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摘要 [目的]建立在毛细管微反应器中快速萃取结合荧光光谱法测定全血中异丙酚含量的新方法。[方法]优化的条件为：5 ml环己烷为萃取剂，1 ml甲醇为沉淀剂，萃取3 min。[结果]在优化条件下异丙酚的平均萃取率大于99%，方法的线性范围为0.05～10.00 μg/ml。日内相对标准偏差小于2%。[结论]毛细管微反应器萃取血样中异丙酚的方法方便、可行。
关键词 异丙酚；全血；毛细管微反应器；萃取
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-023-02
异丙酚是一新型全身静脉麻醉药，因其起效迅速、作用短暂、复常良好且不良反应少，麻醉过程平稳、易于控制，其清除率高且有较高的脂溶性，连续长时间使用后并不出现药物体内明显的蓄积[1-3]。这是一种较好的靶控输注系统药物。异丙酚在体内代谢速度快，个体差异大，需要快速对异丙酚血药浓度进行监测。异丙酚血液样品的前处理方法主要有沉淀法、液-液萃取法及固相萃取法[4]，但操作繁琐，不利于样品的快速分析。建立快速异丙酚的前处理方法，对临床用药的安全、有效具有重要意义[5]。该研究利用在毛细管微反应器中的螺旋运动[6-7]，在短时间内实现样品的高效分配，分离后静置，直接取样分析，但目前涉及毛细管微反应器中萃取方法尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 溶液配制 分别精密称取3.12 g磷酸二氢钠、7.16 g磷酸氢二钠，用蒸馏水定容到 100 ml容量瓶，浓度均为0.2 mol/L。然后，量取0.2 mol/L磷酸二氢钠51 ml和0.2 mol/L磷酸氢二钠49 ml，混合，用pH计调节，配成pH 6.8缓冲液。
准确称取10 mg异丙酚，用甲醇溶解，并且定容至10 ml，配制成1 000 μg/ml 异丙酚储备液。标准溶液由一定体积的储备液稀释制得。
1.2 样品测定 试验装置见图1。首先从3号通道吸取 1 ml甲醇，注入集液瓶，其次从2号通道吸取 1.0 ml SD大鼠新鲜全血，然后从5号通道吸取1 ml磷酸盐缓冲液，最后从4号通道吸取5 ml环己烷，在毛细管中混合，充分混合后从1号排出，静置3 min，用微量进样器吸取上层有机层进行荧光分析（狭缝 3 nm/5 nm，OR=3；激发波长λex=262 nm，发射波长λem=285 nm）。加标样品除在样品中加入实量异丙酚外，其他步骤同上。
2 结果与分析
2.1 萃取条件优化
2.1.1 萃取剂种类与用量。分别以环己烷、环己烷∶正丁醇（95∶5）各5 ml为萃取剂，以1 ml 甲醇为沉淀剂，研究它们对2.5 μg/ml异丙酚血样萃取效果的影响。由表1可知，萃取剂对异丙酚血样均有一定程度的萃取能力，相应的萃取率分别为 100.8%、106.6%，RSD分别为9.8%、25.2%。环己烷∶正丁醇萃取率较高，但是RSD较高。因此，选择环己烷作为萃取剂。然而，在保证环己烷对目标物具有较好萃取率且降低环境毒性的条件下，其用量应尽可能少。因此，考察环己烷用量 （3.5、4.0、5.0和6.0 ml）对异丙酚萃取的影响。结果表明，当环己烷用量小于5.0 ml时，异丙酚的萃取率随着环己烷用量的增加而大幅度增加；当环己烷用量大于5.0 ml时，异丙酚的萃取率增加幅度较小。因此，环己烷的最佳用量为5.0 ml。
2.1.2 萃取时间。由表2可知，最佳萃取时间为3 min，平均萃取率为98.5%，RSD为16.8%。
2.1.3 毛细管的长度与直径。由表3可知，最佳萃取长度为1.0 m，平均萃取率为100.2%，RSD为9.32%。与此同时，考察了毛细管直径（0.762、1.000、0.508 mm）对异丙酚萃取率的影响。由表4可知，最佳萃取直径为0.762 mm，平均萃取率为102.0%，RSD为4.07%。
2.1.4 蛋白沉淀剂的种类及用量。在保证蛋白质具有较好沉淀效果且降低对环境污染的情况下，用量应尽可能少。因此，考察甲醇用量（1.0 、2.0 、3.0 ml）对异丙酚萃取率的影响。结果表明，1.0 ml甲醇具有较好的萃取率。
2.2 方法学验证
2.2.1 标准曲线。配制异丙酚标准品的甲醇溶液（2.5 μl/ml），得到光谱图。由图2可知，异丙酚最大发射波长位于285 nm。将异丙酚标准液与新鲜加肝素的SD大鼠全血混合，配制成浓度分别为0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/ml的样品溶液，并按照“1.1”中的步骤测定其荧光强度。以异丙酚浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得回归方程Y=13.576X+10.112，r=0.995 8，线性范围为0.05～10.0 μg/ ml（表5）。
2.2.2 精密度试验。制备2.5 μg/ml异丙酚全血样品，日内测定3次，RSD为1.43%。由此可知，该方法精密度良好。
2.2.3 回收率。向1.0 ml新鲜加肝素空白全血中加入50 μl 60 μg/ml异丙酚注射乳剂甲醇溶液，使本底样品浓度为3.00 μg；分别加入0.5、2.5、5.0 μg异丙酚标准品溶液，并且按照“1.2”中的步骤测定其荧光强度。由表6可知，该方法的回收率良好。
2.3 与传统液-液萃取方法的比较 由表7可知，该方法借助简便的毛细管微反应器对异丙酚进行萃取，操作步骤简单，萃取时间短，萃取率较高，为异丙酚生物样品的在线前处理提供可能。
3 结论
异丙酚主要分布在全血中，血浆药物浓度远低于全血药物浓度，因此选用全血作为分析测试对象。该研究建立了一种操作简便、萃取时间短、样品萃取率高的全血样品前处理方法，通过毛细玻璃管萃取后再加入蛋白沉淀剂，静置，直接取样分析。但是，浓度10%三氯乙酸甲醇溶液、浓度6%高氯酸甲醇溶液能够破坏红细胞，使得测定结果不能正确反映萃取结果，所以沉淀剂选用甲醇。
参考文献
[1] 曹林，赵建生.丙泊酚对脂代谢的影响[J].淮海医药，2015（2）：212-214.
[2] 谷昆峰，杨光耀，姜博，等.异丙酚Schnider药代动力学参数靶控输注的效果评价[J].中国医药，2013，8（8）：1164-1165.
[3] 王纤汝，李魏嶙.异丙酚光纤荧光检测系统的改进[J].中国医院药学杂志， 2010，3（6）：509-511.
[4] 张延柳，宫玉蕾，张奇，等.用RP-HPLC法测定人血浆中丙泊酚浓度[J].药学服务与研究，2013，13（5）：373-376.
[5] 李莉.光纤传感-分子印迹-荧光分析法在线监测异丙酚浓度的研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2007.
[6] JIN J，TENG P，LIU H L， et al.Microfluidics assisted synthesis and bioevaluation of sinomenine derivatives as antiinflammatory agents[J].European Journal of Medicinal Chemistry，2013，62：280-288.
[7] JIN J，CAI M M，LI J X，et al.Efficient suzuki coupling of aryl chlorides in a continuous flow capillary microreactor[J].Synlett，2009（15）：2534-2538.
关键词 异丙酚；全血；毛细管微反应器；萃取
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-023-02
异丙酚是一新型全身静脉麻醉药，因其起效迅速、作用短暂、复常良好且不良反应少，麻醉过程平稳、易于控制，其清除率高且有较高的脂溶性，连续长时间使用后并不出现药物体内明显的蓄积[1-3]。这是一种较好的靶控输注系统药物。异丙酚在体内代谢速度快，个体差异大，需要快速对异丙酚血药浓度进行监测。异丙酚血液样品的前处理方法主要有沉淀法、液-液萃取法及固相萃取法[4]，但操作繁琐，不利于样品的快速分析。建立快速异丙酚的前处理方法，对临床用药的安全、有效具有重要意义[5]。该研究利用在毛细管微反应器中的螺旋运动[6-7]，在短时间内实现样品的高效分配，分离后静置，直接取样分析，但目前涉及毛细管微反应器中萃取方法尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 溶液配制 分别精密称取3.12 g磷酸二氢钠、7.16 g磷酸氢二钠，用蒸馏水定容到 100 ml容量瓶，浓度均为0.2 mol/L。然后，量取0.2 mol/L磷酸二氢钠51 ml和0.2 mol/L磷酸氢二钠49 ml，混合，用pH计调节，配成pH 6.8缓冲液。
准确称取10 mg异丙酚，用甲醇溶解，并且定容至10 ml，配制成1 000 μg/ml 异丙酚储备液。标准溶液由一定体积的储备液稀释制得。
1.2 样品测定 试验装置见图1。首先从3号通道吸取 1 ml甲醇，注入集液瓶，其次从2号通道吸取 1.0 ml SD大鼠新鲜全血，然后从5号通道吸取1 ml磷酸盐缓冲液，最后从4号通道吸取5 ml环己烷，在毛细管中混合，充分混合后从1号排出，静置3 min，用微量进样器吸取上层有机层进行荧光分析（狭缝 3 nm/5 nm，OR=3；激发波长λex=262 nm，发射波长λem=285 nm）。加标样品除在样品中加入实量异丙酚外，其他步骤同上。
2 结果与分析
2.1 萃取条件优化
2.1.1 萃取剂种类与用量。分别以环己烷、环己烷∶正丁醇（95∶5）各5 ml为萃取剂，以1 ml 甲醇为沉淀剂，研究它们对2.5 μg/ml异丙酚血样萃取效果的影响。由表1可知，萃取剂对异丙酚血样均有一定程度的萃取能力，相应的萃取率分别为 100.8%、106.6%，RSD分别为9.8%、25.2%。环己烷∶正丁醇萃取率较高，但是RSD较高。因此，选择环己烷作为萃取剂。然而，在保证环己烷对目标物具有较好萃取率且降低环境毒性的条件下，其用量应尽可能少。因此，考察环己烷用量 （3.5、4.0、5.0和6.0 ml）对异丙酚萃取的影响。结果表明，当环己烷用量小于5.0 ml时，异丙酚的萃取率随着环己烷用量的增加而大幅度增加；当环己烷用量大于5.0 ml时，异丙酚的萃取率增加幅度较小。因此，环己烷的最佳用量为5.0 ml。
2.1.2 萃取时间。由表2可知，最佳萃取时间为3 min，平均萃取率为98.5%，RSD为16.8%。
2.1.3 毛细管的长度与直径。由表3可知，最佳萃取长度为1.0 m，平均萃取率为100.2%，RSD为9.32%。与此同时，考察了毛细管直径（0.762、1.000、0.508 mm）对异丙酚萃取率的影响。由表4可知，最佳萃取直径为0.762 mm，平均萃取率为102.0%，RSD为4.07%。
2.1.4 蛋白沉淀剂的种类及用量。在保证蛋白质具有较好沉淀效果且降低对环境污染的情况下，用量应尽可能少。因此，考察甲醇用量（1.0 、2.0 、3.0 ml）对异丙酚萃取率的影响。结果表明，1.0 ml甲醇具有较好的萃取率。
2.2 方法学验证
2.2.1 标准曲线。配制异丙酚标准品的甲醇溶液（2.5 μl/ml），得到光谱图。由图2可知，异丙酚最大发射波长位于285 nm。将异丙酚标准液与新鲜加肝素的SD大鼠全血混合，配制成浓度分别为0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/ml的样品溶液，并按照“1.1”中的步骤测定其荧光强度。以异丙酚浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得回归方程Y=13.576X+10.112，r=0.995 8，线性范围为0.05～10.0 μg/ ml（表5）。
2.2.2 精密度试验。制备2.5 μg/ml异丙酚全血样品，日内测定3次，RSD为1.43%。由此可知，该方法精密度良好。
2.2.3 回收率。向1.0 ml新鲜加肝素空白全血中加入50 μl 60 μg/ml异丙酚注射乳剂甲醇溶液，使本底样品浓度为3.00 μg；分别加入0.5、2.5、5.0 μg异丙酚标准品溶液，并且按照“1.2”中的步骤测定其荧光强度。由表6可知，该方法的回收率良好。
2.3 与传统液-液萃取方法的比较 由表7可知，该方法借助简便的毛细管微反应器对异丙酚进行萃取，操作步骤简单，萃取时间短，萃取率较高，为异丙酚生物样品的在线前处理提供可能。
3 结论
异丙酚主要分布在全血中，血浆药物浓度远低于全血药物浓度，因此选用全血作为分析测试对象。该研究建立了一种操作简便、萃取时间短、样品萃取率高的全血样品前处理方法，通过毛细玻璃管萃取后再加入蛋白沉淀剂，静置，直接取样分析。但是，浓度10%三氯乙酸甲醇溶液、浓度6%高氯酸甲醇溶液能够破坏红细胞，使得测定结果不能正确反映萃取结果，所以沉淀剂选用甲醇。
参考文献
[1] 曹林，赵建生.丙泊酚对脂代谢的影响[J].淮海医药，2015（2）：212-214.
[2] 谷昆峰，杨光耀，姜博，等.异丙酚Schnider药代动力学参数靶控输注的效果评价[J].中国医药，2013，8（8）：1164-1165.
[3] 王纤汝，李魏嶙.异丙酚光纤荧光检测系统的改进[J].中国医院药学杂志， 2010，3（6）：509-511.
[4] 张延柳，宫玉蕾，张奇，等.用RP-HPLC法测定人血浆中丙泊酚浓度[J].药学服务与研究，2013，13（5）：373-376.
[5] 李莉.光纤传感-分子印迹-荧光分析法在线监测异丙酚浓度的研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2007.
[6] JIN J，TENG P，LIU H L， et al.Microfluidics assisted synthesis and bioevaluation of sinomenine derivatives as antiinflammatory agents[J].European Journal of Medicinal Chemistry，2013，62：280-288.
[7] JIN J，CAI M M，LI J X，et al.Efficient suzuki coupling of aryl chlorides in a continuous flow capillary microreactor[J].Synlett，2009（15）：2534-2538.