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摘 要：以碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶复合水解核桃蛋白制备抗氧化活性多肽的工艺条件优化为对象，通过研究酶解时间、酶解温度、酶与底物浓度比及复合酶比例对核桃蛋白酶解物清除DPPH·能力的影响，并利用正交试验优化工艺条件，以提高核桃蛋白多肽对DPPH·的清除率。结果表明，酶解时间、酶解温度、酶与底物浓度比及复合酶比例对核桃蛋白酶解物清除DPPH·能力有一定影响；当木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解温度为45℃、时间1.5h、酶与底物浓度1500U/g、pH值7.0、复合酶比例为2∶1时，酶解物清除DPPH·的能力最强，清除率达78.7%。
关键词：核桃多肽；复合酶；工艺优化
中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）08-0022-03
核桃蛋白是一种优质的植物蛋白资源，富含18种氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量高[1]，其酶解产物核桃蛋白多肽具有浓度高、溶解性好等特性[2-3]，乳化性、吸湿性等均优于核桃蛋白，更适合用于加工生产优质食品[4]。在食品加工中，脂肪的氧化是影响食品风味、质构和外观的主要因素[5]，具有抗氧化活性的生物活性肽是潜在的天然、安全、高效的抗氧化剂[6-7]。酶的水解和微生物的发酵是较常用的水解蛋白质的方式[8-9]。核桃蛋白水解后具有很好的抗氧化、抑菌、抗肿瘤等作用[10]，因此利用核桃蛋白开发具有抗氧化活性的多肽市场前景广阔。本实验通过利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合水解核桃蛋白，研究其复合比例、水解条件对水解产物抗氧化活性的影响，以提升核桃蛋白水解物的抗氧化活性，为核桃蛋白多肽的应用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂 材料：核桃，市售；木瓜蛋白酶（1000U/mg）；碱性蛋白酶（10000U/g）；DPPH（D9132）。试剂：无水乙醇，乙醚，盐酸等均为分析纯。
1.1.2 设备 LGJ-100型真空冷冻干燥机：北京四科学仪器厂有限公司；SW-CJ-1F型通风橱：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；H-2050R型离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；7230G型紫外分光光度仪：上海精密科学仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TP-214型电子天平：北京柏莱斯特科技发展有限公司；JMS-125Q型胶体磨：廊坊市惠友机械有限公司；JB-2A型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 核桃蛋白制备 核桃去壳、去皮（0.5mol/L氢氧化钠溶液在60℃以下加热3min），迅速投入1.0%柠檬酸溶液中冷却，捞出沥干水分，用胶体磨进行匀浆，随后将核桃浆与乙醚充分混合，静置20h，去除醚层，并在通风橱中将乙醚挥发完全，然后用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0，搅拌1h后离心（5000r/min，15min），取上清液，用0.5mol/L的盐酸调节pH至4.5，搅拌1h后离心（5000r/min，15min），取沉淀，水洗至中性[19]。最后进行冷冻干燥，得到核桃饼粕蛋白粉[11-12]。
1.2.2 核桃饼粕蛋白多肽液的制备 配置5%的核桃饼粕蛋白液，在60℃水浴锅中保温30min，调整pH为7.0，将木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶以1：1的比例混合，并以酶与底物浓度之比为1000U/g加入，调节酶解温度为45℃，酶解1h，沸水浴灭酶10min，冷却后在4000r/min下离心20min，取上清液，即得到核桃饼粕多肽溶液[13]。
1.2.3 酶解条件对核桃饼粕蛋白多肽液抗氧化活性的影响 按照1.2.2的方法酶解核桃蛋白，分别单一改变其中复合酶比例（木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶比例至1∶3、1∶2、
1∶1、2∶1、3∶1）、复合酶添加量（500U/g、750U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g）、酶解时间（0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h）、酶解温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）条件，考察核桃饼粕蛋白多肽液的对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除率。
1.2.4 正交实验 在单因素实验基础上，选择对DPPH·清除率影响较大的因素进行正交实验，优化工艺参数。
1.3 樣品中DPPH·清除率的测定 核桃蛋白肽对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除能力的测定[1][20]。取多肽样液2mL及0.2mmol/L DPPH·溶液（用无水乙醇配制）2mL加入同一试管中摇匀，在室温下密闭静置30min，于517nm波长下测定吸光度[14-16]。
[DPPH清除率%=1-（A1-A0）A2×100]
式中：A0为样液+无水乙醇溶液的吸光度；A1为样液+DPPH·溶液的吸光度；A2为DPPH·溶液+无水乙醇的吸光度。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 复合酶比例对核桃多肽抗氧化活性的影响 由图1可知，复合酶的比例对核桃多肽清除DPPH·的能力有显著影响。随木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的比例的降低，核桃多肽清除DPPH·的能力呈现先增大后降低的趋势，当木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的比例为1∶1时，核桃多肽的清除率最高，达到59.3%。由于两种酶作用于蛋白不同的肽键位点，导致酶解产生的多肽分子量大小和生物活性存在差异，当酶复合配比变化时，酶解得到的多肽发生变化，可能当木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶比例为1∶1时酶解得到的具有抗氧化活性的多肽较多，故其清除率较高。
2.1.2 复合酶添加量对核桃多肽抗氧化活性的影响 由图2可知，复合酶添加量对核桃多肽清除DPPH·的能力有一定影响。当复合酶添加量小于1000U/g时，核桃多肽清除DPPH·的能力随添加量的增大而增强；当复合酶添加量大于1000U/g时，核桃多肽清除DPPH·的能力随复合酶添加量的增大变化不大，主要是因为当酶的添加量较大时，底物蛋白质的相对浓度较小，基本已被酶饱和，部分酶分子将不能充分与蛋白质分子结合[17-18]，导致酶的添加量超过一定量后，其对核桃多肽的抗氧化性影响不大。 2.1.3 复合酶酶解温度对核桃多肽抗氧化活性影响 由图3可知，酶解温度对于核桃多肽清除DPPH·的能力有一定影响。随酶解温度的升高，核桃多肽清除DPPH·的能力呈现先增后减的趋势，当酶解温度低于45℃时，核桃多肽清除DPPH·的能力随酶解温度的升高明显增强；当酶解温度高于45℃时，核桃多肽清除DPPH·的能力呈现微弱的下降趋势。这是因为温度继续上升使得酶变性，酶活力减弱[19]，且底物蛋白也受到温度影响，不利于酶解反应的进行。
2.1.4 复合酶酶解时间对核桃蛋白抗氧化活性影响 由图4可知，酶解时间对核桃多肽清除DPPH·的能力有较大影响。当酶解时间低于1h时，随酶解时间的延长，核桃多肽清除DPPH·的能力迅速升高；当酶解时间大于1h时，核桃多肽清除DPPH·的能力逐渐降低；可能由于酶解反应开始的前一段时间，由于酶促反应的底物浓度较好，有利于酶解反应的進行，随酶解时间的延长，底物浓度逐渐降低，酶解反应逐渐减弱，同时酶解产物暴露在空气中使得其抗氧化性也受到一定影响。
2.2 正交实验结果 在单因素实验的的基础上，选择酶解温度、酶解时间、复合酶添加量及配比为因素，进行正交试验，结果如表1所示。
由表1可知，影响核桃多肽清除DPPH·能力的主次因素为D>C>B>A，即复合酶配比>添加量>酶解时间>酶解温度；且最优水平组合为A2B2C3D1，即酶解温度为45℃，酶解时间为1.5h复合酶添加量为1500U/g，木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶之比为2∶1，核桃多肽的DPPH·清除率最高，达到78.7%。
3 结论
（1）当利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解核桃蛋白制备核桃多肽时，酶解时间、酶解温度、pH、复合酶添加量、复合酶比例对核桃多肽DPPH·清除率有一定的影响作用。
（2）利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解核桃蛋白时，当酶解温度为45℃，酶解时间为1.5h，复合酶添加量为1500U/g，酶解pH为7.0，复合酶比例为2∶1时，酶解制备的核桃多肽DPPH·清除率最高，达到了78.7%。
参考文献
[1]沈敏江，刘红芝，刘丽，等.核桃蛋白质的组成、制备及功能特性研究进展[J].中国粮油学报，2014（1）：123-128.
[2]吴夏花.营养型核桃多肽粉的研制[D].太原：山西大学，2012.
[3]陈树俊，李乐，石玥，等.响应面法优化酶解制备核桃多肽工艺[J].食品工业科技，2017（16）：142-149.
[4]段心妍.核桃肽对雄性大鼠抗疲劳作用的研究[D].太原：太原理工大学，2014.
[5]刘昭明，黄翠姬，孟陆丽，等.核桃蛋白肽的抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业，2009，35（1）：58-61.
[6]Rajapakse N， Mendis E， Byun H G， et al.Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical-mediated oxidative systems[J].Journal of Nutrition Biochemistry， 2005，16： 562-569.
[7]Li Y H，Jiang B，Zhang T，et al.Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate（CPH）[J].Food Chemistry，2008，106：444-450.
[8]Korhonen H.Technology options for new nutritional concepts[J].International Journal of Dairy Technology，2002，55（2）：79-88.
[9]刘欣，赵新淮.发酵豆制品中主要植物化学成分及生理功能的研究进展[J].大豆科学，2017，36（1）：157-162.
[10]李照，孙磊，高飞，等.核桃仁营养成分及活性研究进展[J].药物生物技术，2016，23（5）：467-470.
[11]王攀.四种稳定剂对核桃蛋白体外消化效果的影响[J].陕西农业科学，2015，61（5）：24-27.
[12]颜小捷，刘幼娴，郑立浪，等.胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究[J].广西植物，2014，13（2）：183-188.
[13]刘昭明，黄翠姬，周远.核桃蛋白酶水解物的抑菌性能探讨[J].四川食品与发酵，2008，44（5）：20-23.
[14]陈金海，徐怀德，李艳伏，等.碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化特性研究[J].西北农业学报，2010，19（11）：88-92.
[15]Bektas Tepe，Munevver Sokmen，H Askin Akpulat，et al.In vitor antioxidant activities of the methanol extracts offive Allium species from Turkey[J].Food Chemistry，2005，92：89-92.
[16]陈永浩，王克建，郝艳宾，等.酶解方式对核桃蛋白肽及其抗氧化活性的影响[J].食品与机械，2011，27（5）：63-67.
[17]Adler-Nissen J.Enzymatic hydrolysis of food proteins[M].New York：Elsevier Applied Science PuBlishers，1986.
[18]张莉莎，张建新.双酶水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺优化[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2009，37（2）：165-172.
[19]王璋.食品酶学[M].北京：中国轻工业出版社，1996：194-195.
（责编：王慧晴）
关键词：核桃多肽；复合酶；工艺优化
中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）08-0022-03
核桃蛋白是一种优质的植物蛋白资源，富含18种氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量高[1]，其酶解产物核桃蛋白多肽具有浓度高、溶解性好等特性[2-3]，乳化性、吸湿性等均优于核桃蛋白，更适合用于加工生产优质食品[4]。在食品加工中，脂肪的氧化是影响食品风味、质构和外观的主要因素[5]，具有抗氧化活性的生物活性肽是潜在的天然、安全、高效的抗氧化剂[6-7]。酶的水解和微生物的发酵是较常用的水解蛋白质的方式[8-9]。核桃蛋白水解后具有很好的抗氧化、抑菌、抗肿瘤等作用[10]，因此利用核桃蛋白开发具有抗氧化活性的多肽市场前景广阔。本实验通过利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合水解核桃蛋白，研究其复合比例、水解条件对水解产物抗氧化活性的影响，以提升核桃蛋白水解物的抗氧化活性，为核桃蛋白多肽的应用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂 材料：核桃，市售；木瓜蛋白酶（1000U/mg）；碱性蛋白酶（10000U/g）；DPPH（D9132）。试剂：无水乙醇，乙醚，盐酸等均为分析纯。
1.1.2 设备 LGJ-100型真空冷冻干燥机：北京四科学仪器厂有限公司；SW-CJ-1F型通风橱：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；H-2050R型离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；7230G型紫外分光光度仪：上海精密科学仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TP-214型电子天平：北京柏莱斯特科技发展有限公司；JMS-125Q型胶体磨：廊坊市惠友机械有限公司；JB-2A型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 核桃蛋白制备 核桃去壳、去皮（0.5mol/L氢氧化钠溶液在60℃以下加热3min），迅速投入1.0%柠檬酸溶液中冷却，捞出沥干水分，用胶体磨进行匀浆，随后将核桃浆与乙醚充分混合，静置20h，去除醚层，并在通风橱中将乙醚挥发完全，然后用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0，搅拌1h后离心（5000r/min，15min），取上清液，用0.5mol/L的盐酸调节pH至4.5，搅拌1h后离心（5000r/min，15min），取沉淀，水洗至中性[19]。最后进行冷冻干燥，得到核桃饼粕蛋白粉[11-12]。
1.2.2 核桃饼粕蛋白多肽液的制备 配置5%的核桃饼粕蛋白液，在60℃水浴锅中保温30min，调整pH为7.0，将木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶以1：1的比例混合，并以酶与底物浓度之比为1000U/g加入，调节酶解温度为45℃，酶解1h，沸水浴灭酶10min，冷却后在4000r/min下离心20min，取上清液，即得到核桃饼粕多肽溶液[13]。
1.2.3 酶解条件对核桃饼粕蛋白多肽液抗氧化活性的影响 按照1.2.2的方法酶解核桃蛋白，分别单一改变其中复合酶比例（木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶比例至1∶3、1∶2、
1∶1、2∶1、3∶1）、复合酶添加量（500U/g、750U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g）、酶解时间（0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h）、酶解温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）条件，考察核桃饼粕蛋白多肽液的对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除率。
1.2.4 正交实验 在单因素实验基础上，选择对DPPH·清除率影响较大的因素进行正交实验，优化工艺参数。
1.3 樣品中DPPH·清除率的测定 核桃蛋白肽对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除能力的测定[1][20]。取多肽样液2mL及0.2mmol/L DPPH·溶液（用无水乙醇配制）2mL加入同一试管中摇匀，在室温下密闭静置30min，于517nm波长下测定吸光度[14-16]。
[DPPH清除率%=1-（A1-A0）A2×100]
式中：A0为样液+无水乙醇溶液的吸光度；A1为样液+DPPH·溶液的吸光度；A2为DPPH·溶液+无水乙醇的吸光度。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 复合酶比例对核桃多肽抗氧化活性的影响 由图1可知，复合酶的比例对核桃多肽清除DPPH·的能力有显著影响。随木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的比例的降低，核桃多肽清除DPPH·的能力呈现先增大后降低的趋势，当木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的比例为1∶1时，核桃多肽的清除率最高，达到59.3%。由于两种酶作用于蛋白不同的肽键位点，导致酶解产生的多肽分子量大小和生物活性存在差异，当酶复合配比变化时，酶解得到的多肽发生变化，可能当木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶比例为1∶1时酶解得到的具有抗氧化活性的多肽较多，故其清除率较高。
2.1.2 复合酶添加量对核桃多肽抗氧化活性的影响 由图2可知，复合酶添加量对核桃多肽清除DPPH·的能力有一定影响。当复合酶添加量小于1000U/g时，核桃多肽清除DPPH·的能力随添加量的增大而增强；当复合酶添加量大于1000U/g时，核桃多肽清除DPPH·的能力随复合酶添加量的增大变化不大，主要是因为当酶的添加量较大时，底物蛋白质的相对浓度较小，基本已被酶饱和，部分酶分子将不能充分与蛋白质分子结合[17-18]，导致酶的添加量超过一定量后，其对核桃多肽的抗氧化性影响不大。 2.1.3 复合酶酶解温度对核桃多肽抗氧化活性影响 由图3可知，酶解温度对于核桃多肽清除DPPH·的能力有一定影响。随酶解温度的升高，核桃多肽清除DPPH·的能力呈现先增后减的趋势，当酶解温度低于45℃时，核桃多肽清除DPPH·的能力随酶解温度的升高明显增强；当酶解温度高于45℃时，核桃多肽清除DPPH·的能力呈现微弱的下降趋势。这是因为温度继续上升使得酶变性，酶活力减弱[19]，且底物蛋白也受到温度影响，不利于酶解反应的进行。
2.1.4 复合酶酶解时间对核桃蛋白抗氧化活性影响 由图4可知，酶解时间对核桃多肽清除DPPH·的能力有较大影响。当酶解时间低于1h时，随酶解时间的延长，核桃多肽清除DPPH·的能力迅速升高；当酶解时间大于1h时，核桃多肽清除DPPH·的能力逐渐降低；可能由于酶解反应开始的前一段时间，由于酶促反应的底物浓度较好，有利于酶解反应的進行，随酶解时间的延长，底物浓度逐渐降低，酶解反应逐渐减弱，同时酶解产物暴露在空气中使得其抗氧化性也受到一定影响。
2.2 正交实验结果 在单因素实验的的基础上，选择酶解温度、酶解时间、复合酶添加量及配比为因素，进行正交试验，结果如表1所示。
由表1可知，影响核桃多肽清除DPPH·能力的主次因素为D>C>B>A，即复合酶配比>添加量>酶解时间>酶解温度；且最优水平组合为A2B2C3D1，即酶解温度为45℃，酶解时间为1.5h复合酶添加量为1500U/g，木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶之比为2∶1，核桃多肽的DPPH·清除率最高，达到78.7%。
3 结论
（1）当利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解核桃蛋白制备核桃多肽时，酶解时间、酶解温度、pH、复合酶添加量、复合酶比例对核桃多肽DPPH·清除率有一定的影响作用。
（2）利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解核桃蛋白时，当酶解温度为45℃，酶解时间为1.5h，复合酶添加量为1500U/g，酶解pH为7.0，复合酶比例为2∶1时，酶解制备的核桃多肽DPPH·清除率最高，达到了78.7%。
参考文献
[1]沈敏江，刘红芝，刘丽，等.核桃蛋白质的组成、制备及功能特性研究进展[J].中国粮油学报，2014（1）：123-128.
[2]吴夏花.营养型核桃多肽粉的研制[D].太原：山西大学，2012.
[3]陈树俊，李乐，石玥，等.响应面法优化酶解制备核桃多肽工艺[J].食品工业科技，2017（16）：142-149.
[4]段心妍.核桃肽对雄性大鼠抗疲劳作用的研究[D].太原：太原理工大学，2014.
[5]刘昭明，黄翠姬，孟陆丽，等.核桃蛋白肽的抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业，2009，35（1）：58-61.
[6]Rajapakse N， Mendis E， Byun H G， et al.Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical-mediated oxidative systems[J].Journal of Nutrition Biochemistry， 2005，16： 562-569.
[7]Li Y H，Jiang B，Zhang T，et al.Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate（CPH）[J].Food Chemistry，2008，106：444-450.
[8]Korhonen H.Technology options for new nutritional concepts[J].International Journal of Dairy Technology，2002，55（2）：79-88.
[9]刘欣，赵新淮.发酵豆制品中主要植物化学成分及生理功能的研究进展[J].大豆科学，2017，36（1）：157-162.
[10]李照，孙磊，高飞，等.核桃仁营养成分及活性研究进展[J].药物生物技术，2016，23（5）：467-470.
[11]王攀.四种稳定剂对核桃蛋白体外消化效果的影响[J].陕西农业科学，2015，61（5）：24-27.
[12]颜小捷，刘幼娴，郑立浪，等.胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究[J].广西植物，2014，13（2）：183-188.
[13]刘昭明，黄翠姬，周远.核桃蛋白酶水解物的抑菌性能探讨[J].四川食品与发酵，2008，44（5）：20-23.
[14]陈金海，徐怀德，李艳伏，等.碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化特性研究[J].西北农业学报，2010，19（11）：88-92.
[15]Bektas Tepe，Munevver Sokmen，H Askin Akpulat，et al.In vitor antioxidant activities of the methanol extracts offive Allium species from Turkey[J].Food Chemistry，2005，92：89-92.
[16]陈永浩，王克建，郝艳宾，等.酶解方式对核桃蛋白肽及其抗氧化活性的影响[J].食品与机械，2011，27（5）：63-67.
[17]Adler-Nissen J.Enzymatic hydrolysis of food proteins[M].New York：Elsevier Applied Science PuBlishers，1986.
[18]张莉莎，张建新.双酶水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺优化[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2009，37（2）：165-172.
[19]王璋.食品酶学[M].北京：中国轻工业出版社，1996：194-195.
（责编：王慧晴）