 999 992，在男性群体的累积个人识别率为 0.999 999 996 577 712，在三联体中的累积非父排除率为 0.999 999 971，在二联体中的累积非父排除率为 0.999 992 574。 这 16 个X-STR 基因座达到了法医物证学应用要求，尤其对特殊的亲权鉴定案件具有重要的应用价值。X-STR 基因座上的分型结果： 本案例又增加检测了17 个 X-STR 基因座，被 检标本 C 与被检标本 F 的X-STR 基因座大部分不一致，结果如表 1 所示。 2.4依据人类染色体遗传规律，孩子的遗传基因一 定来自亲生父母双方 [2]。综上检验结果分析，D3S1358等40个STR基因座均为人类的遗传学标记，遵循孟德尔遗传定律，联合应用可进行亲权鉴定，其累积非父排除概率大于0.9999。综上检验结果分析，父亲F在D6S1043，D6S474和D12ATA63等基因座不能提供给孩子必需的等位基因。经计算，累积亲权指数为5.2314×10-19（注：小于0.0001）。40个常染色体STR基因座分型后 CPI 值为5.2314×10-19（注：小于0.0001）。案例突变 基因座位点和 PI 计算结果见表 2。
3讨论：所谓的突变均是建立于在认定亲权关系的假设 上。STR 基因座突变与遗传多态性程度有着一定的 关系，其主要机制为复制滑动。复制滑动突变主要表 现为 STR 基因座等位基因重复单位的增加或减少 [3]。 序列结构比较均一的基因座容易发生突变，而等位基 因中含有不完全序列的基因座发生突变的概率较低，扩增片段较大的 STR 基因座更容易发生突变，这可 能是由于重复单位多的基因座其长度也较长，必然多 态性程度也较高，其突变概率会随之增加 [4]。
司法鉴定技术规范要求累计亲权指数大于 10 000 时，支持被检测男子（或被检测女子）是孩子 生物学父亲（或母亲），累计亲权指数小于 0.000 1 支持被检测男子（或被检测女子）不是孩子生物学父亲 （或母亲）。如果只有 1～2 个基因座不符合遗传规律，累计亲权指数在 0.000 1～10 000 之间应增加检测 其他高度多态性且遗传稳定的 STR 基因座，以避免 由于 STR 基因座突变导致错误地排除亲权关系。 该二联体案例首先用 21Plex 体系检测 20 个常染色体STR，出现一个矛盾基因座 D6S1043 ，父亲F为（19，21）， 孩子 C 为（11，20），相差 一个重复单位，累计亲权指数 19872.9500。考虑到是父女鉴定，使 用 X-STR 试剂盒进一步扩增检测，被检样本 F 与样 本C的 X-STR 基因型不相同，说明二人不符合同一母系 遗传规律。因为 X-STR 基因座具有伴性遗传的特征，女性在X-STR基因座具有两个等位基因，一个来自于父亲，一个来自于母亲;男性在X-STR基因座仅具有一个等位基因，且来自于母亲 ， 不同基因座中存在连锁的可能。本案例虽然检测了 17个 X -STR 基因座，但是部分基因座之间存在连锁 不平衡，鉴于不同的群体中连锁状态不相同，群体遗 传学数据有限，检测结果只是作为参考，未计算亲权 指数。 STR 基因座等位基因的突变与性别也有着一定 的相关性。研究发现，来源于父亲的突变多于来源于 母亲的突变。基因的突变率与细胞分裂次数密切相关。由于男性精原细胞在发育成为精子前要经过 多次分离，且分裂次数远远多于女性卵原细胞分裂的 次数，因而 DNA 复制发生滑动错配的机会就增多，突 变概率相应增加。除此之外，年龄等因素的影响也会 导致男性 DNA 突变率高于女性 [4]。
总之，常染色体20个STR基因座 检测结果中 D6S1043 基因座存在一步突变，其他 STR 基因座均符合遗传规律，虽然累计亲权指数大于 10 000 时，支持被检测男子（或被检测女子）是孩子 生物学父亲（或母亲），如果只有 1～2 个基因座不符合遗传规 律，累计亲权指数大于 10 000 时，应增加其他高度多态性且遗传稳定的 STR 基因座的检测，以避免 由于 STR 基因座突变导致错误地排除亲权关系。必须增加 STR 位点检测，计算累计亲权指数， 正确判断亲权关系。
参考文献
[1] He G， Gao B， Guo J， et al. Genetic diversity and forensic characteristics of 15 autosomal short tandem repeats in Tibet highland and Guangdong lowland Han Chinese populations[J].Ann Hum Biol，2019，46（2）：181-186.
[2] 康冰 ，曾昭书，王红丹，等.同一染色体中罕见三个短串联重复 序列基因座突变分析 [J]. 中国优生与遗传杂志 ，2016，24（2）：35-36.
[3] Xiao C， Peng Z， Chen F， et al. Mutation analysis of 19 commonly used short tandem repeat loci in a Guangdong Han population[J].Leg Med （Tokyo），2018，32：92-97.
[4] 杨玉有，张丹妍，杨智曦，等.亲子鉴定中D18S51基因座突变分 析与应对[J]中西医结合心血管病杂志（电子版 ），2018，6（16）：187-188.
河南省生殖健康科學技术研究院 河事缘法医物证司法鉴定所 河南郑州 450003