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【摘 要】 目的：研究藤茶提取物对人前列腺癌LNcap细胞凋亡的作用。方法：用流式 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率。结果：藤茶提取物对LNcap细胞作用24h后，细胞凋亡率显著增加，且有量效关系。结论：藤茶提取物可显著诱导LNcap细胞凋亡。
【关键词】 藤茶；前列腺癌；LNcap；细胞凋亡
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0026-02
Research on Apoptosis of LNcap Cells with the Extract of Ampelopsis
YAO Xin1 LIN Jing-yu2 NI Feng3 ZHANG Yue-fen3
1Fujian University of Trational Chinese Medicine， Fuzhou 350122，China； 2Fujian Institute ofTrational Chinese Medicine， Fuzhou 350003，China； 3Fujian Health College， Fuzhou 350101，China
Abstract：Objective To study the apoptosis effect of LNcap Cells with the extract of Ampelopsis.Method Observing the apoptosis rates of LNcap cells by Annexin V/PI fluorescent staining of Flow Cytometric Method（FCM）.Result The apoptosis rates of LNcap cells rose significantly after 24 hours，with dose-response relationship.Conclusion The extract of Ampelopsis can induse apoptosis of LNcap Cells remarkably.
Keywords：Ampelopsis；prostatic cancer；LNcap；Apoptosis
藤茶为葡萄科显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentala（Hand-Mazz）WTWang的茎叶，俗称甘露茶、白毛猴、甜茶等，在我国广西、湖南、福建等南方地区都有丰富的资源。其性凉，味甘淡，具有清热解毒的功效，民间常用于咽喉肿痛、感冒发热等 [1]。藤茶提取物中黄酮类部位平均含量超过15%，富含蛇葡萄素（ 3，5，7，3′，4，5′-六羟基-2，3 双氢黄酮醇，AMP ）等物质，是主要活性部位[2]。我们前期研究发现藤茶提取物对多种人癌细胞有抑制作用[3-5]，在此基础上，本文主要以流式 Annexin V/PI双染法观察其对人前列腺癌LNcap细胞的凋亡作用。
1 材料和仪器
11 药物 藤茶提取物为本实验室自制[6]。
12 细胞株 人前列腺癌LNcap细胞，中国科学院上海细胞库。
13 试剂 1640培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（美国Hyclone 公司）；胰酶（ 美国Gibco公司）；Annexin V/PI 双染试剂盒（美国BD公司）。
14 仪器 HERAcell 150i CO2培养箱（美国热电公司）；BCM-1000超净工作台（苏州净化设备公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；TS-100倒置显微镜（日本尼康公司）。
2 方法
21 细胞培养 将LNcap细胞置于含10%的胎牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞用于实验。
22 细胞凋亡率测定 取对数期生长的LNcap细胞接种于培养皿，37℃培养箱过夜；实验组加入适当浓度的藤茶提取物，使终浓度在25、50μg/ml，对照组加入同体积PBS；24h后镜下观察细胞形态；分别用胰酶消化各组细胞，PBS清洗，1500rpm离心5min，收集细胞；用PBS稀释细胞至浓度1×106/ml，于暗处加入Annexin V、PI各5μl，振荡混匀，室温避光15min，上流式细胞仪检测。
23 统计学处理 采用SPSS180统计软件，数据用（x±s）表示，组间的比较用单因素方差分析，P<005为差异具有统计学意义。
3 实验结果
31 细胞形态学观察 正常LNcap细胞贴壁生长良好，排列紧密，有透光性。加入藤茶提取物处理后细胞数量明显减少，部分细胞皱缩变圆，部分细胞悬浮甚至死亡。
32 细胞凋亡率 如图2，横坐标代表Annexin V-FITC的荧光强度，纵坐标代表PI荧光强度，均采用对数坐标轴。左下象限为正常细胞，右上象限为坏死细胞，右下象限为凋亡细胞。经藤茶提取物处理24h后，凋亡细胞明显比对照组多，且有量效依赖关系（表1）。坏死细胞结果类似凋亡细胞。
4 讨论
据文献报道，藤茶提取物对多种人癌细胞都有很好的抑制作用。但除本课题组外，鲜有见到关于抗前列腺癌的报道[3-4，7]。我们前期研究发现藤茶提取物在较低浓度下即对LNcap细胞有明显的增殖抑制作用，并推测凋亡诱导可能是其发挥抗肿瘤作用的一个途径。
流式Annexin V/PI 双染法是较为灵敏的细胞凋亡测定方法，通过Annexin V-FITC和PI双重荧光标记以区分正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。生长旺盛的LNcap细胞经过消化、洗涤、离心等操作也有一定比例的细胞凋亡和坏死，但发生率较低。在加入藤茶提取物处理24h即发现肿瘤细胞的凋亡率显著上升，且呈量效依赖关系。提示藤茶提取物可能激活肿瘤细胞的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。
参考文献
[1]中国科学院植物所.中国高等植物图谱补编第2册[M].北京：科学出版社，1983：242.
[2]陈晓明，倪峰.藤茶药理作用研究进展[J].海峡药学，2010，22（1）：16-17.
[3]周春权，姚欣，陈晓明，等.藤茶提取物的抗肿瘤作用研究[J].中药新药与临床药理，2011，22（6）：640-642.
[4]倪峰，姚欣，郭丹，等.蛇葡萄素对人前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响[J].中药药理与临床，2012，28（3）：39-41.
[5]倪峰，周金荣.蛇葡萄素及富含蛇葡萄素的总黄酮有效部位在制备防治前列腺癌药物中的应用：中国，ZL2008100716872[P].公告日期.
[6]周春权，倪峰，林静瑜，等.藤茶提取物的超声提取及含量测定[J].中华中医药学刊，2011， 21（ 3）：2312-2314.
[7]姚欣，倪峰，郭丹，等.蛇葡萄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与凋亡的影响[J].福建中医药大学学报，2014（1）：22-23.
（收稿日期：20150115）
【关键词】 藤茶；前列腺癌；LNcap；细胞凋亡
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0026-02
Research on Apoptosis of LNcap Cells with the Extract of Ampelopsis
YAO Xin1 LIN Jing-yu2 NI Feng3 ZHANG Yue-fen3
1Fujian University of Trational Chinese Medicine， Fuzhou 350122，China； 2Fujian Institute ofTrational Chinese Medicine， Fuzhou 350003，China； 3Fujian Health College， Fuzhou 350101，China
Abstract：Objective To study the apoptosis effect of LNcap Cells with the extract of Ampelopsis.Method Observing the apoptosis rates of LNcap cells by Annexin V/PI fluorescent staining of Flow Cytometric Method（FCM）.Result The apoptosis rates of LNcap cells rose significantly after 24 hours，with dose-response relationship.Conclusion The extract of Ampelopsis can induse apoptosis of LNcap Cells remarkably.
Keywords：Ampelopsis；prostatic cancer；LNcap；Apoptosis
藤茶为葡萄科显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentala（Hand-Mazz）WTWang的茎叶，俗称甘露茶、白毛猴、甜茶等，在我国广西、湖南、福建等南方地区都有丰富的资源。其性凉，味甘淡，具有清热解毒的功效，民间常用于咽喉肿痛、感冒发热等 [1]。藤茶提取物中黄酮类部位平均含量超过15%，富含蛇葡萄素（ 3，5，7，3′，4，5′-六羟基-2，3 双氢黄酮醇，AMP ）等物质，是主要活性部位[2]。我们前期研究发现藤茶提取物对多种人癌细胞有抑制作用[3-5]，在此基础上，本文主要以流式 Annexin V/PI双染法观察其对人前列腺癌LNcap细胞的凋亡作用。
1 材料和仪器
11 药物 藤茶提取物为本实验室自制[6]。
12 细胞株 人前列腺癌LNcap细胞，中国科学院上海细胞库。
13 试剂 1640培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（美国Hyclone 公司）；胰酶（ 美国Gibco公司）；Annexin V/PI 双染试剂盒（美国BD公司）。
14 仪器 HERAcell 150i CO2培养箱（美国热电公司）；BCM-1000超净工作台（苏州净化设备公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；TS-100倒置显微镜（日本尼康公司）。
2 方法
21 细胞培养 将LNcap细胞置于含10%的胎牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞用于实验。
22 细胞凋亡率测定 取对数期生长的LNcap细胞接种于培养皿，37℃培养箱过夜；实验组加入适当浓度的藤茶提取物，使终浓度在25、50μg/ml，对照组加入同体积PBS；24h后镜下观察细胞形态；分别用胰酶消化各组细胞，PBS清洗，1500rpm离心5min，收集细胞；用PBS稀释细胞至浓度1×106/ml，于暗处加入Annexin V、PI各5μl，振荡混匀，室温避光15min，上流式细胞仪检测。
23 统计学处理 采用SPSS180统计软件，数据用（x±s）表示，组间的比较用单因素方差分析，P<005为差异具有统计学意义。
3 实验结果
31 细胞形态学观察 正常LNcap细胞贴壁生长良好，排列紧密，有透光性。加入藤茶提取物处理后细胞数量明显减少，部分细胞皱缩变圆，部分细胞悬浮甚至死亡。
32 细胞凋亡率 如图2，横坐标代表Annexin V-FITC的荧光强度，纵坐标代表PI荧光强度，均采用对数坐标轴。左下象限为正常细胞，右上象限为坏死细胞，右下象限为凋亡细胞。经藤茶提取物处理24h后，凋亡细胞明显比对照组多，且有量效依赖关系（表1）。坏死细胞结果类似凋亡细胞。
4 讨论
据文献报道，藤茶提取物对多种人癌细胞都有很好的抑制作用。但除本课题组外，鲜有见到关于抗前列腺癌的报道[3-4，7]。我们前期研究发现藤茶提取物在较低浓度下即对LNcap细胞有明显的增殖抑制作用，并推测凋亡诱导可能是其发挥抗肿瘤作用的一个途径。
流式Annexin V/PI 双染法是较为灵敏的细胞凋亡测定方法，通过Annexin V-FITC和PI双重荧光标记以区分正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。生长旺盛的LNcap细胞经过消化、洗涤、离心等操作也有一定比例的细胞凋亡和坏死，但发生率较低。在加入藤茶提取物处理24h即发现肿瘤细胞的凋亡率显著上升，且呈量效依赖关系。提示藤茶提取物可能激活肿瘤细胞的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。
参考文献
[1]中国科学院植物所.中国高等植物图谱补编第2册[M].北京：科学出版社，1983：242.
[2]陈晓明，倪峰.藤茶药理作用研究进展[J].海峡药学，2010，22（1）：16-17.
[3]周春权，姚欣，陈晓明，等.藤茶提取物的抗肿瘤作用研究[J].中药新药与临床药理，2011，22（6）：640-642.
[4]倪峰，姚欣，郭丹，等.蛇葡萄素对人前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响[J].中药药理与临床，2012，28（3）：39-41.
[5]倪峰，周金荣.蛇葡萄素及富含蛇葡萄素的总黄酮有效部位在制备防治前列腺癌药物中的应用：中国，ZL2008100716872[P].公告日期.
[6]周春权，倪峰，林静瑜，等.藤茶提取物的超声提取及含量测定[J].中华中医药学刊，2011， 21（ 3）：2312-2314.
[7]姚欣，倪峰，郭丹，等.蛇葡萄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与凋亡的影响[J].福建中医药大学学报，2014（1）：22-23.
（收稿日期：20150115）