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【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2015）04
【摘 要】目的 建立五味子果实中五味子甲素含量的高效液相色谱测定方法。方法 样品用超声提取，过滤，取续滤液，采用高效液相色谱法直接测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇 -四氢呋喃 -水 （70：4：26）为流动相，进样量10μL，流速为lmL/min，检测波长为254nm进行检测。结果 五味子甲素的线性范围为0.125～1.25μg，R2为0.9992，平均加样回收率为99.2%，RSD为1.1%（n=6）。结论 此方法准确度较高，可用于测定五味子中五味子甲素的含量，为五味子生药及成品药中五味子甲素含量测定提供了一种切实可行的方法。
五味子属木兰科木质藤本植物。因其果实具甘、酸、辛、苦、咸五味而得名。分布于我东北及华北地区.是长白山地区大宗道地药材[1]。其药用部位为果实，主要含有木脂素类成分，被奉为《神农本草经》中上品，具有保肝、降酶、保护中枢神经系统、抗艾滋病毒、抗癌等多种药理活性，现代医学将五味子主要应用于肝病及神经衰弱的临床治疗[2]。本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定了五味子中五味子甲素的含量，为合理开发利用五味子资源提供了质量评价手段。
1、材料与方法
1.1 仪器与试剂 LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS210S-WEI型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），HH-S系列恒温水浴锅，WondaSil C18色谱柱（4.6mm×25cm，5μm）。 五味子甲素标准品（批号：110764），购于中国药品生物制品检定所；水为双蒸馏水，自制；其它试剂均为分析纯 。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件：色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂（250mm*4.6mm，5μm）；流动相：为甲醇 -四氢呋喃 -水 （70：4：26）；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温为室温；进样量10μL。灵敏度：0.05AUFS。按以上色谱条件测定，五味子甲素峰与其他杂质峰得到很好的分离，分离度大于2.0。理论塔板数按五味子甲素计算不低于3000。
1.2 .2 标准品溶液的制备：取经80℃干燥至恒重的五味子甲素对照品1.25mg，精确称量，置25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得五味子甲素对照品溶液（0.05mg/mL），备用。
1.2.3 样品溶液的制备：五味子干燥、粉碎 （40～60目 ） ，精密称取 1g左右 ，用甲醇以液固比 1：15的比例 ，超声波提取 30min， 静置待冷（约lh），吸取上清液。残渣用甲醇洗涤，过滤，共3次，合并滤液 ， 加甲醇溶解并稀释定容于 50mL容量瓶中，备用。
1.2.4 样品测定方法 ：用五味子甲素对照品不同的进样量，按仪器的色谱条件进行实验， 得到标准色谱图，并做峰面积与含量之间的标准工作曲线。而供试品溶液和阴性溶液直接取用，与标准色谱图相同条件进行实验，得到色谱图。根据保留时间和峰面积与标准工作曲线比较进行定性和定量分析。
2、结果
2.1 线性关系考察：精密吸取已经准备好的五味子甲素对照品溶液（0.05mg/mL）各2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μl进样测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，得回归方程如下： 五味子甲素：Y = 17977X + 39813，相关系数： r= 0.9992 结果表明，五味子甲素在0.125～1.25μg间有良好的线性关系。
通过HPLC方法，初步建立SLE的指纹图谱，指认主要色谱峰为Schizandrin， Gominsin A， Gominsin C， Deoxyschizandrin，γ-Schizandrin， Schizandrin C。 七周龄雄性昆明种小鼠用于应激性肝损伤实验，采用拘束应激动物模型来评价SLE的抗应激作用。18 h拘束负荷后诱发小鼠应激性肝损伤，分别用赖氏法测定小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）和皮质酮（Corticosterone）活性，硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛（MDA）水平，荧光酶标仪测定肝组织抗氧化能力指数（ORAC）水平，比色法测定肝组织自由基清除关键酶超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase， GPX）的活性，RT-PCR的方法测定肝脏SOD、GPX和糖皮质激素受体GR的mRNA表达的变化。拘束应激负荷18h后，正常对照组小鼠的ALT值为17.53±4.67IU/L，而应激模型组小鼠的ALT值为96.70±6.27 IU/L，拘束负荷小鼠血清ALT水平明显升高（P0.01），结果提示拘束应激可以造成严重的肝损伤。小鼠血浆Corticosterone水平显著升高，结果表明拘束应激负荷引起小鼠肝损伤与应激性激素水平的变化有关。给予五味子标准提取物可以明显降低拘束负荷诱发小鼠血清ALT活性升高，SLE低剂量组小鼠的ALT值为34.76±2.26IU/L，SLE高剂量组小鼠的ALT值为29.70±5.04IU/L，表明五味子标准提取物对应激性肝损伤有一定的保护作用。
降酶保肝作用：实验证明，五味子对四氯化碳引起的动物血清谷丙转氨酶（CPT）升高有抑制作用。种仁的醇提物明显降低试验性肝损害所致的高血清谷丙转氨酶。而果仁和种仁水煎剂则无效。说明其降酶的有效成分在种仁中可被醇溶解，不易溶于水。部分实验证明，用已分离出的单体γ-五味子素（五味子乙素）对肝细胞有一定保肝作用，并能加速肝组织再生。以四氯化碳造成肝损伤，经五味子制剂治疗后肝小叶坏死区缩小，含脂肪油的肝细胞明显减少，水解酶类、氧化酶、脱氢酶明显恢复，与对照组比较，治疗组动物中央坏死区肝细胞有较高的线粒体，进一步观察到应用五味子治疗的动物肝细胞中核酸、一般蛋白质、碱性蛋白质及结合的硫氨基的二硫基含量均较对照组高。所以认为五味子有助于肝细胞蛋白质的合成，从而使线粒体恢复和增加，相应的酶活性增高，肝细胞得以恢复和再生，发挥降酶保肝作用。 此外，研究发现与P815对照组相比应激模型组肝脏Fas/Fas-L mRAN表达比率明显下降（P0.01）。与应激模型组相比，SLE 100和200 mg/kg组小鼠肝脏Fas/Fas-L mRAN表达水平均明显上升，结果表明SLE也可能通过提高Fas/Fas-L mRAN表达水平来达到抵抗应激性肝癌转移的作用。
综上所述，五味子标准提取物SLE可以改善拘束应激负荷造成的小鼠肝脏损伤和肝脏癌转移，其改善机制可能与提高应激负荷机体免疫功能和缓解细胞内的过氧化损伤有关。因此，采用现代科学方法，从抗应激的角度揭示中药五味子标准提取物的肝保护用的科学内涵不仅具有迫切性，也必然形成有益的社会效益。
参考文献
[1]刘玉壶，罗献瑞，吴容芬。中国植物志30（1）[M].北京：科学出版社；1996：82
[2]杨晓玲，李爱民.五味子研究概况[M]，时珍国医国药1999；10（4）：300301
[3]郑春英，李宏涛，吴桐等 HPLC法同时测定五味子不同部位中三种木酯素成分含量。食品科学，2007，28（07），376--379
[4]李海涛，胡刚.五味子醇甲抑制6-羟基多巴胺诱导PC12细胞凋亡的研究.南京中医药大学学报，2004，20（2）：96
[5]李莉，刘耕陶.五味子酚和丹酚酸A对H2O2引起大鼠脑神经细胞凋亡的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1996，10（2）：92
[6]李莉，刘耕陶.五味子酚对氧自由基引起大鼠脑突触体和线粒体损伤的保护作用.药学学报，1998，33（2）：81
[7]汪平君，郑青山.五味子与红参配伍对小鼠脑蛋白质及核酸含量的影响及组方分析.中国实验方剂学杂志，2000，6（3）：19
[8]于晓凤，睢大员，吕忠智，等.五味子粗多糖的初步药理研究.白求恩医科大学学报，1995，21（2）：147
[9]孙侃.北五味子对动物呼吸和血压的作用.药学学报，1959，7（7）：277
[10]许志奇，彭国瑞，曾祥国，等.红参、五味子防治小鼠慢性支气管炎的实验研究.中药药理与临床，1992，8（6）：28
[11]李秀娟，高文霞，冯玉霞.五味子对扑热息痛致肝脏毒性的保护作用.齐齐哈尔医学院学报，2001，22（7）：727
[12]高普军，朴云峰，郭晓林，等.北五味子粗多糖保肝作用的机理.白求恩医科大学学报，1996，22（1）：23
[13]李岩，曲绍春，孙文娟，等.北五味子粗多糖对环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的保护作用.白求恩医科大学学报，1995，21（6）：583
【摘 要】目的 建立五味子果实中五味子甲素含量的高效液相色谱测定方法。方法 样品用超声提取，过滤，取续滤液，采用高效液相色谱法直接测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇 -四氢呋喃 -水 （70：4：26）为流动相，进样量10μL，流速为lmL/min，检测波长为254nm进行检测。结果 五味子甲素的线性范围为0.125～1.25μg，R2为0.9992，平均加样回收率为99.2%，RSD为1.1%（n=6）。结论 此方法准确度较高，可用于测定五味子中五味子甲素的含量，为五味子生药及成品药中五味子甲素含量测定提供了一种切实可行的方法。
五味子属木兰科木质藤本植物。因其果实具甘、酸、辛、苦、咸五味而得名。分布于我东北及华北地区.是长白山地区大宗道地药材[1]。其药用部位为果实，主要含有木脂素类成分，被奉为《神农本草经》中上品，具有保肝、降酶、保护中枢神经系统、抗艾滋病毒、抗癌等多种药理活性，现代医学将五味子主要应用于肝病及神经衰弱的临床治疗[2]。本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定了五味子中五味子甲素的含量，为合理开发利用五味子资源提供了质量评价手段。
1、材料与方法
1.1 仪器与试剂 LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）配紫外检测器；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS210S-WEI型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），HH-S系列恒温水浴锅，WondaSil C18色谱柱（4.6mm×25cm，5μm）。 五味子甲素标准品（批号：110764），购于中国药品生物制品检定所；水为双蒸馏水，自制；其它试剂均为分析纯 。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件：色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂（250mm*4.6mm，5μm）；流动相：为甲醇 -四氢呋喃 -水 （70：4：26）；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温为室温；进样量10μL。灵敏度：0.05AUFS。按以上色谱条件测定，五味子甲素峰与其他杂质峰得到很好的分离，分离度大于2.0。理论塔板数按五味子甲素计算不低于3000。
1.2 .2 标准品溶液的制备：取经80℃干燥至恒重的五味子甲素对照品1.25mg，精确称量，置25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得五味子甲素对照品溶液（0.05mg/mL），备用。
1.2.3 样品溶液的制备：五味子干燥、粉碎 （40～60目 ） ，精密称取 1g左右 ，用甲醇以液固比 1：15的比例 ，超声波提取 30min， 静置待冷（约lh），吸取上清液。残渣用甲醇洗涤，过滤，共3次，合并滤液 ， 加甲醇溶解并稀释定容于 50mL容量瓶中，备用。
1.2.4 样品测定方法 ：用五味子甲素对照品不同的进样量，按仪器的色谱条件进行实验， 得到标准色谱图，并做峰面积与含量之间的标准工作曲线。而供试品溶液和阴性溶液直接取用，与标准色谱图相同条件进行实验，得到色谱图。根据保留时间和峰面积与标准工作曲线比较进行定性和定量分析。
2、结果
2.1 线性关系考察：精密吸取已经准备好的五味子甲素对照品溶液（0.05mg/mL）各2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μl进样测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，得回归方程如下： 五味子甲素：Y = 17977X + 39813，相关系数： r= 0.9992 结果表明，五味子甲素在0.125～1.25μg间有良好的线性关系。
通过HPLC方法，初步建立SLE的指纹图谱，指认主要色谱峰为Schizandrin， Gominsin A， Gominsin C， Deoxyschizandrin，γ-Schizandrin， Schizandrin C。 七周龄雄性昆明种小鼠用于应激性肝损伤实验，采用拘束应激动物模型来评价SLE的抗应激作用。18 h拘束负荷后诱发小鼠应激性肝损伤，分别用赖氏法测定小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）和皮质酮（Corticosterone）活性，硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛（MDA）水平，荧光酶标仪测定肝组织抗氧化能力指数（ORAC）水平，比色法测定肝组织自由基清除关键酶超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase， GPX）的活性，RT-PCR的方法测定肝脏SOD、GPX和糖皮质激素受体GR的mRNA表达的变化。拘束应激负荷18h后，正常对照组小鼠的ALT值为17.53±4.67IU/L，而应激模型组小鼠的ALT值为96.70±6.27 IU/L，拘束负荷小鼠血清ALT水平明显升高（P0.01），结果提示拘束应激可以造成严重的肝损伤。小鼠血浆Corticosterone水平显著升高，结果表明拘束应激负荷引起小鼠肝损伤与应激性激素水平的变化有关。给予五味子标准提取物可以明显降低拘束负荷诱发小鼠血清ALT活性升高，SLE低剂量组小鼠的ALT值为34.76±2.26IU/L，SLE高剂量组小鼠的ALT值为29.70±5.04IU/L，表明五味子标准提取物对应激性肝损伤有一定的保护作用。
降酶保肝作用：实验证明，五味子对四氯化碳引起的动物血清谷丙转氨酶（CPT）升高有抑制作用。种仁的醇提物明显降低试验性肝损害所致的高血清谷丙转氨酶。而果仁和种仁水煎剂则无效。说明其降酶的有效成分在种仁中可被醇溶解，不易溶于水。部分实验证明，用已分离出的单体γ-五味子素（五味子乙素）对肝细胞有一定保肝作用，并能加速肝组织再生。以四氯化碳造成肝损伤，经五味子制剂治疗后肝小叶坏死区缩小，含脂肪油的肝细胞明显减少，水解酶类、氧化酶、脱氢酶明显恢复，与对照组比较，治疗组动物中央坏死区肝细胞有较高的线粒体，进一步观察到应用五味子治疗的动物肝细胞中核酸、一般蛋白质、碱性蛋白质及结合的硫氨基的二硫基含量均较对照组高。所以认为五味子有助于肝细胞蛋白质的合成，从而使线粒体恢复和增加，相应的酶活性增高，肝细胞得以恢复和再生，发挥降酶保肝作用。 此外，研究发现与P815对照组相比应激模型组肝脏Fas/Fas-L mRAN表达比率明显下降（P0.01）。与应激模型组相比，SLE 100和200 mg/kg组小鼠肝脏Fas/Fas-L mRAN表达水平均明显上升，结果表明SLE也可能通过提高Fas/Fas-L mRAN表达水平来达到抵抗应激性肝癌转移的作用。
综上所述，五味子标准提取物SLE可以改善拘束应激负荷造成的小鼠肝脏损伤和肝脏癌转移，其改善机制可能与提高应激负荷机体免疫功能和缓解细胞内的过氧化损伤有关。因此，采用现代科学方法，从抗应激的角度揭示中药五味子标准提取物的肝保护用的科学内涵不仅具有迫切性，也必然形成有益的社会效益。
参考文献
[1]刘玉壶，罗献瑞，吴容芬。中国植物志30（1）[M].北京：科学出版社；1996：82
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[4]李海涛，胡刚.五味子醇甲抑制6-羟基多巴胺诱导PC12细胞凋亡的研究.南京中医药大学学报，2004，20（2）：96
[5]李莉，刘耕陶.五味子酚和丹酚酸A对H2O2引起大鼠脑神经细胞凋亡的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1996，10（2）：92
[6]李莉，刘耕陶.五味子酚对氧自由基引起大鼠脑突触体和线粒体损伤的保护作用.药学学报，1998，33（2）：81
[7]汪平君，郑青山.五味子与红参配伍对小鼠脑蛋白质及核酸含量的影响及组方分析.中国实验方剂学杂志，2000，6（3）：19
[8]于晓凤，睢大员，吕忠智，等.五味子粗多糖的初步药理研究.白求恩医科大学学报，1995，21（2）：147
[9]孙侃.北五味子对动物呼吸和血压的作用.药学学报，1959，7（7）：277
[10]许志奇，彭国瑞，曾祥国，等.红参、五味子防治小鼠慢性支气管炎的实验研究.中药药理与临床，1992，8（6）：28
[11]李秀娟，高文霞，冯玉霞.五味子对扑热息痛致肝脏毒性的保护作用.齐齐哈尔医学院学报，2001，22（7）：727
[12]高普军，朴云峰，郭晓林，等.北五味子粗多糖保肝作用的机理.白求恩医科大学学报，1996，22（1）：23
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