探讨受体相互作用蛋白激酶(RIP)1和RIP3通路是否介导谷氨酸诱导的HT-22海马神经细胞死亡。
方法(1)体外培养小鼠海马神经细胞株HT-22，分为空白对照组、zVAD组、Nec-1组、谷氨酸组、谷氨酸+zVAD组、谷氨酸+zVAD+Nec-1组、谷氨酸+Nec-1组，zVAD、Nec-1、谷氨酸的终浓度分别为20 μmol/L、30 μmol/L、3 mmol/L，作用24 h后用Cell titer glo发光法细胞活力检测试剂盒(CTG)检测细胞存活率；碘化丙啶(PI)及Hoechst细胞染色检测细胞的坏死；(2)将HT-22细胞分为空白对照组、谷氨酸组、谷氨酸+Nec-1组，浓度和作用时间同上，应用MitoSox red线粒体超氧化物指示剂检测细胞线粒体内活性氧自由基(ROS)水平；(3)将HT-22细胞分为空白对照组、谷氨酸组、谷氨酸+叔丁基茴香醚(BHA)组，BHA的终浓度为100 μmol/L，作用24 h后用PI及Hoechst细胞染色检测细胞的坏死；(4)将HT-22细胞分为RIP3 siRNA组、对照组，分别转染RIP3 siRNA、siRNA对照序列，72 h后Western blotting检测2组细胞RIP3蛋白的表达；(5)将HT-22细胞分为对照组、RIP3 siRNA组、谷氨酸组、RIP3 siRNA+谷氨酸组，分别各自转染siRNA对照序列、RIP3 siRNA，48 h后加入3 mmol/L谷氨酸，24 h后用PI及Hoechst细胞染色检测细胞的坏死，CTG检测细胞存活率。
结果(1)与空白对照组比较，谷氨酸组、谷氨酸+zVAD组PI阳性细胞百分比升高，细胞存活率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与谷氨酸组比较，谷氨酸+Nec-1组PI阳性细胞百分比明显减少，细胞存活率增加，差异有统计学意义(P<0.05)；(2)谷氨酸组HT-22细胞内的ROS水平明显高于空白对照组，谷氨酸+Nec-1组细胞内的ROS水平明显低于谷氨酸组，差异有统计学意义(P<0.05)；(3)谷氨酸组PI阳性细胞百分比高于空白对照组，谷氨酸+BHA组PI阳性细胞百分比低于谷氨酸组，差异有统计学意义(P<0.05)；(4)与对照组比较，RIP3 siRNA组细胞内RIP3蛋白水平明显下调；(5)与对照组比较，谷氨酸组PI阳性细胞百分比升高、细胞存活率降低，与谷氨酸组比较，RIP3 siRNA+谷氨酸组阳性细胞百分比降低、细胞存活率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论RIP1、RIP3通路及ROS介导谷氨酸诱导的HT-22海马神经细胞死亡。