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摘要：通过设置不同的培养条件，检验温度、光照强度和光照周期对裙带菜雌配子体生长的影响。第一步设置3个温度条件（12℃、16℃、20℃）和5个光照强度条件（1000、1500、2000、2500、3000 lx）进行全析因方差设计，得出最适温度条件和光照强度；第二步，在最适温度条件下，设置2个光照周期（24 h持续光照和光暗周期D：L=12：12）和不同光照强度，检验不同光照强度条件和光照周期对配子体生长的影响。在以上实验的基础上，根据最适温度条件和光照周期，设置不同光照强度检验其对配子体鲜重量生长的影响。实验结果显示：裙带菜雌配子体最适宜的在温度为16℃，光照强度为2500 lx，周期为24 h持续光照。
关键词：温度；光照；光照周期，裙带菜雌配子体；生长
裙带菜（Undaria pinnatifida）是一种一年生褐藻，隶属于海带目，生活在潮下带。裙带菜是我国黄渤海海域的山东半岛、辽东半岛重要栽培海藻之一，在黄渤海海域范围内，其产业规模仅次于海带，与海带、紫菜并称中国三大经济海藻。我国产裙带菜早年主要向日本出口，近年来国内消费迅速增长，成为人们喜爱的“海洋碱性蔬菜”。裙带菜生活史分为孢子体世代和配子体世代，国内对裙带菜的基础生物学研究已经比较清楚，大大加快了国内裙带菜苗种生产的步伐。裙带菜生活史中具有明显的世代交替，分为孢子体世代和配子体世代，裙带菜苗种培育既可以利用孢子体采苗，也可以利用保存的配子体进行育苗，采用配子体克隆进行幼苗培育，可以避免只能由孢子体采苗获得配子体的季节性限制，可以随时为裙带菜遗传育种和其他基础研究提供实验材料。因此裙带菜配子体的快速扩增培养成为其有效利用的重要前提，本研究对影响裙带菜♀配子体的温度、光照强度和光照周期条件进行了实验研究，以期为裙带菜配子体克隆快速扩增培养提供基础指导。
1材料和方法
1.1材料来源
裙带菜配子体克隆细胞（♀）来自国家海藻与海参工程技术研究中心，在光照培养箱内培养条件为20±2℃，光强1 500～2 000 lx，24 h持续光照。培养液为自然海水加煮沸消毒，然后添加N和P营养盐（NaNOs 60 mg/L，KH2 P04 10mg/L），煮沸消毒后备用。
1.2实验设置
1.2.1温度和光照强度对裙带菜配子体生长影响 设置光照培养箱温度12℃、16℃和20℃，光照强度1000，1500，2000，2500和3000 lx，光照周期24 h持续光照，共15个组合，每组3个重复，共45个样本。将裙带菜配子体（雌配子体，下文提到配子体均指裙带菜雌配子体），转入100mL三角烧瓶，用超声波破碎仪（型号：JY92-IIN）打碎，经300目筛绢过滤至500 mL烧杯中。加入培养液至300 mL稀释，用移液管均匀吸入8mL分别放人45套120 mm培养皿中。培养皿装入90 mL培养液，分别进入光照培养箱内各实验组合。每5 d更换培养液一次，每次更换总体积的60%左右。持续观测4周时间。实验结束后，采用倒置显微镜对各实验组样品进行拍照（O-lympus IX51），然后利用软件Image pro测量各实验组裙带菜配子体细胞系长度。
1.2.2光照周期对配子体生长的影响 在温度和光照强度对裙带菜配子体实验研究的基础上，筛选出适合的温度条件和光照强度条件之后，根据最适温度件，设置不同光照周期和光照强度，检验不同光照周期和光照强度条件下裙带菜配子体生长和发育状态。经过上面实验发现16℃条件最适合裙带菜配子体生长。设置光照培养箱温度16℃，光照强度为1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 lx，光照周期为D：L=12：12 h和24 h持续光照，温度为16℃，共10个组合，每个组合设置3个平行，共30个样本。样本准备方法同1.2.1。培养2周之后，观测各实验条件下裙带菜配子体生长长度。
1.2.3不同光照条件下配子体生长鲜重影响温度条件定为16℃，光照周期为24D h，光照强度500、1500、2 500、3 500和4 500 lx，共5个实验组合，每个实验组合设置3个平行，共15个样本。配子体的准备方法同1.2.1，用移液管均匀吸入10 mL分别放人15个三角烧瓶中。每5 d左右更换1次培养液，每次更换量为三角烧瓶中的培养液量的60%。三角烧瓶中克隆质量相同（鲜重50 mg），培养12周后测量（分析天平XSE205DU）培养皿中克隆质量。
1.3统计分析
采用双因素方差分析检验温度和光照强度对裙带菜配子体生长的影响，以及光照周期和光照强度对配子体生长的影响。采用单因素方差分析检验光照强度对配子体鲜重生长的影响。显著水平设为P<0.05。统计分析均在SPSS13.0进行。
2实验结果
2.1温度和光照强度对裙带菜配子体生长影响
初期超声波打碎克隆受损，在所实验的3个温度条件下，光照强度低的实验组合生长较快，其中20℃更为明显；培养10 d后，16℃和2 500 lx条件下配子体细胞生长最快，温度为20℃和12℃的条件下1 500 lx的光照强度生长较好；培养21 d后，16℃和2 500 lx条件下配子体生长最快。12℃和2 500 lx条件下的配子体细胞生长较好，温度为20℃时，光照强度1500 lx的条件下的克隆细胞生长较好。经过3周的培养，最终测得在16℃和光照强度2 500 lx条件下，裙带菜配子体细胞生长长度最大平均长度达2364μm（图1）。在实验条件下，裙带菜雌配子体最适生长温度和光照强度条件分别为16℃和2 500 lx。（不同小写字母表不差异显著，ANOVA，P<0.05.平均值±标准差）
2.2光照周期对配子体生长的影响
16℃条件下，光照周期为12 L：12 D时培养前期生长较好，但是随着培养时间增长，从低光到光逐步发现裙♀配子体样本发育长出幼孢子体（图2），因此在光暗交替的光照周期为12L：12D的条件下，会诱发裙♀孤雌生长，不适宜裙带菜雌性配子体的培养。而在光照周期为24持续光照条件下，光照强度为2 000 lx时，配子体细胞系生长最快，配子体细胞最大平均长度达到680.8tim，但是2000 lx和2 500 1x实验组之间差异不显著（图3）。
2.3不同光照条件下配子体生长鲜重影响
在温度为16℃，光照周期24 h持续光照，经过7周的培养，在2 500 lx光照强度条件下，裙带菜雌配子体鲜重量生长速度最快，达到0.31 g（图4）。实验表明克隆细胞打碎平均分配12周后在光照强度为2 500 lx的条件下生长最快，质量最重。
3结论
本研究通过实验设计了不同温度、光照强度和光照周期条件，检验其对裙带菜雌配子生长的影响。实验结果显示在温度为16℃，光照周期为24 h持续光照时，光照强度为2 500 lx时，最适宜裙带菜雌配子生长。实验过程中应该注意将裙带菜配子体扩培粉碎后，应该先放人1000 lx的条件下培养5 d左右进行恢复，恢复后再分流进入各个实验组合。实验过程中还发现，裙带菜雌配子体在具有光暗周期的条件下，会产生配子体直接转化为孢子体的“孤雌生殖”现象。本实验采用的光照黑暗周期为L：D=12 h：12 h，其它光暗交替周期对裙带菜雌配子体孤雌生殖的影响有待于进一步研究。同时，裙带菜雌配子体孤雌生殖产生的幼孢子体后代长大后的形状表现也值得进一步深入研究，这或许为裙带菜新品种开发和培育提供了一种新的思路和方法。
关键词：温度；光照；光照周期，裙带菜雌配子体；生长
裙带菜（Undaria pinnatifida）是一种一年生褐藻，隶属于海带目，生活在潮下带。裙带菜是我国黄渤海海域的山东半岛、辽东半岛重要栽培海藻之一，在黄渤海海域范围内，其产业规模仅次于海带，与海带、紫菜并称中国三大经济海藻。我国产裙带菜早年主要向日本出口，近年来国内消费迅速增长，成为人们喜爱的“海洋碱性蔬菜”。裙带菜生活史分为孢子体世代和配子体世代，国内对裙带菜的基础生物学研究已经比较清楚，大大加快了国内裙带菜苗种生产的步伐。裙带菜生活史中具有明显的世代交替，分为孢子体世代和配子体世代，裙带菜苗种培育既可以利用孢子体采苗，也可以利用保存的配子体进行育苗，采用配子体克隆进行幼苗培育，可以避免只能由孢子体采苗获得配子体的季节性限制，可以随时为裙带菜遗传育种和其他基础研究提供实验材料。因此裙带菜配子体的快速扩增培养成为其有效利用的重要前提，本研究对影响裙带菜♀配子体的温度、光照强度和光照周期条件进行了实验研究，以期为裙带菜配子体克隆快速扩增培养提供基础指导。
1材料和方法
1.1材料来源
裙带菜配子体克隆细胞（♀）来自国家海藻与海参工程技术研究中心，在光照培养箱内培养条件为20±2℃，光强1 500～2 000 lx，24 h持续光照。培养液为自然海水加煮沸消毒，然后添加N和P营养盐（NaNOs 60 mg/L，KH2 P04 10mg/L），煮沸消毒后备用。
1.2实验设置
1.2.1温度和光照强度对裙带菜配子体生长影响 设置光照培养箱温度12℃、16℃和20℃，光照强度1000，1500，2000，2500和3000 lx，光照周期24 h持续光照，共15个组合，每组3个重复，共45个样本。将裙带菜配子体（雌配子体，下文提到配子体均指裙带菜雌配子体），转入100mL三角烧瓶，用超声波破碎仪（型号：JY92-IIN）打碎，经300目筛绢过滤至500 mL烧杯中。加入培养液至300 mL稀释，用移液管均匀吸入8mL分别放人45套120 mm培养皿中。培养皿装入90 mL培养液，分别进入光照培养箱内各实验组合。每5 d更换培养液一次，每次更换总体积的60%左右。持续观测4周时间。实验结束后，采用倒置显微镜对各实验组样品进行拍照（O-lympus IX51），然后利用软件Image pro测量各实验组裙带菜配子体细胞系长度。
1.2.2光照周期对配子体生长的影响 在温度和光照强度对裙带菜配子体实验研究的基础上，筛选出适合的温度条件和光照强度条件之后，根据最适温度件，设置不同光照周期和光照强度，检验不同光照周期和光照强度条件下裙带菜配子体生长和发育状态。经过上面实验发现16℃条件最适合裙带菜配子体生长。设置光照培养箱温度16℃，光照强度为1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 lx，光照周期为D：L=12：12 h和24 h持续光照，温度为16℃，共10个组合，每个组合设置3个平行，共30个样本。样本准备方法同1.2.1。培养2周之后，观测各实验条件下裙带菜配子体生长长度。
1.2.3不同光照条件下配子体生长鲜重影响温度条件定为16℃，光照周期为24D h，光照强度500、1500、2 500、3 500和4 500 lx，共5个实验组合，每个实验组合设置3个平行，共15个样本。配子体的准备方法同1.2.1，用移液管均匀吸入10 mL分别放人15个三角烧瓶中。每5 d左右更换1次培养液，每次更换量为三角烧瓶中的培养液量的60%。三角烧瓶中克隆质量相同（鲜重50 mg），培养12周后测量（分析天平XSE205DU）培养皿中克隆质量。
1.3统计分析
采用双因素方差分析检验温度和光照强度对裙带菜配子体生长的影响，以及光照周期和光照强度对配子体生长的影响。采用单因素方差分析检验光照强度对配子体鲜重生长的影响。显著水平设为P<0.05。统计分析均在SPSS13.0进行。
2实验结果
2.1温度和光照强度对裙带菜配子体生长影响
初期超声波打碎克隆受损，在所实验的3个温度条件下，光照强度低的实验组合生长较快，其中20℃更为明显；培养10 d后，16℃和2 500 lx条件下配子体细胞生长最快，温度为20℃和12℃的条件下1 500 lx的光照强度生长较好；培养21 d后，16℃和2 500 lx条件下配子体生长最快。12℃和2 500 lx条件下的配子体细胞生长较好，温度为20℃时，光照强度1500 lx的条件下的克隆细胞生长较好。经过3周的培养，最终测得在16℃和光照强度2 500 lx条件下，裙带菜配子体细胞生长长度最大平均长度达2364μm（图1）。在实验条件下，裙带菜雌配子体最适生长温度和光照强度条件分别为16℃和2 500 lx。（不同小写字母表不差异显著，ANOVA，P<0.05.平均值±标准差）
2.2光照周期对配子体生长的影响
16℃条件下，光照周期为12 L：12 D时培养前期生长较好，但是随着培养时间增长，从低光到光逐步发现裙♀配子体样本发育长出幼孢子体（图2），因此在光暗交替的光照周期为12L：12D的条件下，会诱发裙♀孤雌生长，不适宜裙带菜雌性配子体的培养。而在光照周期为24持续光照条件下，光照强度为2 000 lx时，配子体细胞系生长最快，配子体细胞最大平均长度达到680.8tim，但是2000 lx和2 500 1x实验组之间差异不显著（图3）。
2.3不同光照条件下配子体生长鲜重影响
在温度为16℃，光照周期24 h持续光照，经过7周的培养，在2 500 lx光照强度条件下，裙带菜雌配子体鲜重量生长速度最快，达到0.31 g（图4）。实验表明克隆细胞打碎平均分配12周后在光照强度为2 500 lx的条件下生长最快，质量最重。
3结论
本研究通过实验设计了不同温度、光照强度和光照周期条件，检验其对裙带菜雌配子生长的影响。实验结果显示在温度为16℃，光照周期为24 h持续光照时，光照强度为2 500 lx时，最适宜裙带菜雌配子生长。实验过程中应该注意将裙带菜配子体扩培粉碎后，应该先放人1000 lx的条件下培养5 d左右进行恢复，恢复后再分流进入各个实验组合。实验过程中还发现，裙带菜雌配子体在具有光暗周期的条件下，会产生配子体直接转化为孢子体的“孤雌生殖”现象。本实验采用的光照黑暗周期为L：D=12 h：12 h，其它光暗交替周期对裙带菜雌配子体孤雌生殖的影响有待于进一步研究。同时，裙带菜雌配子体孤雌生殖产生的幼孢子体后代长大后的形状表现也值得进一步深入研究，这或许为裙带菜新品种开发和培育提供了一种新的思路和方法。