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摘 要：在两步酶解的基础上，采用响应面法优化酶法制备亚铁血红素肽的工艺。以酶底比（E/S）、酶解时间、酶解温度为变量因素，以血红蛋白溶液水解度为响应值，进行Box-Behnken响应面试验设计并进行分析。结果表明：响应面法优化得到碱性蛋白酶的最佳酶解条件为E/S 10.16 kU/g、酶解时间5.45 h、酶解温度51.51 ℃;风味蛋白酶的最佳酶解条件为E/S 11.13 kU/g、酶解时间4.37 h、酶解温度48.34 ℃;通过验证实验证明，两步酶解后的实际水解度为54.31%。
关键词：响应面法;酶解;亚铁血红素肽;水解度
Optimization of Enzymatic Preparation of Hemopeptides by Response Surface Methodology
LIU Youwei1， LIU Zhanmin1， LI Cong2， WU Xiang2， LI Chao2， XU Baocai2，3，*
（1.School of Life Sciences， Shanghai University， Shanghai 200444， China;
2.State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Jiangsu Yurun Meat Food Co. Ltd.， Nanjing 211806， China;
3.School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230000， China）
Abstract： The preparation of himopeptides by sequential hydrolysis with two enzymes was optimized using response surface methodology with Box-Behnken design. Enzyme-to-substrate ratio （E/S）， hydrolysis time and temperature were taken as independent variables. The response variable was the degree of hydrolysis of hemoglobin. The results showed that the optimal hydrolysis conditions for alkaline protease were as follows： E/S 10.16 kU/g， time 5.45 h， temperature 51.51 ℃. The optimal hydrolysis conditions for flavourzyme were as follows： E/S 11.13 kU/g， time 4.37 h， temperature 48.34 ℃. The validation experiments showed that the degree of hydrolysis was 54.31% under these optimized conditions.
Keywords： response surface methodology; enzymatic hydrolysis; hemopeptides; degree of hydrolysis
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058
中圖分类号：TS251.93 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）04-0034-06
引文格式：
刘又维， 刘战民， 李聪， 等. 响应面法优化酶法制备亚铁血红素肽工艺[J]. 肉类研究， 2020， 34（4）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058. http：//www.rlyj.net.cn
LIU Youwei， LIU Zhanmin， LI Cong， et al. Optimization of enzymatic preparation of hemopeptides by response surface methodology[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058. http：//www.rlyj.net.cn
畜禽血液蛋白质含量丰富[1-3]，并且含有利于人体吸收的亚铁血红素[4-6]。2018年我国生猪出栏量6.94 亿头，猪肉产量5 404 万t，位居世界第一，具有大量的猪血资源[7]。利用猪血资源制备血红素，可减少大量未降解猪血的排放，降低环境污染，还可以为缺铁性贫血人群的补铁提供有效途径[8-9]。亚铁血红素肽是将畜禽血液中的血红蛋白经物理和化学方法处理，除去其中大部分氨基酸后得到的由长度不等的短肽段与亚铁血红素连接而成的混合物[10]。目前，亚铁血红素肽的提取方法主要有冰醋酸法[11]、酸性丙酮法[12-13]、表面活性剂法[14-16]、羧甲基纤维素钠（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）法[17]和酶水解法[18-20]等。其中冰醋酸法、酸性丙酮法和表面活性剂法需使用有毒试剂，不可用于食用;CMC-Na法提取的产物纯度和回收率均较低;而酶水解法可人工控制，副反应相对较少[21-23]，且在不使用有毒试剂的情况下使亚铁血红素与一定量的肽段结合，提高人体吸收率[24]。 本研究以猪血为原料，利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶两步水解血红蛋白，以制备亚铁血红素肽。在单因素试验基础上采用响应面法确定最佳酶解工艺，为亚铁血红素肽的制备工艺及规模化生产提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪血 江苏雨润肉食品有限公司。
碱性蛋白酶 上海蓝季科技发展有限公司;风味蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司;三氯乙酸、福林试剂、干酪素、L-酪氨酸、吡啶、甲醛、硼酸、浓硫酸、盐酸、乙酸钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
5427R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;FA1204B电子分析天平、PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司;HH-M6恒温水浴锅 金坛市城西春兰实验仪器厂;JY92-2D超声清洗机 宁波新芝生物科技有限公司;UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 血红蛋白溶液的制备
取新鲜猪血，立即加入猪血体积1/10的3.8 g/100 mL柠檬酸三钠抗凝，搅拌均匀后3 500 r/min离心15 min，收集下层红血球，用生理盐水洗涤后得到干净红血球;将红血球与蒸馏水以体积比1∶3混合，使用超声波破碎细胞，超声条件为：温度10 ℃、功率350 W、时间10 min;破碎后的红细胞置于4 ℃冰箱中溶血20 h以上，得到血红蛋白溶液。
1.3.2 高效蛋白酶的筛选
将1.3.1节得到的血红蛋白溶液作为底物，采用两步酶解法，第1步分别采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶3 种肽链内切酶酶解，以血红蛋白溶液水解度和亚铁离子得率为指标，选取最适内切酶;第2步分别采用风味蛋白酶和氨肽酶2 种肽链外切酶继续酶解，以血红蛋白溶液水解度和亚铁离子得率为指标，选取最适外切酶。各酶水解条件均为最适条件，如表1所示。
1.3.3 血红蛋白溶液水解度测定
血红蛋白溶液中总氮含量的测定采用凯氏定氮法[25]，酶解液中氨基态氮含量的测定采用甲醛滴定法[26]。血红蛋白溶液水解度按下式计算。
1.3.4 亚铁离子含量测定
参照HJ/T 345—2007《水质 铁的测定 邻菲啰啉分光光度法》[27]中的邻菲啰啉分光光度法，稍作改进。
1.3.5 亚铁血红素含量测定
亚铁血红素肽的主体部分为亚铁血红素，因此测定亚铁血红素肽含量只需测定亚铁血红素含量即可。参考Guo Shanguang等[28]的分光光度法，并稍作修改。
1.3.6 响应面试验设计
在单因素试验结果基础上，选择酶底比（E/S）、酶解时间和酶解温度为因素，血红蛋白溶液水解度为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合试验进行3因素3水平试验设计，优化分析得到二次多项式回归方程预测模型，考察其可信程度，研究碱性蛋白酶和风味蛋白酶的最优酶解工艺，2 种酶的酶解工艺响应面试验因素水平如表2所示。
1.4 數据处理
采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化试验设计和响应面三维图和等高线图绘制，采用Origin 8.6软件进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同蛋白酶酶解效果分析
由图1可知，3 种内切酶中，采用胰蛋白酶时的血红蛋白溶液水解度最高，为24.65%，采用碱性蛋白酶时的血红蛋白溶液水解度略低，为23.39%，二者无显著差异，且均高于采用中性蛋白酶时的血红蛋白溶液水解度。碱性蛋白酶酶解液的亚铁离子得率为37.97%，显著高于另外2 种内切酶酶解液（P<0.05）。虽然采用胰蛋白酶时血红蛋白溶液水解度最高，但其酶解液的亚铁离子得率较低，因此选择碱性蛋白酶作为内切酶。
由图2可知，无论是血红蛋白溶液水解度还是亚铁离子得率，风味蛋白酶均优于氨肽酶，因此选择风味蛋白酶作为外切酶。
2.2 响应面法优化碱性蛋白酶酶解工艺的试验结果与分析
2.2.1 碱性蛋白酶酶解工艺的响应面分析
碱性蛋白酶酶解工艺的响应面试验设计方案及结果如表3所示。由表4可知，模型极显著（P<0.000 1），说明该模型能够解释大部分实验情况的变化，同时失拟项不显著，进一步说明该模型的合理性，因此，可以用此模型对实验结果进行分析和预测。回归方程模型为：Y=-102.958 69+15.653 13A+1.878 13B+1.622 12C+0.080 63AB-0.015 38AC+0.036 63BC-0.752 94A2-0.420 44B2-0.016 17C2，回归方程中的一次项B、二次项BC达到显著水平（P<0.05），二次项A2、B2、C2均达到极显著水平（P<0.01），表明各因素对血红蛋白溶液水解度的影响不是简单的线性关系。方差分析中因素A、B、C的F值分别为5.82、10.77、3.36，即各因素对血红蛋白溶液水解度的影响程度大小顺序为酶解时间>E/S>酶解温度。模型拟合系数R2=0.974 2，模型校正拟合系数R2Adj=0.941 1，表明该模型能够解释血红蛋白溶液水解度94.11%的变化来自于所选变量。同时变异系数为2.63%，说明模型置信度高，能够准确预测和分析3 个变量对血红蛋白溶液水解度的影响。
2.2.2 碱性蛋白酶水解影响因素的交互作用分析
根据回归方程绘制响应面图，图形形状与三维图倾斜度均能反映因素间的交互作用程度。等高线为圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著;三维图倾斜度越大，坡度越陡，说明两因素交互作用越显著。
关键词：响应面法;酶解;亚铁血红素肽;水解度
Optimization of Enzymatic Preparation of Hemopeptides by Response Surface Methodology
LIU Youwei1， LIU Zhanmin1， LI Cong2， WU Xiang2， LI Chao2， XU Baocai2，3，*
（1.School of Life Sciences， Shanghai University， Shanghai 200444， China;
2.State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Jiangsu Yurun Meat Food Co. Ltd.， Nanjing 211806， China;
3.School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230000， China）
Abstract： The preparation of himopeptides by sequential hydrolysis with two enzymes was optimized using response surface methodology with Box-Behnken design. Enzyme-to-substrate ratio （E/S）， hydrolysis time and temperature were taken as independent variables. The response variable was the degree of hydrolysis of hemoglobin. The results showed that the optimal hydrolysis conditions for alkaline protease were as follows： E/S 10.16 kU/g， time 5.45 h， temperature 51.51 ℃. The optimal hydrolysis conditions for flavourzyme were as follows： E/S 11.13 kU/g， time 4.37 h， temperature 48.34 ℃. The validation experiments showed that the degree of hydrolysis was 54.31% under these optimized conditions.
Keywords： response surface methodology; enzymatic hydrolysis; hemopeptides; degree of hydrolysis
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058
中圖分类号：TS251.93 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）04-0034-06
引文格式：
刘又维， 刘战民， 李聪， 等. 响应面法优化酶法制备亚铁血红素肽工艺[J]. 肉类研究， 2020， 34（4）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058. http：//www.rlyj.net.cn
LIU Youwei， LIU Zhanmin， LI Cong， et al. Optimization of enzymatic preparation of hemopeptides by response surface methodology[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200228-058. http：//www.rlyj.net.cn
畜禽血液蛋白质含量丰富[1-3]，并且含有利于人体吸收的亚铁血红素[4-6]。2018年我国生猪出栏量6.94 亿头，猪肉产量5 404 万t，位居世界第一，具有大量的猪血资源[7]。利用猪血资源制备血红素，可减少大量未降解猪血的排放，降低环境污染，还可以为缺铁性贫血人群的补铁提供有效途径[8-9]。亚铁血红素肽是将畜禽血液中的血红蛋白经物理和化学方法处理，除去其中大部分氨基酸后得到的由长度不等的短肽段与亚铁血红素连接而成的混合物[10]。目前，亚铁血红素肽的提取方法主要有冰醋酸法[11]、酸性丙酮法[12-13]、表面活性剂法[14-16]、羧甲基纤维素钠（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）法[17]和酶水解法[18-20]等。其中冰醋酸法、酸性丙酮法和表面活性剂法需使用有毒试剂，不可用于食用;CMC-Na法提取的产物纯度和回收率均较低;而酶水解法可人工控制，副反应相对较少[21-23]，且在不使用有毒试剂的情况下使亚铁血红素与一定量的肽段结合，提高人体吸收率[24]。 本研究以猪血为原料，利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶两步水解血红蛋白，以制备亚铁血红素肽。在单因素试验基础上采用响应面法确定最佳酶解工艺，为亚铁血红素肽的制备工艺及规模化生产提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪血 江苏雨润肉食品有限公司。
碱性蛋白酶 上海蓝季科技发展有限公司;风味蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司;三氯乙酸、福林试剂、干酪素、L-酪氨酸、吡啶、甲醛、硼酸、浓硫酸、盐酸、乙酸钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
5427R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;FA1204B电子分析天平、PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司;HH-M6恒温水浴锅 金坛市城西春兰实验仪器厂;JY92-2D超声清洗机 宁波新芝生物科技有限公司;UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 血红蛋白溶液的制备
取新鲜猪血，立即加入猪血体积1/10的3.8 g/100 mL柠檬酸三钠抗凝，搅拌均匀后3 500 r/min离心15 min，收集下层红血球，用生理盐水洗涤后得到干净红血球;将红血球与蒸馏水以体积比1∶3混合，使用超声波破碎细胞，超声条件为：温度10 ℃、功率350 W、时间10 min;破碎后的红细胞置于4 ℃冰箱中溶血20 h以上，得到血红蛋白溶液。
1.3.2 高效蛋白酶的筛选
将1.3.1节得到的血红蛋白溶液作为底物，采用两步酶解法，第1步分别采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶3 种肽链内切酶酶解，以血红蛋白溶液水解度和亚铁离子得率为指标，选取最适内切酶;第2步分别采用风味蛋白酶和氨肽酶2 种肽链外切酶继续酶解，以血红蛋白溶液水解度和亚铁离子得率为指标，选取最适外切酶。各酶水解条件均为最适条件，如表1所示。
1.3.3 血红蛋白溶液水解度测定
血红蛋白溶液中总氮含量的测定采用凯氏定氮法[25]，酶解液中氨基态氮含量的测定采用甲醛滴定法[26]。血红蛋白溶液水解度按下式计算。
1.3.4 亚铁离子含量测定
参照HJ/T 345—2007《水质 铁的测定 邻菲啰啉分光光度法》[27]中的邻菲啰啉分光光度法，稍作改进。
1.3.5 亚铁血红素含量测定
亚铁血红素肽的主体部分为亚铁血红素，因此测定亚铁血红素肽含量只需测定亚铁血红素含量即可。参考Guo Shanguang等[28]的分光光度法，并稍作修改。
1.3.6 响应面试验设计
在单因素试验结果基础上，选择酶底比（E/S）、酶解时间和酶解温度为因素，血红蛋白溶液水解度为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合试验进行3因素3水平试验设计，优化分析得到二次多项式回归方程预测模型，考察其可信程度，研究碱性蛋白酶和风味蛋白酶的最优酶解工艺，2 种酶的酶解工艺响应面试验因素水平如表2所示。
1.4 數据处理
采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化试验设计和响应面三维图和等高线图绘制，采用Origin 8.6软件进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同蛋白酶酶解效果分析
由图1可知，3 种内切酶中，采用胰蛋白酶时的血红蛋白溶液水解度最高，为24.65%，采用碱性蛋白酶时的血红蛋白溶液水解度略低，为23.39%，二者无显著差异，且均高于采用中性蛋白酶时的血红蛋白溶液水解度。碱性蛋白酶酶解液的亚铁离子得率为37.97%，显著高于另外2 种内切酶酶解液（P<0.05）。虽然采用胰蛋白酶时血红蛋白溶液水解度最高，但其酶解液的亚铁离子得率较低，因此选择碱性蛋白酶作为内切酶。
由图2可知，无论是血红蛋白溶液水解度还是亚铁离子得率，风味蛋白酶均优于氨肽酶，因此选择风味蛋白酶作为外切酶。
2.2 响应面法优化碱性蛋白酶酶解工艺的试验结果与分析
2.2.1 碱性蛋白酶酶解工艺的响应面分析
碱性蛋白酶酶解工艺的响应面试验设计方案及结果如表3所示。由表4可知，模型极显著（P<0.000 1），说明该模型能够解释大部分实验情况的变化，同时失拟项不显著，进一步说明该模型的合理性，因此，可以用此模型对实验结果进行分析和预测。回归方程模型为：Y=-102.958 69+15.653 13A+1.878 13B+1.622 12C+0.080 63AB-0.015 38AC+0.036 63BC-0.752 94A2-0.420 44B2-0.016 17C2，回归方程中的一次项B、二次项BC达到显著水平（P<0.05），二次项A2、B2、C2均达到极显著水平（P<0.01），表明各因素对血红蛋白溶液水解度的影响不是简单的线性关系。方差分析中因素A、B、C的F值分别为5.82、10.77、3.36，即各因素对血红蛋白溶液水解度的影响程度大小顺序为酶解时间>E/S>酶解温度。模型拟合系数R2=0.974 2，模型校正拟合系数R2Adj=0.941 1，表明该模型能够解释血红蛋白溶液水解度94.11%的变化来自于所选变量。同时变异系数为2.63%，说明模型置信度高，能够准确预测和分析3 个变量对血红蛋白溶液水解度的影响。
2.2.2 碱性蛋白酶水解影响因素的交互作用分析
根据回归方程绘制响应面图，图形形状与三维图倾斜度均能反映因素间的交互作用程度。等高线为圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著;三维图倾斜度越大，坡度越陡，说明两因素交互作用越显著。