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摘要[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法] 用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增，找到各自引物最佳扩增条件；再用3种引物同步对模板DNA进行扩增，通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度，建立最佳扩增体系。[结果] 在最佳三重PCR反应条件下，gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带，大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。
关键词致病性副溶血性弧菌；三重PCR；gyrase基因；tdh基因；toxR基因
中图分类号TS207文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0132-02
Abstract[Objective] To establish a rapid specific triplexPCR method of pathogenic Vibrio parahaemolyticus by detecting gyrase， tdh and toxR genes simultaneously. [Method] The genomic DNA of V. parahaemolyticus ATCC33847 was amplified by three pairs of specific primers individually， the optimum amplification condition for each pair of primers was determined. Through optimizing the concentration and ratio of primers and anneal temperature， a triplexPCR method which can simultaneously amplify three target genes was established. [Result] The bands exhibiting the sequences of 91， 269 and 368 bp were amplified by gyrase，tdh，toxR respectively in an optimum triplexPCR reaction. [Conclusion] The triplexPCR method provides a new technical mean for the rapid detection of pathogenic V. parahaemolyticus.
Key wordsPathogenic Vibrio parahaemolyticus；TriplexPCR；gyrase gene；tdh gene；toxR gene
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种肠道致病性嗜盐菌，广泛存在于鱼、虾、蟹和贝类等海产品中[1-2]。人若误食被副溶血性弧菌污染的海产品，可出现呕吐、腹泻、肠痉挛、发烧等症状，严重会发生休克[3]。在我国沿海省份夏秋季节，由副溶血性弧菌引起的食物中毒，已高居细菌性食物中毒首位[4]。据报道，自然环境中分离的副溶血性弧菌有95%是非致病性的，只有5%是致病性的[5-6]。因此，探索研究致病性副溶血性弧菌的快速检测技术具有重要意义。
传统的致病性副溶血性弧菌检测方法包括分离培养、生化鉴定和血清学实验[7-9]，整个过程存在工作量大、周期长、操作复杂、成本高等问题。而分子检测技术因反应快速、操作简便、特异性强和灵敏度高等优点，已被越来越多地应用。近年来，以检测副溶血性弧菌特异性靶基因为目标的分子检测技术得到了快速发展。黄晨阳等[10]建立了基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法；岳友宏等[11]开发了同时检测副溶血性弧菌tlh和tdh基因的双重PCR检测方法；陈丽萍等[12]建立了同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。
toxR（跨膜转录激活蛋白）基因是近年来在副溶血性弧菌中发现的新的致病基因，其参与毒力基因的转运和表达，与副溶血性弧菌的致病性和毒力密切相关[10]。tdh（热稳定性直接溶血素）基因编码的耐热直接溶血毒素，具有直接溶血活性，可以引起红细胞溶血，毒力较强[13]。该研究以副溶血性弧菌toxR、tdh和保守基因gyrase为靶基因，通过优化3种靶基因的引物浓度、引物间比例以及退火温度，建立在1个反应管中同步扩增gyrase、tdh、toxR 3种目标基因的三重PCR检测方法。
1材料与方法
1.1供试菌株副溶血性弧菌标准菌株ATCC 33847，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.2主要仪器和试剂2720 Thermal Cycler PCR仪、BIO-RAD Sub-Cell GT 型电泳仪、HIR AYAMA HVE-50高压蒸汽灭菌器、BSC-1000ⅡA2生物安全柜、Gel DocTM XR 170-8170凝胶成像分析系统、Eppendorf Centrifuge 5424高速离心机、HS-800D恒温水浴锅等。
Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000、10×PCR Buffer、细菌基因组DNA提纯试剂盒，均购自上海生工生物工程有限公司。
1.3引物以副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR为靶基因，利用DNAman软件设计引物[14-16]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列见表1。
1.4副溶血性弧菌DNA模板的制备取纯培养菌株接种于3% NaCl碱性蛋白胨水，（37±1）℃培养18 h。吸取表层菌液1 mL放入1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清，無菌双蒸水清洗2次，弃上清，然后用细菌基因组DNA纯化试剂盒提取副溶血性弧菌的基因组DNA。 1.5单一及三重PCR反应体系的建立用gyrase、tdh、toxR这3种基因设计的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC 33847标准菌株的模板DNA进行单一扩增；再用上述3种引物同步对模板DNA进行扩增，通过对PCR各循环参数和各试剂浓度等进行优化，筛选出三重PCR反应的最佳反应条件。
2结果与分析
2.1单重PCR扩增条件的确定以副溶血性弧菌ATCC 33847标准菌株DNA为模板，分别用gyrase、tdh、toxR这3种基因的特异性引物进行扩增，确定了各自PCR的最佳反应条件。
副溶血性弧菌gyrase靶基因PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。25.00 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
副溶血性弧菌tdh靶基因PCR反應条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2500 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
副溶血性弧菌toxR靶基因PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2500 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
gyrase、tdh和toxR 均扩增出清晰条带，大小分别与预期的91、269、368 bp 结果相符（图1）。
2.2三重 PCR 反应条件的确定在单重PCR研究的基础上，对三重PCR反应体系条件进行优化，确定最佳反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。最佳反应体系（25.00 μL）：模板DNA 2.00 μL，10 μmol/L gyrase基因的上下游引物各0.25 μL，10 μmol/L tdh基因的上下游引物各0.50 μL，10 μmol/L toxR基因的上下游引物各0.75 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.50 μL，Taq酶0.50 μL，补充ddH2O至25.00 μL。
在最佳反应条件下，三重PCR扩增的目的条带与预期结果相符（图2）。
3结论
该试验以副溶血性弧菌的保守基因gyrase与特异性致病基因tdh、toxR为靶基因，设计了3对特异性引物，分别进行3种基因单一及三重PCR检测，结果以gyrase、tdh、toxR基因为单一靶基因分别可以扩增出91、269、368 bp条带；同时，通过优化3种靶基因的引物浓度、引物间比例以及退火温度，建立了在1个反应管中同步扩增3种目标基因的三重PCR检测方法。该研究建立的三重PCR检测方法可用于快速检测水产品中的致病性副溶血性弧菌，对提高应对因副溶血性弧菌污染而引起的食品安全事故的响应速度，加强水产品副溶血性弧菌污染状况应急监测具有重要意义。
参考文献
[1] 石椿丽.从进境的海产品中检出副溶血性弧菌[J].福建畜牧兽医，2010，32（3）：4-5.
[2] 何玉芳，裘伟康，郭智成，等.杭州市不同样品中副溶血性弧菌污染状况检测[J].中国公共卫生，2007，23（6）：745-746.
[3] YAMAZAKI W，ISHIBASHI M，KAWAHARA R，et al.Development of a loopmediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus[J].BMC Microbiology，2008，8（1）：163.
[4] 李晓虹，闫东丽.利用多重PCR检测食品中副溶血性弧菌的方法研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17（11）：1975-1977.
[5] JONES J L，VICKERY M C，BLACKSTONE G M，et al.Development of a multiplex realtime PCR assay with an internal amplication control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in oystera[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（18）：5840-5847.
[6] CAI T X，JIANG L Y，YANG C B，et al.Application of realtime PCR for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus from seafood in eastern China[J].FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，46（2）：180-186. [7] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品微生物学检测 副溶血性弧菌检验：GB/T 4789.7—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.
[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.饲料中副溶血性弧菌的检测：GB/T 26426—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[9] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中副溶血性弧菌检测方法：SN/T 0173—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[10] 黄晨阳，于龙，兰智杰，等.基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立[J].河南预防医学杂志，2013，24（5）：327-330.
[11] 岳友宏，苏良.双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用[J].实用预防医学，2012，19（9）：1413-1415.
[12] 陈丽萍，刘忠民，陈芸，等.特异性三重PCR快速检测副溶血性弧菌[J].微生物学通报，2014，41（4）：764-775.
[13] 黄晓蓉，吕海沧，郑晶，等.副溶血弧菌的多重PCR检测[J].食品科学，2006，27（10）：445-446.
[14] 中華人民共和国国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光PCR方法：SN/T 2424—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[15] FDA.Bacteriological analytical manual online chapter 9[S].Seventh Edition.American：Food and Drug Administration，2004.
[16] KIM Y B，OKUDA J，MATSUMOTO C，et al.Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J].Journal of clinical microbiology，1999，37（4）：1173-1177.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（14）：141-143，170
关键词致病性副溶血性弧菌；三重PCR；gyrase基因；tdh基因；toxR基因
中图分类号TS207文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0132-02
Abstract[Objective] To establish a rapid specific triplexPCR method of pathogenic Vibrio parahaemolyticus by detecting gyrase， tdh and toxR genes simultaneously. [Method] The genomic DNA of V. parahaemolyticus ATCC33847 was amplified by three pairs of specific primers individually， the optimum amplification condition for each pair of primers was determined. Through optimizing the concentration and ratio of primers and anneal temperature， a triplexPCR method which can simultaneously amplify three target genes was established. [Result] The bands exhibiting the sequences of 91， 269 and 368 bp were amplified by gyrase，tdh，toxR respectively in an optimum triplexPCR reaction. [Conclusion] The triplexPCR method provides a new technical mean for the rapid detection of pathogenic V. parahaemolyticus.
Key wordsPathogenic Vibrio parahaemolyticus；TriplexPCR；gyrase gene；tdh gene；toxR gene
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种肠道致病性嗜盐菌，广泛存在于鱼、虾、蟹和贝类等海产品中[1-2]。人若误食被副溶血性弧菌污染的海产品，可出现呕吐、腹泻、肠痉挛、发烧等症状，严重会发生休克[3]。在我国沿海省份夏秋季节，由副溶血性弧菌引起的食物中毒，已高居细菌性食物中毒首位[4]。据报道，自然环境中分离的副溶血性弧菌有95%是非致病性的，只有5%是致病性的[5-6]。因此，探索研究致病性副溶血性弧菌的快速检测技术具有重要意义。
传统的致病性副溶血性弧菌检测方法包括分离培养、生化鉴定和血清学实验[7-9]，整个过程存在工作量大、周期长、操作复杂、成本高等问题。而分子检测技术因反应快速、操作简便、特异性强和灵敏度高等优点，已被越来越多地应用。近年来，以检测副溶血性弧菌特异性靶基因为目标的分子检测技术得到了快速发展。黄晨阳等[10]建立了基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法；岳友宏等[11]开发了同时检测副溶血性弧菌tlh和tdh基因的双重PCR检测方法；陈丽萍等[12]建立了同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。
toxR（跨膜转录激活蛋白）基因是近年来在副溶血性弧菌中发现的新的致病基因，其参与毒力基因的转运和表达，与副溶血性弧菌的致病性和毒力密切相关[10]。tdh（热稳定性直接溶血素）基因编码的耐热直接溶血毒素，具有直接溶血活性，可以引起红细胞溶血，毒力较强[13]。该研究以副溶血性弧菌toxR、tdh和保守基因gyrase为靶基因，通过优化3种靶基因的引物浓度、引物间比例以及退火温度，建立在1个反应管中同步扩增gyrase、tdh、toxR 3种目标基因的三重PCR检测方法。
1材料与方法
1.1供试菌株副溶血性弧菌标准菌株ATCC 33847，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.2主要仪器和试剂2720 Thermal Cycler PCR仪、BIO-RAD Sub-Cell GT 型电泳仪、HIR AYAMA HVE-50高压蒸汽灭菌器、BSC-1000ⅡA2生物安全柜、Gel DocTM XR 170-8170凝胶成像分析系统、Eppendorf Centrifuge 5424高速离心机、HS-800D恒温水浴锅等。
Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000、10×PCR Buffer、细菌基因组DNA提纯试剂盒，均购自上海生工生物工程有限公司。
1.3引物以副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR为靶基因，利用DNAman软件设计引物[14-16]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列见表1。
1.4副溶血性弧菌DNA模板的制备取纯培养菌株接种于3% NaCl碱性蛋白胨水，（37±1）℃培养18 h。吸取表层菌液1 mL放入1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清，無菌双蒸水清洗2次，弃上清，然后用细菌基因组DNA纯化试剂盒提取副溶血性弧菌的基因组DNA。 1.5单一及三重PCR反应体系的建立用gyrase、tdh、toxR这3种基因设计的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC 33847标准菌株的模板DNA进行单一扩增；再用上述3种引物同步对模板DNA进行扩增，通过对PCR各循环参数和各试剂浓度等进行优化，筛选出三重PCR反应的最佳反应条件。
2结果与分析
2.1单重PCR扩增条件的确定以副溶血性弧菌ATCC 33847标准菌株DNA为模板，分别用gyrase、tdh、toxR这3种基因的特异性引物进行扩增，确定了各自PCR的最佳反应条件。
副溶血性弧菌gyrase靶基因PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。25.00 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
副溶血性弧菌tdh靶基因PCR反應条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2500 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
副溶血性弧菌toxR靶基因PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2500 μL反应体系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。
gyrase、tdh和toxR 均扩增出清晰条带，大小分别与预期的91、269、368 bp 结果相符（图1）。
2.2三重 PCR 反应条件的确定在单重PCR研究的基础上，对三重PCR反应体系条件进行优化，确定最佳反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。最佳反应体系（25.00 μL）：模板DNA 2.00 μL，10 μmol/L gyrase基因的上下游引物各0.25 μL，10 μmol/L tdh基因的上下游引物各0.50 μL，10 μmol/L toxR基因的上下游引物各0.75 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.50 μL，Taq酶0.50 μL，补充ddH2O至25.00 μL。
在最佳反应条件下，三重PCR扩增的目的条带与预期结果相符（图2）。
3结论
该试验以副溶血性弧菌的保守基因gyrase与特异性致病基因tdh、toxR为靶基因，设计了3对特异性引物，分别进行3种基因单一及三重PCR检测，结果以gyrase、tdh、toxR基因为单一靶基因分别可以扩增出91、269、368 bp条带；同时，通过优化3种靶基因的引物浓度、引物间比例以及退火温度，建立了在1个反应管中同步扩增3种目标基因的三重PCR检测方法。该研究建立的三重PCR检测方法可用于快速检测水产品中的致病性副溶血性弧菌，对提高应对因副溶血性弧菌污染而引起的食品安全事故的响应速度，加强水产品副溶血性弧菌污染状况应急监测具有重要意义。
参考文献
[1] 石椿丽.从进境的海产品中检出副溶血性弧菌[J].福建畜牧兽医，2010，32（3）：4-5.
[2] 何玉芳，裘伟康，郭智成，等.杭州市不同样品中副溶血性弧菌污染状况检测[J].中国公共卫生，2007，23（6）：745-746.
[3] YAMAZAKI W，ISHIBASHI M，KAWAHARA R，et al.Development of a loopmediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus[J].BMC Microbiology，2008，8（1）：163.
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[5] JONES J L，VICKERY M C，BLACKSTONE G M，et al.Development of a multiplex realtime PCR assay with an internal amplication control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in oystera[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（18）：5840-5847.
[6] CAI T X，JIANG L Y，YANG C B，et al.Application of realtime PCR for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus from seafood in eastern China[J].FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，46（2）：180-186. [7] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品微生物学检测 副溶血性弧菌检验：GB/T 4789.7—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.
[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.饲料中副溶血性弧菌的检测：GB/T 26426—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[9] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中副溶血性弧菌检测方法：SN/T 0173—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[10] 黄晨阳，于龙，兰智杰，等.基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立[J].河南预防医学杂志，2013，24（5）：327-330.
[11] 岳友宏，苏良.双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用[J].实用预防医学，2012，19（9）：1413-1415.
[12] 陈丽萍，刘忠民，陈芸，等.特异性三重PCR快速检测副溶血性弧菌[J].微生物学通报，2014，41（4）：764-775.
[13] 黄晓蓉，吕海沧，郑晶，等.副溶血弧菌的多重PCR检测[J].食品科学，2006，27（10）：445-446.
[14] 中華人民共和国国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光PCR方法：SN/T 2424—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[15] FDA.Bacteriological analytical manual online chapter 9[S].Seventh Edition.American：Food and Drug Administration，2004.
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