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摘要：利用双层平板法，以嗜水气胞菌（Aeromonas hydrophila）为宿主菌，从草鱼养殖池水中分离蛭弧菌一株；根据蛭弧菌hit基因序列设计引物进行PCR扩增，所得产物经胶回收、测序比对，发现其序列与噬菌蛭弧菌的hit基因100%同源，表明本研究所分离得到的为噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）。
关键词：蛭弧菌；噬菌蛭弧菌；分离；鉴定；PCR
噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus），是一类由Stolp和Petzold于1962年首次发现的、原核生物界唯一一类周质型专性捕食性细菌。其体形小，在土壤、淡海水、污水等不同环境中分布广泛，且运动活泼，具有“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主菌的生物学特性。
养殖概论
近年来，随着集约化水产养殖业的进一步发展，以及养殖水体的污染，嗜水气单胞菌等革兰氏阴性病原菌对草鱼等水产养殖动物造成了严重的危害。蛭弧菌能寄生和裂解大多数种类的革兰阴性菌。鉴于这一特性，噬菌蛭弧菌受到了国内外学者的广泛关注，逐渐成为水产养殖业中一种良好的微生态制剂，在农业、工业和医学等不同领域均显示出了广阔的应用前景。
本研究利用双层平板法从草鱼养殖池水中分离得到蛭弧菌一株，根据噬菌斑形成等对其进行初步的鉴定，同时根据蛭弧菌的host interaction（hit）基因序列设计了特异性引物，从分子水平上对该菌株进行了鉴定，确定该菌为噬菌蛭弧菌。为该菌应用于水产养殖疾病防治等理论研究与实践应用提供了基础资料。
材料与方法
水样 采自绍兴皋埠镇某草鱼养殖池，用采水器从底部取水，装于50mL灭菌的离心管中。
宿主菌株 以本实验室分离自患病草鱼并保存的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为宿主菌。
培养基 ①双层培养基：上层为0.6%自来水琼脂，用于蛭弧菌筛选、分离和纯化；下层为1.5%自来水琼脂；②普通营养肉汤培养基（NB）；③浸出液：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠15g，蒸馏水加至1000mL，pH7.0。
主要试剂 Taq酶、dNTPs购自上海生工产品；DNA回收试剂盒购自爱思进；pGMT载体、大肠杆菌感受态等均购自天根公司；其他为国产分析纯。
噬菌蛭弧菌的分离与鉴定 第一，宿主菌悬液的制备。将宿主菌嗜水气单胞菌接种于NB平板上，30℃过夜培养，刮取、无菌水洗脱细菌并收集于5mL离心管中，10000g，室温离心2min，去上清液，加入3mL无菌水制备成悬液，4℃保存备用。
第二，蛭弧菌的分离与纯化。①样品处理：取池水，经八叠纱布过滤，将澄清液置超速冷冻离心机中离心（4℃，30000g，40min）；沉淀用5mL无菌水溶解，再经0.22μm滤膜过滤后备用；②蛭弧菌的分离、纯化：取1mL滤液加入2mL的宿主菌悬液，混匀；然后加入7mL灭菌并保持在48℃左右的0.6%自来水琼脂培养基，摇匀后倒至经灭菌的1.5%自来水琼脂固体培养基上。30℃下倒置培养，观察噬菌斑的形成；经2至4d的培养后，挖取平板上透明、圆形和整齐的单个噬菌斑，置于NB液体培养基的离心管中，浸泡10min以上；用浸出液做双层平板，重复传代3次以上获得纯化的蛭弧菌。
第三，蛭弧菌的PCR鉴定。在结合以上噬菌斑进行鉴定的基础上，根据相关知识及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列，利用Oligo 6.5软件设计了特异性引物：BDhitf：5’-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3’，BDhitr：5’-ACGACTGTGAACGGCAACG-3’。PCR扩增体系为：DNA模板（噬菌斑浸出液）2.0μL，Taq酶0.2μL，dNTPs 0.4μL，10×PCR缓冲液2.5μL，引物各1.0μL，水17.9μL。循环参数为：95℃预变性4min；94℃变性40sec，56℃退火25sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，PCR产物经割胶回收后，与T载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；阳性克隆经鉴定后送上海生工测序，用blast和ClustalW2软件进行序列比对分析。
结果与分析
蛭弧菌的分离结果 采用双层琼脂平板法，以嗜水气单胞菌为宿主菌，通过滤膜过滤的方法收集草鱼养殖池水池培养蛭弧菌。结果发现，从第2d起开始形成大小相似、直径约0.1至0.25cm的圆形、透明、边缘整齐、凹陷的噬菌斑“负菌落”；3d后出斑率较高，直至7d左右，其大小总体上随培养时间延长而增大，显示所分离的蛭弧菌具有明显的噬菌作用。挑选特征典型的噬菌斑进行传代，经4次传代后得到蛭弧菌一株，记为BD-sx1（图1）。
蛭弧菌的PCR鉴定 在利用噬菌斑等形态学指标和噬菌特性对本研究过分离到的蛭弧菌进行初步观察与鉴定的基础上，本研究根据文献报道及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列设计了特异性引物，以宿主嗜水气单胞菌和大肠杆菌DH5α为阴性对照，进行了PCR扩增反应。结果显示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中获得了近800 bp的扩增条带，大小与预期相符（图2）。进而，本研究对PCR擴增产物进行了割胶回收，纯化产物与T载体连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞，对经鉴定后的阳性克隆进行测序，测序结果blast和Clustal W2软件与GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列进行比对了分析。比对结果表明，所得基因序列与噬菌蛭弧菌的hit基因序列100%相似（图3），进一步证明本研究所分离、纯化到的蛭弧菌菌株BD-sx1为噬菌蛭弧菌（B.bacteriovorus）。
讨论
培养基及其浓度 培养基的营养成分与宿主菌、蛭弧菌以及其他杂菌的生长密切相关。Stolp等在1963年就提出经稀释的低营养培养基不利于宿主菌的生长而有利于蛭弧菌的生长。因此，在分离、纯化蛭弧菌时应使用低营养成分的培养基。Staples等比较了不同浓度稀释度的培养基从水样中分离蛭弧菌的效果，结果发现高度稀释的培养基分离效果最佳。司稚东等研究发现，在1/10胨肉膏和酵母膏培养基上可形成蛭弧菌噬菌斑，但同时杂菌生长更快、菌落多，蛭弧菌噬菌斑易被其遮盖；而2%的自来水琼脂培养基上杂菌少、噬菌斑明显、清晰，更适于分离蛭弧菌。本研究分离纯化结果也显示，用低营养成分的自来水琼脂培养基分离蛭弧菌效果较好；同时，与司稚东等相比，琼脂使用浓度更低，仅用1.5%的琼脂也可取得良好分离效果。 双层琼脂平板法是蛭弧菌分离的经典方法，但在使用该方法时应注意上层培养基的温度应该控制在45-48℃左右，同时掌握好倒平板的时机。温度过高，宿主菌和水样中待分离的蛭弧菌可能会被烫死；温度过低，上层培养基易凝固，容易导致倒出的平板不平整，宿主菌和蛭弧菌难以均匀分布，最终导致噬菌不清晰，影响分离效果。
蛭弧菌的鉴定 传统的蛭弧菌的鉴定可根据噬菌斑形态、革兰氏染色、接触酶抑制、寄生性、菌体形态的显微观察等方法来进行，但上述方法存在特异性差、易受宿主菌干扰、有些较为繁琐等缺点，且容易产生误判。而本研究根据蛭弧菌hit基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，并结合测序比对和生物信息学鉴定，具有快速、准确等优点，与传统的噬菌斑形态观察、寄生性、革兰氏染色、显微镜观察等相结合，可从不同角度、不同层次进行蛭弧菌的鉴定，利用分子鉴定提高准确性，以更好地满足理论研究与实践应用的需要。
蛭弧菌微生態制剂在草鱼等水产养殖业中的应用前景 草鱼是我国的大宗鱼类、当家品种之一，但草鱼等“四大家鱼”的病害频发。传统的抗生素和化学药物治疗已难以适应国内外消费者对绿色无公害水产品质量安全的要求，因此，发展蛭弧菌等微生态制剂是符合可持续发展和环境要求的重要发展方向。鉴于蛭弧菌株独特的“寄生”和“裂解（溶菌）”病原菌的生物学特性，作为一种益生菌，蛭弧菌微生态制剂取代抗生素药物用于草鱼等水产养殖业具有独特的优势和广阔的发展前景。
参考文献
[1]Stolp H，and Petzold H.Undersuchungen ubereigen obligat parasitischen Mikroorganismus mit lytischer Aktivitat fur Pseudomonas-bacterien[J].Phytopathol Z，1962，45（4）：364-390
[2]Stolp H，and Starr MP. Bdellovibrio bacterirvorus gen.et.sp.n.，a predatory ectoparasitic，and bacteriolytic microorganism.Antonie Van Leeuwenhoek[J].J Microbiol，1963，29（1）：217-248
[3]Burnham JC and Conti SF.Bergery’s Manual of Systematic [M]
[4]秦生巨，李莉.噬菌蛭弧菌生物特性研究进展[J].生物化学与生物物理进展，1989，16（6）：442-445
[5]戚睿斌，袁平，赵静，张红见.草鱼、鲤鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定与耐药性检测[J].黑龙江畜牧兽医，2016（08上）：175-178，295
[6]刘晓静.淡水养殖鱼类暴发性流行病的成因分析与防治[J].河南水产，2015，（2）：21-22
[7]许宝青，蔡丽娟，戴瑜来，黄海婵.一株鱼源嗜水气单胞菌的分离、鉴定[J].杭州农业与科技，2016，（4）：39-42
[8]赵明森.噬菌蛭弧菌在虾蟹病害防治上的作用及其使用方法[J].现代渔业信息，2002，17（12）：14-16
[9]Jurkevitch E，Minz D，Ramati B，et al.Prey Range Characterization，Ribotyping，and Diversity of Soil and Rhizosphere Bdellovibrio spp.Isolated on Phytopathogenic Bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（6）：2365-71
[10]杨丽，潘红军.浅谈微生态制剂及其在水产养殖中的应用[J].渔业致富指南，2014（4）：18-19
[11]张梁，聂鲡蓉，张寇.蛭弧菌对常见致病菌感染草鱼保护作用的试验[J].科学养鱼.2015，（12）：61-62
[12]许少丹.噬菌蛭弧菌应用研究进展[J].现代农业科技，2012（6）：330-332
[13]Cotter TW and Thomashow MF.Identification of a Bdellovibrio bacteriovorus genetic locus，hit，associated with the Host-Independent phenotype [J].Journal of Bacteriology，1992，174（19）：6018-6024
[14]Dominik S，Eckahard S，Monika K，et.al.Taxonomic studies of predatory Bdellovibrios based on 16SrRNA analysis， ribotyping and the hit locus and characterization of isolates the gut of the animal [J].Systematic and Applied Microbiology，2001，24（3）：385-394
[15]司稚东，秦生巨，秋频.细菌的寄生菌--噬菌蛭弧菌的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1982，2（1）：12-15
[16]徐恒，岑英华.大豆根瘤菌蛭弧菌的发现[J].微生物学通报，1993，20（1）：1-3
（作者单位：浙江省绍兴市柯桥区鲁迅中学）
关键词：蛭弧菌；噬菌蛭弧菌；分离；鉴定；PCR
噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus），是一类由Stolp和Petzold于1962年首次发现的、原核生物界唯一一类周质型专性捕食性细菌。其体形小，在土壤、淡海水、污水等不同环境中分布广泛，且运动活泼，具有“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主菌的生物学特性。
养殖概论
近年来，随着集约化水产养殖业的进一步发展，以及养殖水体的污染，嗜水气单胞菌等革兰氏阴性病原菌对草鱼等水产养殖动物造成了严重的危害。蛭弧菌能寄生和裂解大多数种类的革兰阴性菌。鉴于这一特性，噬菌蛭弧菌受到了国内外学者的广泛关注，逐渐成为水产养殖业中一种良好的微生态制剂，在农业、工业和医学等不同领域均显示出了广阔的应用前景。
本研究利用双层平板法从草鱼养殖池水中分离得到蛭弧菌一株，根据噬菌斑形成等对其进行初步的鉴定，同时根据蛭弧菌的host interaction（hit）基因序列设计了特异性引物，从分子水平上对该菌株进行了鉴定，确定该菌为噬菌蛭弧菌。为该菌应用于水产养殖疾病防治等理论研究与实践应用提供了基础资料。
材料与方法
水样 采自绍兴皋埠镇某草鱼养殖池，用采水器从底部取水，装于50mL灭菌的离心管中。
宿主菌株 以本实验室分离自患病草鱼并保存的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为宿主菌。
培养基 ①双层培养基：上层为0.6%自来水琼脂，用于蛭弧菌筛选、分离和纯化；下层为1.5%自来水琼脂；②普通营养肉汤培养基（NB）；③浸出液：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠15g，蒸馏水加至1000mL，pH7.0。
主要试剂 Taq酶、dNTPs购自上海生工产品；DNA回收试剂盒购自爱思进；pGMT载体、大肠杆菌感受态等均购自天根公司；其他为国产分析纯。
噬菌蛭弧菌的分离与鉴定 第一，宿主菌悬液的制备。将宿主菌嗜水气单胞菌接种于NB平板上，30℃过夜培养，刮取、无菌水洗脱细菌并收集于5mL离心管中，10000g，室温离心2min，去上清液，加入3mL无菌水制备成悬液，4℃保存备用。
第二，蛭弧菌的分离与纯化。①样品处理：取池水，经八叠纱布过滤，将澄清液置超速冷冻离心机中离心（4℃，30000g，40min）；沉淀用5mL无菌水溶解，再经0.22μm滤膜过滤后备用；②蛭弧菌的分离、纯化：取1mL滤液加入2mL的宿主菌悬液，混匀；然后加入7mL灭菌并保持在48℃左右的0.6%自来水琼脂培养基，摇匀后倒至经灭菌的1.5%自来水琼脂固体培养基上。30℃下倒置培养，观察噬菌斑的形成；经2至4d的培养后，挖取平板上透明、圆形和整齐的单个噬菌斑，置于NB液体培养基的离心管中，浸泡10min以上；用浸出液做双层平板，重复传代3次以上获得纯化的蛭弧菌。
第三，蛭弧菌的PCR鉴定。在结合以上噬菌斑进行鉴定的基础上，根据相关知识及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列，利用Oligo 6.5软件设计了特异性引物：BDhitf：5’-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3’，BDhitr：5’-ACGACTGTGAACGGCAACG-3’。PCR扩增体系为：DNA模板（噬菌斑浸出液）2.0μL，Taq酶0.2μL，dNTPs 0.4μL，10×PCR缓冲液2.5μL，引物各1.0μL，水17.9μL。循环参数为：95℃预变性4min；94℃变性40sec，56℃退火25sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，PCR产物经割胶回收后，与T载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；阳性克隆经鉴定后送上海生工测序，用blast和ClustalW2软件进行序列比对分析。
结果与分析
蛭弧菌的分离结果 采用双层琼脂平板法，以嗜水气单胞菌为宿主菌，通过滤膜过滤的方法收集草鱼养殖池水池培养蛭弧菌。结果发现，从第2d起开始形成大小相似、直径约0.1至0.25cm的圆形、透明、边缘整齐、凹陷的噬菌斑“负菌落”；3d后出斑率较高，直至7d左右，其大小总体上随培养时间延长而增大，显示所分离的蛭弧菌具有明显的噬菌作用。挑选特征典型的噬菌斑进行传代，经4次传代后得到蛭弧菌一株，记为BD-sx1（图1）。
蛭弧菌的PCR鉴定 在利用噬菌斑等形态学指标和噬菌特性对本研究过分离到的蛭弧菌进行初步观察与鉴定的基础上，本研究根据文献报道及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列设计了特异性引物，以宿主嗜水气单胞菌和大肠杆菌DH5α为阴性对照，进行了PCR扩增反应。结果显示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中获得了近800 bp的扩增条带，大小与预期相符（图2）。进而，本研究对PCR擴增产物进行了割胶回收，纯化产物与T载体连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞，对经鉴定后的阳性克隆进行测序，测序结果blast和Clustal W2软件与GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列进行比对了分析。比对结果表明，所得基因序列与噬菌蛭弧菌的hit基因序列100%相似（图3），进一步证明本研究所分离、纯化到的蛭弧菌菌株BD-sx1为噬菌蛭弧菌（B.bacteriovorus）。
讨论
培养基及其浓度 培养基的营养成分与宿主菌、蛭弧菌以及其他杂菌的生长密切相关。Stolp等在1963年就提出经稀释的低营养培养基不利于宿主菌的生长而有利于蛭弧菌的生长。因此，在分离、纯化蛭弧菌时应使用低营养成分的培养基。Staples等比较了不同浓度稀释度的培养基从水样中分离蛭弧菌的效果，结果发现高度稀释的培养基分离效果最佳。司稚东等研究发现，在1/10胨肉膏和酵母膏培养基上可形成蛭弧菌噬菌斑，但同时杂菌生长更快、菌落多，蛭弧菌噬菌斑易被其遮盖；而2%的自来水琼脂培养基上杂菌少、噬菌斑明显、清晰，更适于分离蛭弧菌。本研究分离纯化结果也显示，用低营养成分的自来水琼脂培养基分离蛭弧菌效果较好；同时，与司稚东等相比，琼脂使用浓度更低，仅用1.5%的琼脂也可取得良好分离效果。 双层琼脂平板法是蛭弧菌分离的经典方法，但在使用该方法时应注意上层培养基的温度应该控制在45-48℃左右，同时掌握好倒平板的时机。温度过高，宿主菌和水样中待分离的蛭弧菌可能会被烫死；温度过低，上层培养基易凝固，容易导致倒出的平板不平整，宿主菌和蛭弧菌难以均匀分布，最终导致噬菌不清晰，影响分离效果。
蛭弧菌的鉴定 传统的蛭弧菌的鉴定可根据噬菌斑形态、革兰氏染色、接触酶抑制、寄生性、菌体形态的显微观察等方法来进行，但上述方法存在特异性差、易受宿主菌干扰、有些较为繁琐等缺点，且容易产生误判。而本研究根据蛭弧菌hit基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，并结合测序比对和生物信息学鉴定，具有快速、准确等优点，与传统的噬菌斑形态观察、寄生性、革兰氏染色、显微镜观察等相结合，可从不同角度、不同层次进行蛭弧菌的鉴定，利用分子鉴定提高准确性，以更好地满足理论研究与实践应用的需要。
蛭弧菌微生態制剂在草鱼等水产养殖业中的应用前景 草鱼是我国的大宗鱼类、当家品种之一，但草鱼等“四大家鱼”的病害频发。传统的抗生素和化学药物治疗已难以适应国内外消费者对绿色无公害水产品质量安全的要求，因此，发展蛭弧菌等微生态制剂是符合可持续发展和环境要求的重要发展方向。鉴于蛭弧菌株独特的“寄生”和“裂解（溶菌）”病原菌的生物学特性，作为一种益生菌，蛭弧菌微生态制剂取代抗生素药物用于草鱼等水产养殖业具有独特的优势和广阔的发展前景。
参考文献
[1]Stolp H，and Petzold H.Undersuchungen ubereigen obligat parasitischen Mikroorganismus mit lytischer Aktivitat fur Pseudomonas-bacterien[J].Phytopathol Z，1962，45（4）：364-390
[2]Stolp H，and Starr MP. Bdellovibrio bacterirvorus gen.et.sp.n.，a predatory ectoparasitic，and bacteriolytic microorganism.Antonie Van Leeuwenhoek[J].J Microbiol，1963，29（1）：217-248
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[10]杨丽，潘红军.浅谈微生态制剂及其在水产养殖中的应用[J].渔业致富指南，2014（4）：18-19
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[12]许少丹.噬菌蛭弧菌应用研究进展[J].现代农业科技，2012（6）：330-332
[13]Cotter TW and Thomashow MF.Identification of a Bdellovibrio bacteriovorus genetic locus，hit，associated with the Host-Independent phenotype [J].Journal of Bacteriology，1992，174（19）：6018-6024
[14]Dominik S，Eckahard S，Monika K，et.al.Taxonomic studies of predatory Bdellovibrios based on 16SrRNA analysis， ribotyping and the hit locus and characterization of isolates the gut of the animal [J].Systematic and Applied Microbiology，2001，24（3）：385-394
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[16]徐恒，岑英华.大豆根瘤菌蛭弧菌的发现[J].微生物学通报，1993，20（1）：1-3
（作者单位：浙江省绍兴市柯桥区鲁迅中学）