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摘要[目的] 利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）VP2蛋白。[方法] 根据IBDV vp2全长序列（GenBank登入号AY704912），设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物，克隆IBDV HQ株的vp2基因，插入质粒pET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒pET-22b-vp2，经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果] 在SDS-PAGE中可见大小约为39 kDa重组蛋白。重组蛋白纯化后，Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论] 在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白，并且该重组蛋白有较好的免疫原性，可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。
关键词 IBDV VP2蛋白；大肠杆菌；周质空间；可溶性表达
中图分类号 S852.65 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0152-03
Abstract [Objective] To soluably express the VP2 protein of infectious bursal disease virus by using Escherichia coli system. [Method] Based on the vp2 fulllength sequence of IBDV （GenBank ID No. AY704912）， a pair of specific primers were designed for the amplification of the vp2 sequence which had been deleted the Nterminal 80 amino acid residues of VP2 protein. The truncation gene of VP2 protein of IBDV HQ strain was cloned， and inserted into plasmid pET22b. After IPTG induction， the recombinant protein was expressed in soluble form in the periplasm of E. coli. [Result]The recombinant protein was about 39 kDa as SDSPAGE shown， and the purified recombinant protein had good immunogenicity as Western Blot shown. [Conclusion] The IBDV VP2 protein could be effectively expressed in the periplasm of E. coli， and the recombinant VP2 protein showed good immunogenicity.
Key words IBDV VP2 protein；Escherichia coli；Periplasm；Soluble expression
雞传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）能够引起一种急性、高度传染性疾病。该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一[1-2]。该病毒在分类学上属于双RNA病毒科，由A和B 2个双链RNA片段组成，编码5种病毒蛋白，分别为VP1、VP2、VP3、VP4和VP5，其中VP2是IBDV的主要结构蛋白和宿主保护性抗原，其诱导产生的中和抗体能被动地保护宿主免受IBDV的感染，VP2还与病毒毒力、病毒抗原变异及细胞凋亡等有关[3-5]。众多研究人员利用VP2的免疫原性研究抗IBDV的基因工程疫苗，现已在多种表达系统中成功表达VP2蛋白[6-8]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%，是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[9-11]。
该研究利用大肠杆菌Rosettagami 2菌株作为表达宿主，pET-22b载体作为表达载体进行VP2蛋白的周质表达，获得可溶性的、免疫原性良好的VP2蛋白，以期为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
菌种和载体。IBDV HQ株，由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供；E.coli Top 10、E.coli Rosettagami 2（DE3）感受态细胞和pET-22b载体，均购于Invitrogen公司。
1.1.2 主要试剂。FastPfu DNA聚合酶、dNTPs、BamH I、Hind III、Trans2K plus DNA Marker、Blue Plus Protein Marker均购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；Trizol@Reagent试剂盒均购自天根生化科技有限公司；抗鸡传染性法氏囊病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所；鼠抗鸡酶标二抗均购自南京金斯瑞生物科技有限公司；IPTG为Sigma公司产品；其他试剂为分析纯级试剂。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成。根据GenBank中公布的IBDV序列（登入号：AY704912），利用Oligo 7.27设计引物，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司负责。vp2-up：CGCggatccATGCTGCTGACCGCGC，vp2-down：CCCaagcttTTATA TCCTCCTTATG。 1.2.2 IBDV总RNA提取。按照试剂盒说明书提取总RNA。
1.2.3
IBDV vp2基因扩增。按照试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板，vp2-up和vp2-down为引物，进行PCR扩增，反应体系为1 μL模板、各1 μL vp2-up和vp2-down、10 μL缓冲液、4 μL dNTPs、1 μL FastPfu、32 μL ddH2O；反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应结束后取10 μL进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定片段大小。大小合适的PCR产物按照胶回收试剂盒说明书进行胶回收。
1.2.4 IBDV vp2基因的克隆与鉴定。将经胶回收的目的片段连接到pUC19-T载体上，转化E.coli Top10感受态细胞，获得重组pUC19-vp2。将经菌落PCR鉴定正确的单克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.5 原核表达系统的构建与鉴定。将测序正确的重组质粒pUC19-vp2用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物电泳，胶回收目的片段，与进行同样操作的pET-22b进行连接，得到的重组质粒命名为22b-vp2。将重组质粒22b-vp2转入E.coli Rosettagami 2（DE3）感受态细胞，挑去阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，鉴定正确的重组菌命名为R2/22b-vp2。
1.2.6 R2/22b-vp2的诱导表达。挑取重组菌R2/22b-vp2单菌落接种到LB培养基（含氨苄青霉素终浓度100 μg/mL、氯霉素70 μg/mL）中，37 ℃、220 r/min培养至OD600=0.8左右，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导时间为6 h。
1.2.7 重组蛋白的纯化与鉴定。诱导结束后离心收集菌体，收集到的菌体用PBS缓冲液洗涤2次，并用PBS缓冲液重悬菌体。在冰浴条件下进行超声波裂解菌体，裂解结束后分别对裂解上清和沉淀取样，并进行SDS-PAGE蛋白电泳。使用镍柱进行重组蛋白的纯化，纯化步骤为细胞破碎上清在结合缓冲液中过夜透析，透析液上样过柱（5 mL HisTrap，GE Healthcare），再用结合缓冲液洗涤5个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗涤5个柱体积，收集洗脱组分，并用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。
1.2.8 Western Blot鉴定。蛋白样品经SDS-PAGE后，进行转膜操作，转膜采用湿转方式进行，转膜缓冲液为Tris 3.0 g，Gly 14.4 g，甲醇200 mL，加去离子水至1 000 mL。转膜完成后用5%脱脂乳封闭4 ℃过夜，封闭结束后用PBST洗3遍，加抗鸡传染性法氏囊病毒阳性血清室温孵育2 h，一抗孵育结束后用PBST洗5遍，加鼠抗鸡酶标二抗室温孵育2 h，酶标二抗孵育完成后用PBST洗5遍，滴加沉淀性TBM避光显色10～30 min，拍照。
2 结果与分析
2.1 vp2基因的扩增
运用设计的特异性引物扩增HQ株的vp2基因，扩增得到一条大小约为1 300 bp的目的片段（图1），与理论片段大小一致。
2.2 pUC19-vp2的PCR和酶切鉴定
将重组质粒pUC19-vp2进行PCR鉴定，扩增出大约1 300 bp大小的特异性片段，经双酶切鉴定，得到与理论大小一致的片段（图2）。
2.3 VP2蛋白原核表达系统的构建与鉴定
用菌落PCR初步鉴定阳性克隆，再利用双酶切对其进行酶切鉴定，结果见图3。
2.4 R2/22b-vp2的诱导表达与纯化
2.4.1 重组蛋白可溶性分析。重组菌在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、220 r/min诱导表达6 h，离心收集菌体，超声波裂解菌体，分别对破碎上清和破碎沉淀取样进行蛋白电泳。由图4可以看出，目的蛋白全部在破碎上清中，说明表达的蛋白是以可溶形式表达的。
2.4.2
重组蛋白纯化。重组蛋白经镍柱纯化后，用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯化后的表达产物，在39 kDa处得到一单一条带，与理论大小相符，表明该条带即为VP2蛋白（图5）。纯化后的蛋白，经SDS-PAGE蛋白电泳后，转至NC膜，进行Western Blot鉴定（图6）。
3 讨论
鸡传染性法氏囊病毒是一种具有高度传染性，能夠引起雏鸡免疫抑制性疾病的病毒[12]。而VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白，是宿主的保护性抗原，诱导宿主产生抗IBDV的中和抗体[13]。因而，异源表达重组VP2蛋白作为基因工程疫苗备受关注，目前已有多种不同表达系统的VP2亚单位疫苗，但利用大肠杆菌可溶性表达VP2蛋白的报道甚少，该研究利用大肠杆菌成功地可溶性表达了VP2蛋白。大肠杆菌可溶性表达VP2的难点在于vp2基因序列中存在多个稀有密码子、胞内还原性环境难以确保VP2正确折叠及VP2蛋白N-端亲水区（20～80个氨基酸残基）[14-15]等因素。该研究选择大肠杆菌Rosetta菌株作为表达宿主，选择pET-22b载体作为表达载体进行大肠杆菌周质表达来确保VP2蛋白的可溶性表达。
VP2蛋白表达后观测到约39 kDa的条带，与理论大小一致。纯化后的VP2蛋白用Western Blot检测目的蛋白，一抗为抗鸡传染性法氏囊病毒阳性血清，二抗为鼠抗鸡酶标二抗，结果显示目的蛋白大小处出现特异性条带，而对照没有，这就说明VP2蛋白获得了表达，并且具有免疫原性。该研究为进一步研究鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗和开发鸡传染性法氏囊病检测试剂盒奠定了基础。
4 结论
该研究以IBDV的cDNA链为模板，利用设计的特异性引物扩增获得IBDV编码VP2蛋白的基因序列（缺失N-端80个氨基酸残基），构建了VP2蛋白的周质表达载体pET-22b-vp2。表达载体转化宿主大肠杆菌Rosetta后，经IPTG诱导表达了大小约为39 kDa的重组蛋白，纯化后获得了电泳纯的重组VP2蛋白，该纯化后的重组蛋白经Western Blot鉴定发现其具有良好的免疫原性。 参考文献
[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997.
[2] 李潭清，宋勤叶，杨润德，等.鸡传染性法氏囊病的研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（35）：15481-15484.
[3] IRIGOYEN N，GARRIGA D，NAVARRO A，et al.Autoproteolytic activity derived from the infectious bursal disease virus capsid protein [J].J Biol Chem，2009，284（12）：8064-8072.
[4] NEGASH T，GELAYE E，PETERSEN H，et al.Molecular evidence of very virulent infectious bursal disease viruses in chickens in Ethiopia [J].Avian Dis，2012，56（3）：605-610.
[5] OUYANG W，MA J R，WANG Y Q，et al.Reduction of infectious bursal disease virus replication by shRNAs targeting the VP1 and VP2 genes driven by chicken U6 promoter [J].Vet Microbiol，2013，162（1）：44-52.
[6] 单学强，李明义，高轩.传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析[J].动物医学进展，2012，33（5）：18-21.
[7] 黄春旭，许信刚，童德文，等.传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达[J].西北农业学报，2010，19（4）：37-41.
[8] 王俊全，王韦华，刘桂梅.鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2013，41（9）：38-42.
[9] 谢磊，孙建波，张世清，等.大肠杆菌表达系统及其研究进展[J].华南热带农业大学学报，2004，10（2）：16-20.
[10] 解庭波.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].长江大学学报（自然科学版），2008，5（3）：77-82.
[11] 戎晶晶，刁振宇，周国华.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术，2005，12（6）：416-420.
[12] INGRAO F，RAUW F，LAMBRECHT B，et al.Infectious bursal disease：A complex hostpathogen interaction [J].Dev Comp Immunol，2013，41（3）：429-438.
[13] LUPINI C，GIOVANARDI D，PESENTE P，et al.A molecular epidemiology study based on VP2 gene sequences reveals that a new genotype of infectious bursal disease virus is dominantly prevalent in Italy [J].Avian Pathol，2016，45（4）：1-22.
[14] SHABBIR M Z，ALI M，ABBAS M，et al.Molecular characterization of infectious bursal disease viruses from Pakistan [J].Arch Virol，2016，161（7）：1-6.
[15] 韓玉婷，何勇，许革学，等.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展[J].河南农业科学，2016，45（3）：20-23.
关键词 IBDV VP2蛋白；大肠杆菌；周质空间；可溶性表达
中图分类号 S852.65 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0152-03
Abstract [Objective] To soluably express the VP2 protein of infectious bursal disease virus by using Escherichia coli system. [Method] Based on the vp2 fulllength sequence of IBDV （GenBank ID No. AY704912）， a pair of specific primers were designed for the amplification of the vp2 sequence which had been deleted the Nterminal 80 amino acid residues of VP2 protein. The truncation gene of VP2 protein of IBDV HQ strain was cloned， and inserted into plasmid pET22b. After IPTG induction， the recombinant protein was expressed in soluble form in the periplasm of E. coli. [Result]The recombinant protein was about 39 kDa as SDSPAGE shown， and the purified recombinant protein had good immunogenicity as Western Blot shown. [Conclusion] The IBDV VP2 protein could be effectively expressed in the periplasm of E. coli， and the recombinant VP2 protein showed good immunogenicity.
Key words IBDV VP2 protein；Escherichia coli；Periplasm；Soluble expression
雞传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）能够引起一种急性、高度传染性疾病。该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一[1-2]。该病毒在分类学上属于双RNA病毒科，由A和B 2个双链RNA片段组成，编码5种病毒蛋白，分别为VP1、VP2、VP3、VP4和VP5，其中VP2是IBDV的主要结构蛋白和宿主保护性抗原，其诱导产生的中和抗体能被动地保护宿主免受IBDV的感染，VP2还与病毒毒力、病毒抗原变异及细胞凋亡等有关[3-5]。众多研究人员利用VP2的免疫原性研究抗IBDV的基因工程疫苗，现已在多种表达系统中成功表达VP2蛋白[6-8]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%，是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[9-11]。
该研究利用大肠杆菌Rosettagami 2菌株作为表达宿主，pET-22b载体作为表达载体进行VP2蛋白的周质表达，获得可溶性的、免疫原性良好的VP2蛋白，以期为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
菌种和载体。IBDV HQ株，由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供；E.coli Top 10、E.coli Rosettagami 2（DE3）感受态细胞和pET-22b载体，均购于Invitrogen公司。
1.1.2 主要试剂。FastPfu DNA聚合酶、dNTPs、BamH I、Hind III、Trans2K plus DNA Marker、Blue Plus Protein Marker均购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；Trizol@Reagent试剂盒均购自天根生化科技有限公司；抗鸡传染性法氏囊病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所；鼠抗鸡酶标二抗均购自南京金斯瑞生物科技有限公司；IPTG为Sigma公司产品；其他试剂为分析纯级试剂。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成。根据GenBank中公布的IBDV序列（登入号：AY704912），利用Oligo 7.27设计引物，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司负责。vp2-up：CGCggatccATGCTGCTGACCGCGC，vp2-down：CCCaagcttTTATA TCCTCCTTATG。 1.2.2 IBDV总RNA提取。按照试剂盒说明书提取总RNA。
1.2.3
IBDV vp2基因扩增。按照试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板，vp2-up和vp2-down为引物，进行PCR扩增，反应体系为1 μL模板、各1 μL vp2-up和vp2-down、10 μL缓冲液、4 μL dNTPs、1 μL FastPfu、32 μL ddH2O；反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应结束后取10 μL进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定片段大小。大小合适的PCR产物按照胶回收试剂盒说明书进行胶回收。
1.2.4 IBDV vp2基因的克隆与鉴定。将经胶回收的目的片段连接到pUC19-T载体上，转化E.coli Top10感受态细胞，获得重组pUC19-vp2。将经菌落PCR鉴定正确的单克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.5 原核表达系统的构建与鉴定。将测序正确的重组质粒pUC19-vp2用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物电泳，胶回收目的片段，与进行同样操作的pET-22b进行连接，得到的重组质粒命名为22b-vp2。将重组质粒22b-vp2转入E.coli Rosettagami 2（DE3）感受态细胞，挑去阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，鉴定正确的重组菌命名为R2/22b-vp2。
1.2.6 R2/22b-vp2的诱导表达。挑取重组菌R2/22b-vp2单菌落接种到LB培养基（含氨苄青霉素终浓度100 μg/mL、氯霉素70 μg/mL）中，37 ℃、220 r/min培养至OD600=0.8左右，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导时间为6 h。
1.2.7 重组蛋白的纯化与鉴定。诱导结束后离心收集菌体，收集到的菌体用PBS缓冲液洗涤2次，并用PBS缓冲液重悬菌体。在冰浴条件下进行超声波裂解菌体，裂解结束后分别对裂解上清和沉淀取样，并进行SDS-PAGE蛋白电泳。使用镍柱进行重组蛋白的纯化，纯化步骤为细胞破碎上清在结合缓冲液中过夜透析，透析液上样过柱（5 mL HisTrap，GE Healthcare），再用结合缓冲液洗涤5个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗涤5个柱体积，收集洗脱组分，并用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。
1.2.8 Western Blot鉴定。蛋白样品经SDS-PAGE后，进行转膜操作，转膜采用湿转方式进行，转膜缓冲液为Tris 3.0 g，Gly 14.4 g，甲醇200 mL，加去离子水至1 000 mL。转膜完成后用5%脱脂乳封闭4 ℃过夜，封闭结束后用PBST洗3遍，加抗鸡传染性法氏囊病毒阳性血清室温孵育2 h，一抗孵育结束后用PBST洗5遍，加鼠抗鸡酶标二抗室温孵育2 h，酶标二抗孵育完成后用PBST洗5遍，滴加沉淀性TBM避光显色10～30 min，拍照。
2 结果与分析
2.1 vp2基因的扩增
运用设计的特异性引物扩增HQ株的vp2基因，扩增得到一条大小约为1 300 bp的目的片段（图1），与理论片段大小一致。
2.2 pUC19-vp2的PCR和酶切鉴定
将重组质粒pUC19-vp2进行PCR鉴定，扩增出大约1 300 bp大小的特异性片段，经双酶切鉴定，得到与理论大小一致的片段（图2）。
2.3 VP2蛋白原核表达系统的构建与鉴定
用菌落PCR初步鉴定阳性克隆，再利用双酶切对其进行酶切鉴定，结果见图3。
2.4 R2/22b-vp2的诱导表达与纯化
2.4.1 重组蛋白可溶性分析。重组菌在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、220 r/min诱导表达6 h，离心收集菌体，超声波裂解菌体，分别对破碎上清和破碎沉淀取样进行蛋白电泳。由图4可以看出，目的蛋白全部在破碎上清中，说明表达的蛋白是以可溶形式表达的。
2.4.2
重组蛋白纯化。重组蛋白经镍柱纯化后，用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯化后的表达产物，在39 kDa处得到一单一条带，与理论大小相符，表明该条带即为VP2蛋白（图5）。纯化后的蛋白，经SDS-PAGE蛋白电泳后，转至NC膜，进行Western Blot鉴定（图6）。
3 讨论
鸡传染性法氏囊病毒是一种具有高度传染性，能夠引起雏鸡免疫抑制性疾病的病毒[12]。而VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白，是宿主的保护性抗原，诱导宿主产生抗IBDV的中和抗体[13]。因而，异源表达重组VP2蛋白作为基因工程疫苗备受关注，目前已有多种不同表达系统的VP2亚单位疫苗，但利用大肠杆菌可溶性表达VP2蛋白的报道甚少，该研究利用大肠杆菌成功地可溶性表达了VP2蛋白。大肠杆菌可溶性表达VP2的难点在于vp2基因序列中存在多个稀有密码子、胞内还原性环境难以确保VP2正确折叠及VP2蛋白N-端亲水区（20～80个氨基酸残基）[14-15]等因素。该研究选择大肠杆菌Rosetta菌株作为表达宿主，选择pET-22b载体作为表达载体进行大肠杆菌周质表达来确保VP2蛋白的可溶性表达。
VP2蛋白表达后观测到约39 kDa的条带，与理论大小一致。纯化后的VP2蛋白用Western Blot检测目的蛋白，一抗为抗鸡传染性法氏囊病毒阳性血清，二抗为鼠抗鸡酶标二抗，结果显示目的蛋白大小处出现特异性条带，而对照没有，这就说明VP2蛋白获得了表达，并且具有免疫原性。该研究为进一步研究鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗和开发鸡传染性法氏囊病检测试剂盒奠定了基础。
4 结论
该研究以IBDV的cDNA链为模板，利用设计的特异性引物扩增获得IBDV编码VP2蛋白的基因序列（缺失N-端80个氨基酸残基），构建了VP2蛋白的周质表达载体pET-22b-vp2。表达载体转化宿主大肠杆菌Rosetta后，经IPTG诱导表达了大小约为39 kDa的重组蛋白，纯化后获得了电泳纯的重组VP2蛋白，该纯化后的重组蛋白经Western Blot鉴定发现其具有良好的免疫原性。 参考文献
[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997.
[2] 李潭清，宋勤叶，杨润德，等.鸡传染性法氏囊病的研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（35）：15481-15484.
[3] IRIGOYEN N，GARRIGA D，NAVARRO A，et al.Autoproteolytic activity derived from the infectious bursal disease virus capsid protein [J].J Biol Chem，2009，284（12）：8064-8072.
[4] NEGASH T，GELAYE E，PETERSEN H，et al.Molecular evidence of very virulent infectious bursal disease viruses in chickens in Ethiopia [J].Avian Dis，2012，56（3）：605-610.
[5] OUYANG W，MA J R，WANG Y Q，et al.Reduction of infectious bursal disease virus replication by shRNAs targeting the VP1 and VP2 genes driven by chicken U6 promoter [J].Vet Microbiol，2013，162（1）：44-52.
[6] 单学强，李明义，高轩.传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析[J].动物医学进展，2012，33（5）：18-21.
[7] 黄春旭，许信刚，童德文，等.传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达[J].西北农业学报，2010，19（4）：37-41.
[8] 王俊全，王韦华，刘桂梅.鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2013，41（9）：38-42.
[9] 谢磊，孙建波，张世清，等.大肠杆菌表达系统及其研究进展[J].华南热带农业大学学报，2004，10（2）：16-20.
[10] 解庭波.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].长江大学学报（自然科学版），2008，5（3）：77-82.
[11] 戎晶晶，刁振宇，周国华.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术，2005，12（6）：416-420.
[12] INGRAO F，RAUW F，LAMBRECHT B，et al.Infectious bursal disease：A complex hostpathogen interaction [J].Dev Comp Immunol，2013，41（3）：429-438.
[13] LUPINI C，GIOVANARDI D，PESENTE P，et al.A molecular epidemiology study based on VP2 gene sequences reveals that a new genotype of infectious bursal disease virus is dominantly prevalent in Italy [J].Avian Pathol，2016，45（4）：1-22.
[14] SHABBIR M Z，ALI M，ABBAS M，et al.Molecular characterization of infectious bursal disease viruses from Pakistan [J].Arch Virol，2016，161（7）：1-6.
[15] 韓玉婷，何勇，许革学，等.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展[J].河南农业科学，2016，45（3）：20-23.