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［摘 要］ 目的 研究β_纤维蛋白原_455G/A(β_Fg_455G/A)基因多 态性对血浆纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)基因表达的影响及其与缺血性脑血管疾病发病的关 系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等 方法，检测DNA样品的β_Fg_455G/A多态性，采用血浆自动检测系统测定Fg水平。结 果 病例组A等位基因频率明显高于对照组(P＜0.05)。病例组血浆Fg水平明 显高于对照组(P＜0.01)，病例组和对照组中，携带A基因者血浆Fg水平明显增高(P ＜0.05)。结论 β_Fg_455G/A等位基因与血浆纤维蛋白原水平相关，A 基因携带者缺血性脑血管疾病发病率增高。提示β_Fg_455G/A可作为缺血性脑血管疾病的遗 传易感标志之一用于易感人群的检测。
［关键词］ 纤维蛋白原；基因多态性；缺血性脑血管病
中图分类号：R743；R197 文献 标识码：A 文章编号：1009_816X(2007)04_0232_ 03
Study on the relationship between β_Fibrinogen_455G/A Polymorphism a nd Ischemic Cerebral Vascular Disease. CHENG Jun-ying, LU Li-ping, DU Xiao-peng, et al. Department of neurology, Lishui People's Hospital, Zhejiang 3 23000, China
［Abstract］ Objective To study the relationship between β_fibr inogen_455G/A polymorphism, plasma fibrinogen level and ischemic cerebral vacsul ar disease. Methods Study included 82 patients with ischemic cer ebral vascular disase (P group) and 62 healthy people (C group). For all subject s, the polymorphism of β_fibrinogen_455G/A was analyzed by polymerase chain rea ction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RELP) technique. Plasma fibrinogen was measured by a computer assistant procedure. Results The frequency of -455A allele in P group was higher than in C group (P＜0 .05). The plasma fibrinogen level was significantly higher in P group than in C group (P＜0.01). Higher plasma fibrinogen level was shown in all subjects with A-455 alleles (P＜0.05). Conclusions The β_fibrinogen _455G/A allele is associated with elevated fibrinogen level and those with A all ele are prone to suffer ischemic cerebral vascular disease.
［Key words］ Fibrinogen; Gene polymorphism; Ischemic cerebral v ascular disease
随着我国老龄化社会的到来，缺血性脑血管疾病的发病率呈逐年上升趋 势。血浆纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)水平升高被认为是缺血性脑血管疾病的独立危险因素 之一［1］。目前研究多认为，Fg基因的多态性，尤其是其启动子区域的β_Fg_455G/ A基因多态性与血浆Fg水平密切相关，但与缺血性脑血管疾病的相关性有相反的报道［ 2，3］。本研究旨在观察β_Fg_455G/A基因多态性对血浆Fg及缺血性脑血管疾病发病的影 响，探讨Fg增高及缺血性脑血管疾病发病的可能机制，为缺血性脑血管疾病易感人群的 检测和早期防治提供可能的依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象：缺血性脑血管疾病患者82例，于2004年8月至2006年8月在我院住院，所有 病人均符合中华医学会第二次脑血管病学术会议第三次修订的诊断标准，并均经头颅CT或MR I检查证实；其中男55例，女27例，年龄35～86岁，平均年龄62±7.13岁。62例健康对照来 自丽水市职工健康体检，并排除心脑血管疾病、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病患者；其中， 男36例，女26例，平均年龄45±5.35岁。
1.2 实验方法：
1.2.1 标本采集：采集空腹静脉血2mL, EDTA抗凝，室温下离心10min,上层血浆用于测定Fg浓度，下层沉淀物中用酚氯仿法抽提DNA。
1.2.2 引物序列：①5’_AAGAATTTGGGAATGCAATCTCTGCTACC_3’；②5’_CTCCTCATTGTCG TTG ACACCTTGGGAC_3’。
1.2.3 β_Fg_455G/A基因多态性分析每50ul反应体系含10×buffer 5ul, 4×dNTP各1ul, 引物①、②各1ul,模板DNA 5ul, TaqDNA聚合酶2U,双蒸水32ul。PCR热循环条件为：94℃ 10 min变性；（1）94℃ 1min,（2）60℃ 1min,（3）72℃ 2min，（1）（2）（3）循环30次； 72℃ 7min。得到PCR产物，长度1300bp（见图1）。HaeIII酶切体系：10×buffer 2ul, Hae III 5u, PCR产物10ul，加双蒸水至20ul,混合后37℃水浴3h。将上述酶消化产物用2%琼脂糖 凝胶（含溴化乙锭0.5μg/mL),在1×TBE中电泳（电压5V/cm)40min,紫外检测仪分析电泳结 果（见图2)。
1.2.4 血浆Fg浓度测定：采用Fg功能自动检测方法，测定Fg水平（正常值：2.0～4.0g /L)。
1.3 统计分析：应用基因计数方法计算出A等位基因频率，采用χ2检验、t检验进 行比较，P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 β_Fg_455GA多态性与血浆Fg水平：病例组A等位基因频率明显高于对照组(P＜0 .05),病例组血浆Fg水平明显高于对照组(P＜0.01)，病例组和对照组中，携带A基因 者血浆Fg水平明显增高(P＜0.05），见表1。
2.2 β_Fg_455GA多态性与缺血性脑血管疾病：病例组中GG型34例，基因型频率为0.415,GA型46例，基因型频率为0.561，AA型2例，基因型频率0.024；A等位基因频率0.305。对 照组中，GG型39例，基因型频率0.677, GA型21例，基因型频率0.306, AA型2例，基因型 频率0.016；A等位基因频率0.202。病例组A等位基因频率明显高于对照组(P＜0.05） 。缺血性脑血管疾病患者血浆Fg水平5.03±0.71gL显著高于对照组血浆Fg水平2.86±1. 38gL(P＜0.01）。
3 讨论
Fg是重要的凝血因子，流行病学及病例对照研究表明，Fg水平增高是缺血性脑血管疾病的高 危因素之一［1］。近年来，遗传因素对血浆Fg水平的影响越来越受到人们的关注， 同时β_Fg_455G/A基因多态性与脑梗死的相关性有诸多研究，但结果不一［2，3］。 Fg β链的合成是整个Fg分子合成的限速步骤。Fgβ链基因5’端上游存在多个调控序列，影 响Fg基因的表达，-455G/A即是其中之一。Brown等人［4］通过竞争性结合的实验发 现在肝细胞核内有三种蛋白质能与β_Fg_455G/A两侧区域的(-468～439bp)DNA片段结合，其 中之一(ComplexIII)能牢固地与G_455结合，而与A_455则相反，可能具有类似阻遏蛋白的作 用。由于G_455易受到阻遏，可以解释为何A_455携带者血浆Fg水平高于GG基因型者。同时Br own等人还从培养的HepG2细胞中扩增含有Fgβ链-636～+16。碱基序列的DNA片段，将其克隆 至pGL2载体上，再转染HepG2细胞，pGL2A_455比pGL2G_455表达增高约1.4倍；用IL_6刺激1 6h后，发现pGL2G_455表达增高3.2倍，而pGL2A_455则增高了4.8倍，两者相差有统计学意 义(P＜0.05）。可见体外实验亦证明A等位基因与β链转录增高关联。本文就β_Fg_45 5G/A多态性进行了研究，无论是病例组还是对照组，A基因的携带者均较同组GG基因型者血浆 Fg水平明显增高，缺血性脑血管疾病患者的A等位基因频率明显高于对照组。这一结果略高 于国内外文献报道［5，6］。由此表明，β_Fg_455G/A多态性是导致血浆Fg水平差 异的因素之一，A基因携带者易患缺血性脑血管疾病。即β_Fg_455G/A位点单个碱基的改变 ，可能直接影响了Fg基因的表达，进而影响缺血性脑血管疾病的发病。
综上所述，β_Fg_455GA多态性与血浆Fg水平变化相关，G_455和A_455对Fg基因的表达有不 同的影响，从而引起血浆Fg水平的差异，A基因携带者更易患缺血性脑血管疾病，A_455可能 通过增高血浆Fg水平增加患缺血性脑血管疾病的危险。因此提示β_Fg_455GA基因可用于缺 血性脑血管疾病易感人群的检测，做到早期预防。同时，还可根据不同的基因类型，按不同 的危险因素将患者分类，以便进行个体化药物治疗。
参考文献
［1］Di Minno G, Cerbone A, Margaglione M, et al. Fibrinogen and mechani sms of thrombosis：a difficult link［J］．Eur J Epidemiol, 1992,1:88．
［2］董庆林，张晨．β_纤维蛋白原_455G/A基因多态性与脑梗死的相关性研究［J］．临床 神经病学杂志，2004，17,3：164-166.
［3］Kessler C, Spitaer C, Stauske D,et a1. The apolipoprotein E and beta_fibrin ogen G/A_455 gene polymorphisms are associated with ischemic stroke involving large_vessel disease［J］．Br J Haematol，1997,99：562-569.
［4］Brown ET, Fuller GM. Detection of a complex that associates with the beta f ibrinogen G_455G_A polymorphism［J］．Blood, 1998,92:3268-3293.
［5］Anne TH, Birgit AL, Stere E, et al．A common mutation(G_455A) in the β_Fib rinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of is chemic heart disease［J］． Clin Invest, 1997,99:3034-3039.
［6］钱进军，刘春分，赵康仁．脑梗死患者β纤维蛋白原-455G/A, -148C/T基因多态性和 血浆纤维蛋白原水平研究［J］.中风与神经疾病杂志，2004,21(2):147-149.
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
［关键词］ 纤维蛋白原；基因多态性；缺血性脑血管病
中图分类号：R743；R197 文献 标识码：A 文章编号：1009_816X(2007)04_0232_ 03
Study on the relationship between β_Fibrinogen_455G/A Polymorphism a nd Ischemic Cerebral Vascular Disease. CHENG Jun-ying, LU Li-ping, DU Xiao-peng, et al. Department of neurology, Lishui People's Hospital, Zhejiang 3 23000, China
［Abstract］ Objective To study the relationship between β_fibr inogen_455G/A polymorphism, plasma fibrinogen level and ischemic cerebral vacsul ar disease. Methods Study included 82 patients with ischemic cer ebral vascular disase (P group) and 62 healthy people (C group). For all subject s, the polymorphism of β_fibrinogen_455G/A was analyzed by polymerase chain rea ction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RELP) technique. Plasma fibrinogen was measured by a computer assistant procedure. Results The frequency of -455A allele in P group was higher than in C group (P＜0 .05). The plasma fibrinogen level was significantly higher in P group than in C group (P＜0.01). Higher plasma fibrinogen level was shown in all subjects with A-455 alleles (P＜0.05). Conclusions The β_fibrinogen _455G/A allele is associated with elevated fibrinogen level and those with A all ele are prone to suffer ischemic cerebral vascular disease.
［Key words］ Fibrinogen; Gene polymorphism; Ischemic cerebral v ascular disease
随着我国老龄化社会的到来，缺血性脑血管疾病的发病率呈逐年上升趋 势。血浆纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)水平升高被认为是缺血性脑血管疾病的独立危险因素 之一［1］。目前研究多认为，Fg基因的多态性，尤其是其启动子区域的β_Fg_455G/ A基因多态性与血浆Fg水平密切相关，但与缺血性脑血管疾病的相关性有相反的报道［ 2，3］。本研究旨在观察β_Fg_455G/A基因多态性对血浆Fg及缺血性脑血管疾病发病的影 响，探讨Fg增高及缺血性脑血管疾病发病的可能机制，为缺血性脑血管疾病易感人群的 检测和早期防治提供可能的依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象：缺血性脑血管疾病患者82例，于2004年8月至2006年8月在我院住院，所有 病人均符合中华医学会第二次脑血管病学术会议第三次修订的诊断标准，并均经头颅CT或MR I检查证实；其中男55例，女27例，年龄35～86岁，平均年龄62±7.13岁。62例健康对照来 自丽水市职工健康体检，并排除心脑血管疾病、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病患者；其中， 男36例，女26例，平均年龄45±5.35岁。
1.2 实验方法：
1.2.1 标本采集：采集空腹静脉血2mL, EDTA抗凝，室温下离心10min,上层血浆用于测定Fg浓度，下层沉淀物中用酚氯仿法抽提DNA。
1.2.2 引物序列：①5’_AAGAATTTGGGAATGCAATCTCTGCTACC_3’；②5’_CTCCTCATTGTCG TTG ACACCTTGGGAC_3’。
1.2.3 β_Fg_455G/A基因多态性分析每50ul反应体系含10×buffer 5ul, 4×dNTP各1ul, 引物①、②各1ul,模板DNA 5ul, TaqDNA聚合酶2U,双蒸水32ul。PCR热循环条件为：94℃ 10 min变性；（1）94℃ 1min,（2）60℃ 1min,（3）72℃ 2min，（1）（2）（3）循环30次； 72℃ 7min。得到PCR产物，长度1300bp（见图1）。HaeIII酶切体系：10×buffer 2ul, Hae III 5u, PCR产物10ul，加双蒸水至20ul,混合后37℃水浴3h。将上述酶消化产物用2%琼脂糖 凝胶（含溴化乙锭0.5μg/mL),在1×TBE中电泳（电压5V/cm)40min,紫外检测仪分析电泳结 果（见图2)。
1.2.4 血浆Fg浓度测定：采用Fg功能自动检测方法，测定Fg水平（正常值：2.0～4.0g /L)。
1.3 统计分析：应用基因计数方法计算出A等位基因频率，采用χ2检验、t检验进 行比较，P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 β_Fg_455GA多态性与血浆Fg水平：病例组A等位基因频率明显高于对照组(P＜0 .05),病例组血浆Fg水平明显高于对照组(P＜0.01)，病例组和对照组中，携带A基因 者血浆Fg水平明显增高(P＜0.05），见表1。
2.2 β_Fg_455GA多态性与缺血性脑血管疾病：病例组中GG型34例，基因型频率为0.415,GA型46例，基因型频率为0.561，AA型2例，基因型频率0.024；A等位基因频率0.305。对 照组中，GG型39例，基因型频率0.677, GA型21例，基因型频率0.306, AA型2例，基因型 频率0.016；A等位基因频率0.202。病例组A等位基因频率明显高于对照组(P＜0.05） 。缺血性脑血管疾病患者血浆Fg水平5.03±0.71gL显著高于对照组血浆Fg水平2.86±1. 38gL(P＜0.01）。
3 讨论
Fg是重要的凝血因子，流行病学及病例对照研究表明，Fg水平增高是缺血性脑血管疾病的高 危因素之一［1］。近年来，遗传因素对血浆Fg水平的影响越来越受到人们的关注， 同时β_Fg_455G/A基因多态性与脑梗死的相关性有诸多研究，但结果不一［2，3］。 Fg β链的合成是整个Fg分子合成的限速步骤。Fgβ链基因5’端上游存在多个调控序列，影 响Fg基因的表达，-455G/A即是其中之一。Brown等人［4］通过竞争性结合的实验发 现在肝细胞核内有三种蛋白质能与β_Fg_455G/A两侧区域的(-468～439bp)DNA片段结合，其 中之一(ComplexIII)能牢固地与G_455结合，而与A_455则相反，可能具有类似阻遏蛋白的作 用。由于G_455易受到阻遏，可以解释为何A_455携带者血浆Fg水平高于GG基因型者。同时Br own等人还从培养的HepG2细胞中扩增含有Fgβ链-636～+16。碱基序列的DNA片段，将其克隆 至pGL2载体上，再转染HepG2细胞，pGL2A_455比pGL2G_455表达增高约1.4倍；用IL_6刺激1 6h后，发现pGL2G_455表达增高3.2倍，而pGL2A_455则增高了4.8倍，两者相差有统计学意 义(P＜0.05）。可见体外实验亦证明A等位基因与β链转录增高关联。本文就β_Fg_45 5G/A多态性进行了研究，无论是病例组还是对照组，A基因的携带者均较同组GG基因型者血浆 Fg水平明显增高，缺血性脑血管疾病患者的A等位基因频率明显高于对照组。这一结果略高 于国内外文献报道［5，6］。由此表明，β_Fg_455G/A多态性是导致血浆Fg水平差 异的因素之一，A基因携带者易患缺血性脑血管疾病。即β_Fg_455G/A位点单个碱基的改变 ，可能直接影响了Fg基因的表达，进而影响缺血性脑血管疾病的发病。
综上所述，β_Fg_455GA多态性与血浆Fg水平变化相关，G_455和A_455对Fg基因的表达有不 同的影响，从而引起血浆Fg水平的差异，A基因携带者更易患缺血性脑血管疾病，A_455可能 通过增高血浆Fg水平增加患缺血性脑血管疾病的危险。因此提示β_Fg_455GA基因可用于缺 血性脑血管疾病易感人群的检测，做到早期预防。同时，还可根据不同的基因类型，按不同 的危险因素将患者分类，以便进行个体化药物治疗。
参考文献
［1］Di Minno G, Cerbone A, Margaglione M, et al. Fibrinogen and mechani sms of thrombosis：a difficult link［J］．Eur J Epidemiol, 1992,1:88．
［2］董庆林，张晨．β_纤维蛋白原_455G/A基因多态性与脑梗死的相关性研究［J］．临床 神经病学杂志，2004，17,3：164-166.
［3］Kessler C, Spitaer C, Stauske D,et a1. The apolipoprotein E and beta_fibrin ogen G/A_455 gene polymorphisms are associated with ischemic stroke involving large_vessel disease［J］．Br J Haematol，1997,99：562-569.
［4］Brown ET, Fuller GM. Detection of a complex that associates with the beta f ibrinogen G_455G_A polymorphism［J］．Blood, 1998,92:3268-3293.
［5］Anne TH, Birgit AL, Stere E, et al．A common mutation(G_455A) in the β_Fib rinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of is chemic heart disease［J］． Clin Invest, 1997,99:3034-3039.
［6］钱进军，刘春分，赵康仁．脑梗死患者β纤维蛋白原-455G/A, -148C/T基因多态性和 血浆纤维蛋白原水平研究［J］.中风与神经疾病杂志，2004,21(2):147-149.
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。