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摘要 采用水提醇沉法提取矮冷水花多糖，以多糖得率为指标，考察提取时间、提取温度、料液比及提取次数对多糖提取率的影响，在单因素试验基础上采用正交试验优化提取工艺参数。通过测定矮冷水花多糖清除·OH自由基能力，1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及螯合力來评价其抗氧化活性。结果表明，矮冷水花多糖水提取的最佳工艺条件为提取温度100 ℃、提取时间4 h、料液比1∶40（g/mL）、提取次数4次，在该条件下，矮冷水花多糖的提取率为1.19%，以正交试验极差分析得出温度对矮冷水花粗多糖提取影响最大。矮冷水花多糖清除DPPH自由基、·OH自由基及金属螯合力均随多糖浓度的增加而上升；1.28 mg/mL的多糖对DPPH自由基的清除率达70.7%，对羟基自由基的清除率为41.1%，1.28 mg/mL多糖的金属螯合力在562 nm下吸光值为0.98。因此，矮冷水花多糖有较强的抗氧化能力。
关键词 矮冷水花；多糖；提取；抗氧化活性
中图分类号 S567.239 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）15-0255-03
Abstract The polysaccharides of Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn. was extracted by water extraction-alcohol precipitation method. The extraction process was optimized by investigating polysaccharide yield as the response value of extraction time，extraction temperature，solid to solvent ratio and extraction time. Based on the results of single-factor experiments，orthogonal array experiments were carried out to determine the optimum process parameters. The antioxidant capacity of polysaccharides of Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn. was evaluated by the scavenging activities against 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH），hydroxyl free radical（·OH）and chelating ability assays. The results showed that the best conditions for water extraction-alcohol precipitation were determined as follows：extraction temperature was 100 ℃；the time was 4 h；solid to liquid ratio was 1∶40（g/mL）；and the extraction time was 4 times，the extraction ration reached 1.19%.The scavenging capacity of ·OH，DPPH and chelating ability increased with the increasing concentration of polysaccharide. 1.28 mg/mL concentration of polysaccharide had 70.7% scavenging ratio of DPPH，and 41.1% scavenging ratio of ·OH，absorbance at 562 nm of chelating ability was 0.98 when the concentration of polysaccharide was 1.28 mg/mL. From the results it could be concluded that polysaccharide from Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn. had significant antioxidant activity in vitro.
Key words Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn.；polysaccharides；extraction；antioxidant activity
矮冷水花[Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn.]属于荨麻科植物，为一年生草本植物，别名地油仔、苔水花。生长在田埂、山沟、园地、石缝、树下等阴湿处，常被作为蔬菜食用[1]。因具有清热解毒、祛痰止痛等功效，民间用于清热解毒、祛瘀止痛、毒蛇咬伤和疮疖等症[2]。矮冷水花适应性强、分布广，资源丰富，具有巨大潜在开发价值。笔者所在实验室对矮冷水花化学成分进行初步研究表明，矮冷水花中含有多糖、皂苷、多肽、鞣质、有机酸、香豆素等成分。
本研究对矮冷水花多糖提取工艺和抗氧化活性进行研究，以期为矮冷水花多糖在食品、医药、饲料等行业的应用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试材。矮冷水花采自贵阳市乌当区，经教授鉴定为荨麻科植物矮冷水花[Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn.]。DPPH[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、铁氰化钾、氯化亚铁、葡萄糖、磷酸氢钾、VC等均为国产分析纯。 1.1.2 试验仪器。恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司），真空抽滤机（郑州长城科工贸有限公司），电子天平（上海精密科技仪器有限公司），冻干机（河南兄弟仪器设备有限公司），分光光度计（上海精密科技仪器有限公司），离心机（江苏正基仪器有限公司），干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 多糖得率测定与计算。多糖含量以苯酚-硫酸法测定[3]。以干燥至恒质量的葡萄糖配制标准液，于490 nm波长处测得的吸光度，绘制标准曲线，得葡萄糖标准曲线方程，计算多糖得率。
1.2.2 单因素试验和正交试验设计。参照杨 林等[3]的方法设置单因素试验：考察提取温度、提取时间、料液比和提取次数对多糖提取率的影响。每组试验重复3次。
在单因素试验的基础上，以矮冷水花多糖提取率为响应值，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）为试验因素，对矮冷水花多糖提取工艺进行优化研究（表1）。
1.2.3 矮冷水花多糖脱色脱蛋白纯化及纯度检测。将矮冷水花粗多糖以活性炭脱色[4]、saveage法脱蛋白[5]，经醇沉后透析、冷冻干燥，即得到纯化后的热水浸提的多糖。此纯化的多糖用于后续理化性质和抗氧化活性评价试验。参考王谢忠等[6]的方法，应用碘-碘化钾反应、茚三酮反应、Molish反应检测多糖纯度。
1.2.4 矮冷水花多糖的抗氧化活性。取1.2.3制备的多糖样品，参照Akiri[7]的方法，稍有改动，检测DPPH清除率；参照李 飞等的方法，检测多糖清除·OH能力；参考Hsu等[8]方法检测多糖对Fe2 螯合能力。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
试验结果表明，葡萄糖标准品在0～40 μg/mL的范围内呈良好的线性关系。标准曲线的回归方程为y=0.015 91x，R2=0.995 89。
2.2 提取单因素试验结果
2.2.1 提取料液比对多糖得率的影响。从图1可以看出，随着提取料液比的增大，多糖得率呈上升趋势，当料液比为1∶40时得率最大，比1∶20时增加16.4%，之后又减小，这可能是因为料液比较小时，随着水量增多有利于多糖的溶解扩散，多糖的得率随之增大；但料液比过大时，原料中其他成分的浸出影响了多糖的提取。综合考虑提取效率和浓缩工作量，后续正交试验中料液比水平的确定较优，料液比范围为1∶30、1∶40、1∶50。
2.2.2 提取时间对多糖得率的影响。从图2可以看出，随时间的增加，矮冷水花多糖提取的得率逐渐增大，4 h时得率最大，之后随着时间增加，多糖提取得率降低。这可能是因为处理时间过短，多糖溶解不充分，使提取不完全；时间过长，会造成多糖降解或其他化合物成分被提取出来，进而使矮冷水花多糖提取得率降低。虽然在6 h时得率高于5 h时，但6 h时多糖得率比4 h时还低0.87%。因此，考虑到提取时间太长可导致试验成本增加等因素，确定正交试验较优时间范围为3、4、5 h。
2.2.3 提取温度对多糖得率的影响。从图3可以看出，当提取温度不超过90 ℃时，随着温度升高多糖提取得率逐渐增加，并在90 ℃时达到最大，之后逐渐减少。可以看出，温度过高（大于90 ℃）时多糖提取得率降低，可能是高温引起矮冷水花多糖降解。因此，确定正交试验较优温度范围为80、90、100 ℃。
2.2.4 提取次数对多糖得率的影响。从图4可以看出，提取次数为1～3次时，随着提取次数的增多，多糖得率也随之增大，第3次达到最高值，第4次时提取得率并没有明显增加，仅比第3次增加了1.57%。因此，提取次数越多，多糖得率越大，但当细胞内多糖绝大多数溶出后，进一步提取获得的多糖就很少。由此可以确定正交试验次数的适宜范围为2、3、4次。
2.3 正交试验结果
从表2可以看出，由R值可知，4个单因素对多糖提取效果的影響顺序为A（温度）>C（料液比）>D（次数）>B（时间）。温度对矮冷水花多糖提取效果影响最大，其次是料液比和次数，且料液比与次数影响相近，时间影响最小。根据极差分析得出最佳提取工艺条件为A3B2C2D3，即当提取温度为100 ℃，时间为4 h，料液比为1∶40，次数为4次时为最佳提取工艺条件。
为了验证试验的可靠性，进行了最佳工艺条件的平行验证试验，结果如表3所示。平行试验结果得率为1.19%，大于正交试验中所有得率，说明该工艺条件可行。但结合各单因素试验结果对多糖提取效果的影响分析和生产成本与实际操作等因素，建议在实际工业生产中，选择温度为90 ℃，时间为4 h，次数为3次，料液比为1∶40作为提取工艺条件。
2.4 矮冷水花多糖纯度检测结果
矮冷水花多糖溶液的碘-碘化钾反应呈阴性说明矮冷水花多糖为非淀粉类糖；茚三酮反应呈阴性，说明样品中不含氨基酸或蛋白质；Molish反应呈现紫绿色，呈弱阳性，说明样品中含有糖。
2.5 矮冷水花多糖的抗氧化能力
2.5.1 DPPH自由基清除能力。从图5可以看出，矮冷水花多糖对DPPH自由基有较强的清除能力。但是矮冷水花粗多糖在DPPH清除活性上比VC略低。
2.5.2 ·OH自由基清除能力。从图6可以看出，矮冷水花多糖对·OH自由基有较好的清除能力，并在一定浓度范围内随着糖浓度的增大，清除能力增强。矮冷水花多糖与VC清除·OH自由基能力相比，矮冷水花多糖清除·OH的能力比VC较弱。
2.5.3 Fe2 螯合能力。从图7可以看出，矮冷水花多糖对亚铁离子具有较强的螯合能力，在一定浓度范围内随着多糖浓度增大而增强。当浓度为1.28 mg/mL时，螯合能力吸光值达到0.98，基本与0.64 mg/mL EDTA螯合能力持平。 3 结论
热水浸提法提取矮冷水花多糖，通过正交试验进行工艺优化得到提取温度为100 ℃，时间为4 h，料液比为1∶40，次数为4次时为最佳提取工艺条件。此条件下矮冷水花多糖的得率为1.19%。通过纯化后的多糖样品为不含氨基酸和蛋白质的一种非淀粉多糖。该多糖对·OH自由基和DPPH自由基具有较好的清除能力，但是比VC清除自由基（·OH自由基和DPPH自由基）能力略弱；多糖对Fe2 具有较强的螯合能力。矮冷水花多糖具有较好的抗氧化活性，因此可以进一步开展其在制药、化妆品、保健品乃至饲料添加剂方面的开发应用研究[9]。
4 参考文献
[1] 陈谢生，汪如明.防治蛇伤药物矮冷水花制剂的研究[J].中国蛇志杂志，1992，4（4）：13-14.
[2] 张浩，郭增喜.矮冷水花的生药学鉴定[J].中国现代应用药学，1988，5（4）：16-17.
[3] 杨林，刘翠花，刘刚，等. 西藏野生尊麻水溶性多糖提取工艺的优化设计[J].食品工业科技，2013，34（2）：35-37.
[4] 胡海梅.桑椹多糖提取工艺优化、组分分析及降血糖活性鉴定[D].合肥：合肥工业大學，2009.
[5] 王珊，黄胜阳.植物多糖提取液脱蛋白方法的研究进展[J].食品科技，2012，9（37）：188-191.
[6] 王谢忠，胡庭俊，李晓明，等.蕨麻多糖的提取、含量测定和理化性质分析[J].中兽医医药杂志，2006（2）：34-35.
[7] AKIRI SR，SAREDDY GR，PHANITHI PB，et al.The antioxidant and antiproliferative activities of methanolic extracts from Njavara rice bran[J].Complementary and Alternative Medicine，2010，10（4）：1-9.
[8] HSU B，COUPAR IM，NG K.Antioxidant activity of hot water extract from the fruit of the Doum palm Hyphaene thebaica[J].Food Chem，2004，98：317-328.
[9] 丁保金，金丽琴，吕建新.多糖生物活性研究进展[J].中国药学杂志，2004，39（8）：561-564.
关键词 矮冷水花；多糖；提取；抗氧化活性
中图分类号 S567.239 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）15-0255-03
Abstract The polysaccharides of Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn. was extracted by water extraction-alcohol precipitation method. The extraction process was optimized by investigating polysaccharide yield as the response value of extraction time，extraction temperature，solid to solvent ratio and extraction time. Based on the results of single-factor experiments，orthogonal array experiments were carried out to determine the optimum process parameters. The antioxidant capacity of polysaccharides of Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn. was evaluated by the scavenging activities against 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH），hydroxyl free radical（·OH）and chelating ability assays. The results showed that the best conditions for water extraction-alcohol precipitation were determined as follows：extraction temperature was 100 ℃；the time was 4 h；solid to liquid ratio was 1∶40（g/mL）；and the extraction time was 4 times，the extraction ration reached 1.19%.The scavenging capacity of ·OH，DPPH and chelating ability increased with the increasing concentration of polysaccharide. 1.28 mg/mL concentration of polysaccharide had 70.7% scavenging ratio of DPPH，and 41.1% scavenging ratio of ·OH，absorbance at 562 nm of chelating ability was 0.98 when the concentration of polysaccharide was 1.28 mg/mL. From the results it could be concluded that polysaccharide from Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn. had significant antioxidant activity in vitro.
Key words Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn.；polysaccharides；extraction；antioxidant activity
矮冷水花[Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn.]属于荨麻科植物，为一年生草本植物，别名地油仔、苔水花。生长在田埂、山沟、园地、石缝、树下等阴湿处，常被作为蔬菜食用[1]。因具有清热解毒、祛痰止痛等功效，民间用于清热解毒、祛瘀止痛、毒蛇咬伤和疮疖等症[2]。矮冷水花适应性强、分布广，资源丰富，具有巨大潜在开发价值。笔者所在实验室对矮冷水花化学成分进行初步研究表明，矮冷水花中含有多糖、皂苷、多肽、鞣质、有机酸、香豆素等成分。
本研究对矮冷水花多糖提取工艺和抗氧化活性进行研究，以期为矮冷水花多糖在食品、医药、饲料等行业的应用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试材。矮冷水花采自贵阳市乌当区，经教授鉴定为荨麻科植物矮冷水花[Pilea peploides（Gaudich.）Hook.et Arn.]。DPPH[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、铁氰化钾、氯化亚铁、葡萄糖、磷酸氢钾、VC等均为国产分析纯。 1.1.2 试验仪器。恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司），真空抽滤机（郑州长城科工贸有限公司），电子天平（上海精密科技仪器有限公司），冻干机（河南兄弟仪器设备有限公司），分光光度计（上海精密科技仪器有限公司），离心机（江苏正基仪器有限公司），干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 多糖得率测定与计算。多糖含量以苯酚-硫酸法测定[3]。以干燥至恒质量的葡萄糖配制标准液，于490 nm波长处测得的吸光度，绘制标准曲线，得葡萄糖标准曲线方程，计算多糖得率。
1.2.2 单因素试验和正交试验设计。参照杨 林等[3]的方法设置单因素试验：考察提取温度、提取时间、料液比和提取次数对多糖提取率的影响。每组试验重复3次。
在单因素试验的基础上，以矮冷水花多糖提取率为响应值，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）为试验因素，对矮冷水花多糖提取工艺进行优化研究（表1）。
1.2.3 矮冷水花多糖脱色脱蛋白纯化及纯度检测。将矮冷水花粗多糖以活性炭脱色[4]、saveage法脱蛋白[5]，经醇沉后透析、冷冻干燥，即得到纯化后的热水浸提的多糖。此纯化的多糖用于后续理化性质和抗氧化活性评价试验。参考王谢忠等[6]的方法，应用碘-碘化钾反应、茚三酮反应、Molish反应检测多糖纯度。
1.2.4 矮冷水花多糖的抗氧化活性。取1.2.3制备的多糖样品，参照Akiri[7]的方法，稍有改动，检测DPPH清除率；参照李 飞等的方法，检测多糖清除·OH能力；参考Hsu等[8]方法检测多糖对Fe2 螯合能力。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
试验结果表明，葡萄糖标准品在0～40 μg/mL的范围内呈良好的线性关系。标准曲线的回归方程为y=0.015 91x，R2=0.995 89。
2.2 提取单因素试验结果
2.2.1 提取料液比对多糖得率的影响。从图1可以看出，随着提取料液比的增大，多糖得率呈上升趋势，当料液比为1∶40时得率最大，比1∶20时增加16.4%，之后又减小，这可能是因为料液比较小时，随着水量增多有利于多糖的溶解扩散，多糖的得率随之增大；但料液比过大时，原料中其他成分的浸出影响了多糖的提取。综合考虑提取效率和浓缩工作量，后续正交试验中料液比水平的确定较优，料液比范围为1∶30、1∶40、1∶50。
2.2.2 提取时间对多糖得率的影响。从图2可以看出，随时间的增加，矮冷水花多糖提取的得率逐渐增大，4 h时得率最大，之后随着时间增加，多糖提取得率降低。这可能是因为处理时间过短，多糖溶解不充分，使提取不完全；时间过长，会造成多糖降解或其他化合物成分被提取出来，进而使矮冷水花多糖提取得率降低。虽然在6 h时得率高于5 h时，但6 h时多糖得率比4 h时还低0.87%。因此，考虑到提取时间太长可导致试验成本增加等因素，确定正交试验较优时间范围为3、4、5 h。
2.2.3 提取温度对多糖得率的影响。从图3可以看出，当提取温度不超过90 ℃时，随着温度升高多糖提取得率逐渐增加，并在90 ℃时达到最大，之后逐渐减少。可以看出，温度过高（大于90 ℃）时多糖提取得率降低，可能是高温引起矮冷水花多糖降解。因此，确定正交试验较优温度范围为80、90、100 ℃。
2.2.4 提取次数对多糖得率的影响。从图4可以看出，提取次数为1～3次时，随着提取次数的增多，多糖得率也随之增大，第3次达到最高值，第4次时提取得率并没有明显增加，仅比第3次增加了1.57%。因此，提取次数越多，多糖得率越大，但当细胞内多糖绝大多数溶出后，进一步提取获得的多糖就很少。由此可以确定正交试验次数的适宜范围为2、3、4次。
2.3 正交试验结果
从表2可以看出，由R值可知，4个单因素对多糖提取效果的影響顺序为A（温度）>C（料液比）>D（次数）>B（时间）。温度对矮冷水花多糖提取效果影响最大，其次是料液比和次数，且料液比与次数影响相近，时间影响最小。根据极差分析得出最佳提取工艺条件为A3B2C2D3，即当提取温度为100 ℃，时间为4 h，料液比为1∶40，次数为4次时为最佳提取工艺条件。
为了验证试验的可靠性，进行了最佳工艺条件的平行验证试验，结果如表3所示。平行试验结果得率为1.19%，大于正交试验中所有得率，说明该工艺条件可行。但结合各单因素试验结果对多糖提取效果的影响分析和生产成本与实际操作等因素，建议在实际工业生产中，选择温度为90 ℃，时间为4 h，次数为3次，料液比为1∶40作为提取工艺条件。
2.4 矮冷水花多糖纯度检测结果
矮冷水花多糖溶液的碘-碘化钾反应呈阴性说明矮冷水花多糖为非淀粉类糖；茚三酮反应呈阴性，说明样品中不含氨基酸或蛋白质；Molish反应呈现紫绿色，呈弱阳性，说明样品中含有糖。
2.5 矮冷水花多糖的抗氧化能力
2.5.1 DPPH自由基清除能力。从图5可以看出，矮冷水花多糖对DPPH自由基有较强的清除能力。但是矮冷水花粗多糖在DPPH清除活性上比VC略低。
2.5.2 ·OH自由基清除能力。从图6可以看出，矮冷水花多糖对·OH自由基有较好的清除能力，并在一定浓度范围内随着糖浓度的增大，清除能力增强。矮冷水花多糖与VC清除·OH自由基能力相比，矮冷水花多糖清除·OH的能力比VC较弱。
2.5.3 Fe2 螯合能力。从图7可以看出，矮冷水花多糖对亚铁离子具有较强的螯合能力，在一定浓度范围内随着多糖浓度增大而增强。当浓度为1.28 mg/mL时，螯合能力吸光值达到0.98，基本与0.64 mg/mL EDTA螯合能力持平。 3 结论
热水浸提法提取矮冷水花多糖，通过正交试验进行工艺优化得到提取温度为100 ℃，时间为4 h，料液比为1∶40，次数为4次时为最佳提取工艺条件。此条件下矮冷水花多糖的得率为1.19%。通过纯化后的多糖样品为不含氨基酸和蛋白质的一种非淀粉多糖。该多糖对·OH自由基和DPPH自由基具有较好的清除能力，但是比VC清除自由基（·OH自由基和DPPH自由基）能力略弱；多糖对Fe2 具有较强的螯合能力。矮冷水花多糖具有较好的抗氧化活性，因此可以进一步开展其在制药、化妆品、保健品乃至饲料添加剂方面的开发应用研究[9]。
4 参考文献
[1] 陈谢生，汪如明.防治蛇伤药物矮冷水花制剂的研究[J].中国蛇志杂志，1992，4（4）：13-14.
[2] 张浩，郭增喜.矮冷水花的生药学鉴定[J].中国现代应用药学，1988，5（4）：16-17.
[3] 杨林，刘翠花，刘刚，等. 西藏野生尊麻水溶性多糖提取工艺的优化设计[J].食品工业科技，2013，34（2）：35-37.
[4] 胡海梅.桑椹多糖提取工艺优化、组分分析及降血糖活性鉴定[D].合肥：合肥工业大學，2009.
[5] 王珊，黄胜阳.植物多糖提取液脱蛋白方法的研究进展[J].食品科技，2012，9（37）：188-191.
[6] 王谢忠，胡庭俊，李晓明，等.蕨麻多糖的提取、含量测定和理化性质分析[J].中兽医医药杂志，2006（2）：34-35.
[7] AKIRI SR，SAREDDY GR，PHANITHI PB，et al.The antioxidant and antiproliferative activities of methanolic extracts from Njavara rice bran[J].Complementary and Alternative Medicine，2010，10（4）：1-9.
[8] HSU B，COUPAR IM，NG K.Antioxidant activity of hot water extract from the fruit of the Doum palm Hyphaene thebaica[J].Food Chem，2004，98：317-328.
[9] 丁保金，金丽琴，吕建新.多糖生物活性研究进展[J].中国药学杂志，2004，39（8）：561-564.