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摘要：目的：探讨miR-146a对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8的调节作用。方法：本研究设实验组和对照组两组，通过原代细胞培养技术获得体外培养眼眶成纤维细胞，再利用携带目的基因的慢病毒转染眼眶成纤维细胞，过表达或抑制眼眶成纤维细胞miR-146a的表达水平，进而通过ELISA法检测IL-6和IL-8的表达水平。结果：TAO患者眼眶成纤维细胞48h上清液中IL-6和IL-8水平明显升高，结果与正常组有统计学差异（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纤维细胞中，上调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同时，下调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。结论：过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的表达，同时抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的表达。
关键词：甲状腺相关性眼病，眼眶成纤维细胞，miR-146a，IL-6，IL-8
【中图分类号】R581.3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）03-022-02
引言
甲状腺相关性眼病（Thyroid-associated ophthalmopathy， TAO），是一种器官特异性自身免疫性疾病[1]。眼眶成纤维细胞是甲状腺相关眼病的自身免疫靶点和效应细胞[2]。IL-6是主要的促炎细胞因子[3]。成纤维细胞中IL-8的产生参与甲状腺相关眼病炎症进展[4]。
miR-146a是典型的多功能miRNA，参与免疫调节，细胞增殖，分化，凋亡，细胞外基质代谢和其他生命过程[5]。杨文娟等[6]发现，甲状腺相关眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血单个核细胞的miRNA-146a相对表达量较正常人明显下降。然而，miR-146a对眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的影响仍不清楚。本研究旨在通过原代细胞培养技术获取纯化的眼眶成纤维细胞，利用携带目的基因的慢病毒转染眼眶成纤维细胞，过表达或抑制miR-146a的表达水平，进而利用ELISA法检测IL-6和IL-8的表达水平，探讨miR-146a对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8的调节作用。
方法
1.实验材料
实验组：因暴露性角膜炎、压迫性视神经病变或限制性眼外肌病變行眼眶减压术或斜视矫正术的甲状腺相关眼病患者6例，术中取眼眶球后结缔组织。
对照组：因眼外伤等原因引起眼球萎缩行眼球摘除术及义眼座植入术以及二期义眼座植入术6例，术中取眼眶球后结缔组织。
1.慢病毒的构建及慢病毒转染眼眶成纤维细胞的条件
本实验需要的含目的基因的重组慢病毒载体由上海基凯基因公司协助构建完成，根据上海基凯基因公司所提供的慢病毒感染实验手册指导实验。
2.转染后ELISA检测眼眶成纤维细胞Il-6和IL-8的表达水平
取生长良好的眼眶成纤维细胞，调整细胞密度，各组眼眶成纤维细胞按4x104/ml接种6孔板，培养箱中培养48h后，收集各组上清液，参照ELISA试剂盒使用说明，检测细胞上清液中Il-6和IL-8的表达水平。
3.统计学分析
实验结果采用SPSS 20.0对数据进行统计学分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果转染后ELISA检测眼眶成纤维细胞Il-6和IL-8的表达水平
TAO患者眼眶成纤维细胞较正常眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8水平明显升高，结果与正常组有统计学差异（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纤维细胞中，上调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同时，下调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。在正常人眼眶成纤维细胞，上调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;下调miR-146a表达水平，IL-8水平升高（P<0.05）。
讨论
miR-146a是典型的多功能miRNA，参与免疫调节，细胞增殖，分化，凋亡，细胞外基质代谢和其他生命过程[7]。Sun等[8]通过qPCR比较甲状腺相关眼病和非甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织中miR-146a的表达水平，结果发现眼眶成纤维细胞中的炎性应激能使miR-146a上调。杨文娟等[6]发现，甲状腺相关眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血单个核细胞的miRNA-146a相对表达量较正常人明显下降。然而，本实验研究TAO患者眼眶成纤维细胞较正常眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8水平明显升高。由此可见，在自身免疫性疾病中，miR-146a的表达可能有不同的复杂机制。
IL-6在甲状腺相关眼病中也有重要的作用。已有研究表明，眼眶容量与IL-6mRNA的表达呈正相关，与IL-4mRNA、IL-10mRNA呈负相关[9]。相较于非活动性甲状腺相关眼病患者，活动性甲状腺相关眼病患者血清IL-6和可溶性型IL-6受体浓度明显升高[3]。Ning等[10]发现与对照组相比，甲状腺相关眼病患者外周血的miR-146a的相对表达显着增加，而Notch2的相对表达明显降低，且 Notch2可以被miRNA-146a直接作为靶向目标。外源性miRNA-146a模拟物可下调Notch2的表达和上调IL-6。抑制miRNA-146可以导致Notch2的表达升高和IL-6的表达降低。这些结果说明miR-146a可通过直接靶向作用Notch2增加IL-6水平，从而促进甲状腺相关眼病的发展。在我们的研究中，过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-6的表达，同时抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-6的表达。 IL-8是促炎趋化因子，具有诱导中性粒细胞沿着血管壁的聚集的作用[11]。在甲状腺相关眼病中，各种类型的成纤维细胞以及这些细胞中IL-8的大量产生参与疾病炎症进展[12]。在眼眶炎症中，眼眶成纤维细胞在一些细胞因子的刺激下，如IL-1β、TNF-α、脂多糖和IFN-γ，产生剂量依赖的IL-8和MCP-1[13]。在我们的研究中，过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-8的表达，同时抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-8的表达。
过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的表达，抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的表达。提示miR-146a可能与甲状腺相关眼病疾病的发生发展有关。
参考文献
[1]Maheshwari R， Weis E. Thyroid associated orbitopathy. Indian journal of ophthalmology 2012;60：87-93.
[2]van Steensel L， Dik WA. The orbital fibroblast： a key player and target for therapy in graves' ophthalmopathy. Orbit 2010;29：202-6.
[3]Salvi M， Girasole G， Pedrazzoni M， et al. Increased serum concentrations of interleukin-6 （IL-6） and soluble IL-6 receptor in patients with Graves' disease. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1996;81：2976-9.
[4]Du L， Yang J， Huang J， et al. The associations between the polymorphisms in the CTLA-4 gene and the risk of Graves' disease in the Chinese population. BMC medical genetics 2013;14：46.
[5]Yang L， Boldin MP， Yu Y， et al. miR-146a controls the resolution of T cell responses in mice. The Journal of experimental medicine 2012;209：1655-70.
[6]楊文娟， 班胜刚， 何剑峰. 甲状腺相关眼病患者外周血单个核细胞中微小RNA-146a的异常表达及意义. 眼科新进展 2012：414-7.
[7]Contreras J， Rao DS. MicroRNAs in inflammation and immune responses. Leukemia 2012;26：404-13.
[8]Jang SY， Chae MK， Lee JH， et al. Role of miR-146a in the Regulation of Inflammation in an In Vitro Model of Graves' Orbitopathy. Investigative ophthalmology & visual science 2016;57：4027-34.
[9]Hiromatsu Y， Yang D， Bednarczuk T， et al. Cytokine profiles in eye muscle tissue and orbital fat tissue from patients with thyroid-associated ophthalmopathy. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 2000;85：1194-9.
[10]Wang N， Chen FE， Long ZW. Mechanism of MicroRNA-146a/Notch2 Signaling Regulating IL-6 in Graves Ophthalmopathy. Cell Physiol Biochem 2017;41：1285-97.
[11]Ghasemi H， Ghazanfari T， Yaraee R， et al. Roles of IL-8 in ocular inflammations： a review. Ocular immunology and inflammation 2011;19：401-12.
[12]Koumas L， Smith TJ， Phipps RP. Fibroblast subsets in the human orbit： Thy-1+ and Thy-1- subpopulations exhibit distinct phenotypes. European journal of immunology 2002;32：477-85.
[13]Elner VM， Burnstine MA， Kunkel SL， et al. Interleukin-8 and monocyte chemotactic protein-1 gene expression and protein production by human orbital fibroblasts. Ophthalmic plastic and reconstructive surgery 1998;14：119-25.
关键词：甲状腺相关性眼病，眼眶成纤维细胞，miR-146a，IL-6，IL-8
【中图分类号】R581.3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）03-022-02
引言
甲状腺相关性眼病（Thyroid-associated ophthalmopathy， TAO），是一种器官特异性自身免疫性疾病[1]。眼眶成纤维细胞是甲状腺相关眼病的自身免疫靶点和效应细胞[2]。IL-6是主要的促炎细胞因子[3]。成纤维细胞中IL-8的产生参与甲状腺相关眼病炎症进展[4]。
miR-146a是典型的多功能miRNA，参与免疫调节，细胞增殖，分化，凋亡，细胞外基质代谢和其他生命过程[5]。杨文娟等[6]发现，甲状腺相关眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血单个核细胞的miRNA-146a相对表达量较正常人明显下降。然而，miR-146a对眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的影响仍不清楚。本研究旨在通过原代细胞培养技术获取纯化的眼眶成纤维细胞，利用携带目的基因的慢病毒转染眼眶成纤维细胞，过表达或抑制miR-146a的表达水平，进而利用ELISA法检测IL-6和IL-8的表达水平，探讨miR-146a对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8的调节作用。
方法
1.实验材料
实验组：因暴露性角膜炎、压迫性视神经病变或限制性眼外肌病變行眼眶减压术或斜视矫正术的甲状腺相关眼病患者6例，术中取眼眶球后结缔组织。
对照组：因眼外伤等原因引起眼球萎缩行眼球摘除术及义眼座植入术以及二期义眼座植入术6例，术中取眼眶球后结缔组织。
1.慢病毒的构建及慢病毒转染眼眶成纤维细胞的条件
本实验需要的含目的基因的重组慢病毒载体由上海基凯基因公司协助构建完成，根据上海基凯基因公司所提供的慢病毒感染实验手册指导实验。
2.转染后ELISA检测眼眶成纤维细胞Il-6和IL-8的表达水平
取生长良好的眼眶成纤维细胞，调整细胞密度，各组眼眶成纤维细胞按4x104/ml接种6孔板，培养箱中培养48h后，收集各组上清液，参照ELISA试剂盒使用说明，检测细胞上清液中Il-6和IL-8的表达水平。
3.统计学分析
实验结果采用SPSS 20.0对数据进行统计学分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果转染后ELISA检测眼眶成纤维细胞Il-6和IL-8的表达水平
TAO患者眼眶成纤维细胞较正常眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8水平明显升高，结果与正常组有统计学差异（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纤维细胞中，上调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同时，下调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。在正常人眼眶成纤维细胞，上调miR-146a表达水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;下调miR-146a表达水平，IL-8水平升高（P<0.05）。
讨论
miR-146a是典型的多功能miRNA，参与免疫调节，细胞增殖，分化，凋亡，细胞外基质代谢和其他生命过程[7]。Sun等[8]通过qPCR比较甲状腺相关眼病和非甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织中miR-146a的表达水平，结果发现眼眶成纤维细胞中的炎性应激能使miR-146a上调。杨文娟等[6]发现，甲状腺相关眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血单个核细胞的miRNA-146a相对表达量较正常人明显下降。然而，本实验研究TAO患者眼眶成纤维细胞较正常眼眶成纤维细胞IL-6和IL-8水平明显升高。由此可见，在自身免疫性疾病中，miR-146a的表达可能有不同的复杂机制。
IL-6在甲状腺相关眼病中也有重要的作用。已有研究表明，眼眶容量与IL-6mRNA的表达呈正相关，与IL-4mRNA、IL-10mRNA呈负相关[9]。相较于非活动性甲状腺相关眼病患者，活动性甲状腺相关眼病患者血清IL-6和可溶性型IL-6受体浓度明显升高[3]。Ning等[10]发现与对照组相比，甲状腺相关眼病患者外周血的miR-146a的相对表达显着增加，而Notch2的相对表达明显降低，且 Notch2可以被miRNA-146a直接作为靶向目标。外源性miRNA-146a模拟物可下调Notch2的表达和上调IL-6。抑制miRNA-146可以导致Notch2的表达升高和IL-6的表达降低。这些结果说明miR-146a可通过直接靶向作用Notch2增加IL-6水平，从而促进甲状腺相关眼病的发展。在我们的研究中，过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-6的表达，同时抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-6的表达。 IL-8是促炎趋化因子，具有诱导中性粒细胞沿着血管壁的聚集的作用[11]。在甲状腺相关眼病中，各种类型的成纤维细胞以及这些细胞中IL-8的大量产生参与疾病炎症进展[12]。在眼眶炎症中，眼眶成纤维细胞在一些细胞因子的刺激下，如IL-1β、TNF-α、脂多糖和IFN-γ，产生剂量依赖的IL-8和MCP-1[13]。在我们的研究中，过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-8的表达，同时抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-8的表达。
过表达miR-146a可抑制眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的表达，抑制miR-146a可促进眼眶成纤维细胞中IL-6和IL-8的表达。提示miR-146a可能与甲状腺相关眼病疾病的发生发展有关。
参考文献
[1]Maheshwari R， Weis E. Thyroid associated orbitopathy. Indian journal of ophthalmology 2012;60：87-93.
[2]van Steensel L， Dik WA. The orbital fibroblast： a key player and target for therapy in graves' ophthalmopathy. Orbit 2010;29：202-6.
[3]Salvi M， Girasole G， Pedrazzoni M， et al. Increased serum concentrations of interleukin-6 （IL-6） and soluble IL-6 receptor in patients with Graves' disease. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1996;81：2976-9.
[4]Du L， Yang J， Huang J， et al. The associations between the polymorphisms in the CTLA-4 gene and the risk of Graves' disease in the Chinese population. BMC medical genetics 2013;14：46.
[5]Yang L， Boldin MP， Yu Y， et al. miR-146a controls the resolution of T cell responses in mice. The Journal of experimental medicine 2012;209：1655-70.
[6]楊文娟， 班胜刚， 何剑峰. 甲状腺相关眼病患者外周血单个核细胞中微小RNA-146a的异常表达及意义. 眼科新进展 2012：414-7.
[7]Contreras J， Rao DS. MicroRNAs in inflammation and immune responses. Leukemia 2012;26：404-13.
[8]Jang SY， Chae MK， Lee JH， et al. Role of miR-146a in the Regulation of Inflammation in an In Vitro Model of Graves' Orbitopathy. Investigative ophthalmology & visual science 2016;57：4027-34.
[9]Hiromatsu Y， Yang D， Bednarczuk T， et al. Cytokine profiles in eye muscle tissue and orbital fat tissue from patients with thyroid-associated ophthalmopathy. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 2000;85：1194-9.
[10]Wang N， Chen FE， Long ZW. Mechanism of MicroRNA-146a/Notch2 Signaling Regulating IL-6 in Graves Ophthalmopathy. Cell Physiol Biochem 2017;41：1285-97.
[11]Ghasemi H， Ghazanfari T， Yaraee R， et al. Roles of IL-8 in ocular inflammations： a review. Ocular immunology and inflammation 2011;19：401-12.
[12]Koumas L， Smith TJ， Phipps RP. Fibroblast subsets in the human orbit： Thy-1+ and Thy-1- subpopulations exhibit distinct phenotypes. European journal of immunology 2002;32：477-85.
[13]Elner VM， Burnstine MA， Kunkel SL， et al. Interleukin-8 and monocyte chemotactic protein-1 gene expression and protein production by human orbital fibroblasts. Ophthalmic plastic and reconstructive surgery 1998;14：119-25.