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摘要：对刺参肌动蛋白解聚因子基因进行克隆。根据获得的肌动蛋白解聚因子蛋白的保守序列设计简并引物，PCR扩增并克隆测序得到刺参肌动蛋白解聚因子蛋白基因全长ORF序列。研究发现刺参的肌动蛋白解聚因子基因的开放阅读框为435bp，编码144个氨基酸的多肽。
关键词：刺参；肌动蛋白解聚因子；基因；克隆
肌动蛋白解聚因子是一个微丝蛋白家族，由113～168个氨基酸组成，氨基酸序列之间的同源性为30%～40%，调节发育中的骨骼肌细胞肌动蛋白的聚集，具有解聚F肌动蛋白和结合G肌动蛋白能力的一种肌动蛋白结合蛋白质。
刺参，棘皮动物门，海参纲，中国海参中质量最好的一种，作为一种珍贵的海味被列为“八珍”之一[1]。刺参药性甘温无毒，以根入药，具有补气血、接筋骨，治神经官能症、贫血、肺虚咳嗽、跌打损伤和骨折，益胃，镇静，补肾，壮阳，治神经衰弱、消化不良、子宫脱垂、白带过多、阳痿等功效[2]。刺参内还含有硫酸软骨素，具有强体抗衰、抑制肿瘤的功效。
本文对刺参肌动蛋白解聚因子基因进行克隆，并且尝试使用相关生物学软件对该基因的分子特性进行研究。
1材料、试剂及仪器
本次实验所用的刺参是从盐城市响水县养殖场获得，在实验室里喂养一周后备用，将刺参分别用4℃、25℃、30℃、35℃刺激一小时，以常温处理一小时作为对照组，再从刺参里取下肠、管足、疣足、纵肌、触手、体壁、呼吸树和体腔细胞这八个组织，加入1ml trizol，将这一系列组织放入-80℃的冰箱保存，作为提取总RNA的试材。
感受态细胞是 E. coli DH5α；克隆载体是 pUCm-T；T-载体PCR产物克隆试剂盒是由生工生物工程（上海）股份有限公司生产；RNA提取所用的Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒以及PCR产物回收试剂盒均是由艾德莱生物科技公司（北京）生产。
2 方法
2.1总RNA的提取和cDNA的合成
2.1.1总RNA的提取
用剪刀和镊子剪取适量刺参组织20mg～30mg，在-80℃冷冻过的研钵中迅速研磨；在研钵中加入1ml的TRIpure Reagent 试剂，使试剂与组织充分接触，待成液体时转入1.5ml的离心管中，振荡使其充分混合，有助于细胞裂解，室温下静置5min；加入0.2ml氯仿，振荡混匀，使RNA和蛋白质分离，室温下静置5min；在4℃ 12000rmp的冷冻离心机中离心15min，离心后分层：最下层杂质，中间蛋白质，最上层RNA，取上清液至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒几次，使RNA沉淀，室温下静置10min；在4℃ 12000rmp的冷冻离心机中离心10min，弃上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀，在4℃ 12000rmp的冷冻离心机中离心3min，弃上清，晾干；待干燥后，加入0.05ml DEPC（母液稀释1000倍得到），溶解RNA；放冰箱-20℃保存待测，以防止RNA降解。
2.2.2琼脂糖凝胶电泳
称取琼脂糖0.2g，加入20ml TAE，放置微波炉加热，直至看到冒泡，停止加热，加入1.25ul EB染料，制成1%的胶。在120V下，吸取4ul样品，在1%的琼脂糖凝胶里跑15min，检测所提取的RNA是否完整，是否被提出来。
2.2 cDNA的合成
使用TUREscript cDNA合成试剂盒，对RNA进行反转录。反应体系如表1：
反应在PCR仪中进行，42℃加热50min，65℃孵育15min，得到的cDNA放置于-20℃冰箱保存备用。
2.3肌动蛋白解聚因子基因的克隆
2.3.1肌动蛋白解聚因子的扩增
通过NCBI搜索出不同物种肌动蛋白解聚因子基因的核苷酸序列，使用Clustal Omega软件做序列比对，找出高度保守的区域，最后根据保守区用Primer premier 5.0 软件来设计上下游引物（表2）扩增开放阅读框。
反应体系如表3：
PCR反应程序设置如表4：
用琼脂糖凝胶（1%）电泳检测PCR产物，切胶回收纯化目的片段，用于克隆。
2.3.2肌动蛋白解聚因子基因的回收
在紫外照射下，切下含有目的基因条带的琼脂糖凝胶，放入EP管中，加入350ul结合液，在56℃水浴锅内进行水浴溶胶；加入100ul的平衡液于DNA纯化柱中，12000rmp离心1min；将琼脂糖凝胶加入纯化柱中，12000rmp离心1min；加入WB 600ul，12000rmp離心1min；加入WB 600ul，12000rmp离心1min；将纯化柱放在空的离心管上，加入67℃ EB 50ul，静置2min，12000rmp离心1min；再次用EB洗脱，12000rmp离心1min，得到DNA。
2.3.3连接反应
连接反应体系如表5：在16℃条件下连接4小时。
2.3.4转化反应
称取2.5g LB 和1.5g琼脂粉，加水至100ml，配成100ml的固体培养基。称取1.25g LB， 加水至50ml，配成50ml的液体培养基。高温灭菌后，等温度低一点，固体培养基中还需加入50ul氨苄青霉素、60ul IPTG、180ul X-gal。倒平板备用。
取100ul的感受态细胞，置于冰上30min，完全解冻后，細胞悬浮；向感受态细胞中加入10ul的连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃水浴热激40s，冰上放置10min；加入400ul LB培养基，放在37℃ 200-250rpm震荡培养1h，吸取60ul 菌液涂平板；室温下4000rpm离心5min，用枪头吸掉400ul的上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将菌液涂布在预先倒好的固体平板上；37℃正向放置一会，再倒置过夜。 2.3.5转化子的蓝白班筛选
当外源DNA片段插入到PUCm-T后，由于外缘DNA的核酸序列的存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现白斑，而非重组克隆呈蓝斑，无载体导入的感受态细胞不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以选择在X-gal/IPTG平板上生长的白色菌落，用无菌牙签或无菌枪头挑白斑至LB液体培养基，37℃培养过夜。
2.3.6转化子的鉴定
用M13通用引物（表6）直接进行测序来确定是否含有目的克隆。
菌落PCR反应体系如表7：
菌落PCR反应程序设置如表8：
用1%的琼脂糖凝胶电泳判断是否为阳性克隆。
3.结果
3.1刺参总RNA的提取
通过凝胶成像仪看到3个条带（图1），从上到下依次是28S、18S、5S，从左到右依次是刺参的呼吸树、肠、管足、体腔细胞、疣足、纵肌、触手、体壁8个组织的泳带。
3.1刺參肌动蛋白解聚因子基因cDNA克隆
PCR扩增产物电泳结果如图2，由图可见，该目的基因的条带在450bp左右，与预测大小吻合，从条带的亮度可以看出目的基因的浓度很低，可能会影响测序，所以需要做一次克隆提升其浓度以提高测序的成功率，通过测序来判断引物是否合理，目的基因是否正确。菌液PCR产物电泳结果如图3。进行胶回收，送到北京三博远志生物技术有限公司进行测序，得到肌动蛋白解聚因子基因的片段。目的片段：
ATGCCTGTCTCTGGAATAAGCGTCACTGACGATTTAATCGAAGCTTACAATGCTATGAAAAAGGGGAAGAAGACACACTACATCAAATATGCTATCGAAAACGAAGCTCTCATAATCAAGGAAACTAAAACCATTGATGATGAGTTTGACATCAAAACCGATATACCAGGAATCTTTGACACGGAAGAGTGCTGCTACGTGGTCCTTGATTTGAAATGGGGGTCCGACTCATCAGGAAATAAGCAGAAATTGGTCTTTATTTCATGGGCTCCAGACAATGCTAAAGTTAAGGCCAAAATGTTGCACTCGAGCAGTGACGAACTCTTGAAGTCGAAACTTGAAGGCCTCGGTGCAAAGGTACAAGCAAATGATGCAAGTGAAGTCACCTATGAAGCTGTATTAGAGGCAGCCAAGCAGTATATGACGTCAAAGTAA
4.討论
肌动蛋白解聚因子家族是一类普遍存在于真核细胞中的肌动蛋白结合蛋白 ，通过切断肌动蛋白纤丝和增强肌动蛋白单体离开肌动蛋白纤丝末端的速率，控制着F肌动蛋白的装配与拆卸，调节F肌动蛋白的长度、极性、稳定性和三维结构，并将F肌动蛋白与细胞质和细胞膜的其它成分相连接，从而调节肌动蛋白的理化状态，藉以完成多种细胞功能。肌动蛋白解聚因子在维持肌动蛋白动态化过程中也起着重要的作用，其中肌动蛋白解聚因子主要与腺苷三磷酸-肌动蛋白单体结合，丝切蛋白主要分解丝状肌动蛋白，更重要的是肌动蛋白解聚因子与丝切蛋白在这一过程中很大程度上可以替代，比如其中一种蛋白的缺少引起细胞分裂和细胞运动的异常可由另一种蛋白的过度表达来弥补。近年来，随着对肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族研究的不断深入，发现它们在激活磷脂酶、携带肌动蛋白入核和诱导细胞凋亡等方面也起着重要作用。由于肌动蛋白解聚因子的重要作用，此类蛋白已经成为国内外关注的热点。
参考文献
[1] 《我国刺参养殖产业的现状与发展对策》高学文 - 《黑龙江水产》- 2013
[2] 《II西北草地野生中药材植物资源名录》汤宗孝 - 《草业与畜牧》- 2014
关键词：刺参；肌动蛋白解聚因子；基因；克隆
肌动蛋白解聚因子是一个微丝蛋白家族，由113～168个氨基酸组成，氨基酸序列之间的同源性为30%～40%，调节发育中的骨骼肌细胞肌动蛋白的聚集，具有解聚F肌动蛋白和结合G肌动蛋白能力的一种肌动蛋白结合蛋白质。
刺参，棘皮动物门，海参纲，中国海参中质量最好的一种，作为一种珍贵的海味被列为“八珍”之一[1]。刺参药性甘温无毒，以根入药，具有补气血、接筋骨，治神经官能症、贫血、肺虚咳嗽、跌打损伤和骨折，益胃，镇静，补肾，壮阳，治神经衰弱、消化不良、子宫脱垂、白带过多、阳痿等功效[2]。刺参内还含有硫酸软骨素，具有强体抗衰、抑制肿瘤的功效。
本文对刺参肌动蛋白解聚因子基因进行克隆，并且尝试使用相关生物学软件对该基因的分子特性进行研究。
1材料、试剂及仪器
本次实验所用的刺参是从盐城市响水县养殖场获得，在实验室里喂养一周后备用，将刺参分别用4℃、25℃、30℃、35℃刺激一小时，以常温处理一小时作为对照组，再从刺参里取下肠、管足、疣足、纵肌、触手、体壁、呼吸树和体腔细胞这八个组织，加入1ml trizol，将这一系列组织放入-80℃的冰箱保存，作为提取总RNA的试材。
感受态细胞是 E. coli DH5α；克隆载体是 pUCm-T；T-载体PCR产物克隆试剂盒是由生工生物工程（上海）股份有限公司生产；RNA提取所用的Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒以及PCR产物回收试剂盒均是由艾德莱生物科技公司（北京）生产。
2 方法
2.1总RNA的提取和cDNA的合成
2.1.1总RNA的提取
用剪刀和镊子剪取适量刺参组织20mg～30mg，在-80℃冷冻过的研钵中迅速研磨；在研钵中加入1ml的TRIpure Reagent 试剂，使试剂与组织充分接触，待成液体时转入1.5ml的离心管中，振荡使其充分混合，有助于细胞裂解，室温下静置5min；加入0.2ml氯仿，振荡混匀，使RNA和蛋白质分离，室温下静置5min；在4℃ 12000rmp的冷冻离心机中离心15min，离心后分层：最下层杂质，中间蛋白质，最上层RNA，取上清液至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒几次，使RNA沉淀，室温下静置10min；在4℃ 12000rmp的冷冻离心机中离心10min，弃上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀，在4℃ 12000rmp的冷冻离心机中离心3min，弃上清，晾干；待干燥后，加入0.05ml DEPC（母液稀释1000倍得到），溶解RNA；放冰箱-20℃保存待测，以防止RNA降解。
2.2.2琼脂糖凝胶电泳
称取琼脂糖0.2g，加入20ml TAE，放置微波炉加热，直至看到冒泡，停止加热，加入1.25ul EB染料，制成1%的胶。在120V下，吸取4ul样品，在1%的琼脂糖凝胶里跑15min，检测所提取的RNA是否完整，是否被提出来。
2.2 cDNA的合成
使用TUREscript cDNA合成试剂盒，对RNA进行反转录。反应体系如表1：
反应在PCR仪中进行，42℃加热50min，65℃孵育15min，得到的cDNA放置于-20℃冰箱保存备用。
2.3肌动蛋白解聚因子基因的克隆
2.3.1肌动蛋白解聚因子的扩增
通过NCBI搜索出不同物种肌动蛋白解聚因子基因的核苷酸序列，使用Clustal Omega软件做序列比对，找出高度保守的区域，最后根据保守区用Primer premier 5.0 软件来设计上下游引物（表2）扩增开放阅读框。
反应体系如表3：
PCR反应程序设置如表4：
用琼脂糖凝胶（1%）电泳检测PCR产物，切胶回收纯化目的片段，用于克隆。
2.3.2肌动蛋白解聚因子基因的回收
在紫外照射下，切下含有目的基因条带的琼脂糖凝胶，放入EP管中，加入350ul结合液，在56℃水浴锅内进行水浴溶胶；加入100ul的平衡液于DNA纯化柱中，12000rmp离心1min；将琼脂糖凝胶加入纯化柱中，12000rmp离心1min；加入WB 600ul，12000rmp離心1min；加入WB 600ul，12000rmp离心1min；将纯化柱放在空的离心管上，加入67℃ EB 50ul，静置2min，12000rmp离心1min；再次用EB洗脱，12000rmp离心1min，得到DNA。
2.3.3连接反应
连接反应体系如表5：在16℃条件下连接4小时。
2.3.4转化反应
称取2.5g LB 和1.5g琼脂粉，加水至100ml，配成100ml的固体培养基。称取1.25g LB， 加水至50ml，配成50ml的液体培养基。高温灭菌后，等温度低一点，固体培养基中还需加入50ul氨苄青霉素、60ul IPTG、180ul X-gal。倒平板备用。
取100ul的感受态细胞，置于冰上30min，完全解冻后，細胞悬浮；向感受态细胞中加入10ul的连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃水浴热激40s，冰上放置10min；加入400ul LB培养基，放在37℃ 200-250rpm震荡培养1h，吸取60ul 菌液涂平板；室温下4000rpm离心5min，用枪头吸掉400ul的上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将菌液涂布在预先倒好的固体平板上；37℃正向放置一会，再倒置过夜。 2.3.5转化子的蓝白班筛选
当外源DNA片段插入到PUCm-T后，由于外缘DNA的核酸序列的存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现白斑，而非重组克隆呈蓝斑，无载体导入的感受态细胞不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以选择在X-gal/IPTG平板上生长的白色菌落，用无菌牙签或无菌枪头挑白斑至LB液体培养基，37℃培养过夜。
2.3.6转化子的鉴定
用M13通用引物（表6）直接进行测序来确定是否含有目的克隆。
菌落PCR反应体系如表7：
菌落PCR反应程序设置如表8：
用1%的琼脂糖凝胶电泳判断是否为阳性克隆。
3.结果
3.1刺参总RNA的提取
通过凝胶成像仪看到3个条带（图1），从上到下依次是28S、18S、5S，从左到右依次是刺参的呼吸树、肠、管足、体腔细胞、疣足、纵肌、触手、体壁8个组织的泳带。
3.1刺參肌动蛋白解聚因子基因cDNA克隆
PCR扩增产物电泳结果如图2，由图可见，该目的基因的条带在450bp左右，与预测大小吻合，从条带的亮度可以看出目的基因的浓度很低，可能会影响测序，所以需要做一次克隆提升其浓度以提高测序的成功率，通过测序来判断引物是否合理，目的基因是否正确。菌液PCR产物电泳结果如图3。进行胶回收，送到北京三博远志生物技术有限公司进行测序，得到肌动蛋白解聚因子基因的片段。目的片段：
ATGCCTGTCTCTGGAATAAGCGTCACTGACGATTTAATCGAAGCTTACAATGCTATGAAAAAGGGGAAGAAGACACACTACATCAAATATGCTATCGAAAACGAAGCTCTCATAATCAAGGAAACTAAAACCATTGATGATGAGTTTGACATCAAAACCGATATACCAGGAATCTTTGACACGGAAGAGTGCTGCTACGTGGTCCTTGATTTGAAATGGGGGTCCGACTCATCAGGAAATAAGCAGAAATTGGTCTTTATTTCATGGGCTCCAGACAATGCTAAAGTTAAGGCCAAAATGTTGCACTCGAGCAGTGACGAACTCTTGAAGTCGAAACTTGAAGGCCTCGGTGCAAAGGTACAAGCAAATGATGCAAGTGAAGTCACCTATGAAGCTGTATTAGAGGCAGCCAAGCAGTATATGACGTCAAAGTAA
4.討论
肌动蛋白解聚因子家族是一类普遍存在于真核细胞中的肌动蛋白结合蛋白 ，通过切断肌动蛋白纤丝和增强肌动蛋白单体离开肌动蛋白纤丝末端的速率，控制着F肌动蛋白的装配与拆卸，调节F肌动蛋白的长度、极性、稳定性和三维结构，并将F肌动蛋白与细胞质和细胞膜的其它成分相连接，从而调节肌动蛋白的理化状态，藉以完成多种细胞功能。肌动蛋白解聚因子在维持肌动蛋白动态化过程中也起着重要的作用，其中肌动蛋白解聚因子主要与腺苷三磷酸-肌动蛋白单体结合，丝切蛋白主要分解丝状肌动蛋白，更重要的是肌动蛋白解聚因子与丝切蛋白在这一过程中很大程度上可以替代，比如其中一种蛋白的缺少引起细胞分裂和细胞运动的异常可由另一种蛋白的过度表达来弥补。近年来，随着对肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族研究的不断深入，发现它们在激活磷脂酶、携带肌动蛋白入核和诱导细胞凋亡等方面也起着重要作用。由于肌动蛋白解聚因子的重要作用，此类蛋白已经成为国内外关注的热点。
参考文献
[1] 《我国刺参养殖产业的现状与发展对策》高学文 - 《黑龙江水产》- 2013
[2] 《II西北草地野生中药材植物资源名录》汤宗孝 - 《草业与畜牧》- 2014