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摘要：【目的】明确氨氮对尖吻鲈（Lates calcarifer）稚鱼消化酶及抗氧化酶活性的影响，为提高尖吻鲈仔、稚鱼养殖存活率及丰富尖吻鲈养殖生态学理论提供依据。【方法】对15日龄的尖吻鲈稚鱼进行急性氨氮胁迫试验，分别于氨氮胁迫0、6、12、24、36、48、72和96 h时测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶及脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）、胰蛋白酶（TRYP）等消化酶活性，揭示急性氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼抗氧化酶及消化酶的变化规律。【结果】氨氮胁迫下，5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性在胁迫36 h后显著高于对照组（P<0.05，下同），10 mg/L处理组除胁迫72 h外，其他时间点均低于对照组；5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼POD活性随胁迫时间的延长始终高于对照组，10 mg/L处理组在胁迫6～36 h时远高于对照组，但低于5 mg/L处理组；5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性在整个试验过程中均显著高于对照组，10 mg/L处理组的CAT活性变化波动明显，整体上呈上升—下降的交替式变化趋势；5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性呈先下降后上升的变化趋势，且从试验开始后各时间点均显著低于对照组，10 mg/L处理组整体上呈上升—下降—上升—下降的变化趋势；5和10 mg/L处理组的尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性变化趋势基本一致，先保持相对稳定，后随胁迫时间延长呈上升—下降—上升的变化趋势。在消化酶方面，5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性从氨氮胁迫36 h起显著低于对照组，10 mg/L处理组从胁迫12 h起呈上升—下降—上升—下降的变化趋势；5和10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性整体上呈先下降后上升的变化趋势，而TRYP活性均呈阶段性的上升—下降交替变化趋势。【结论】氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶具有明显影响，在短时间（<6 h）内尖吻鲈稚鱼对氨氮有一定耐受性，SOD、CAT等部分抗氧化酶在氨氮浓度的剧烈变化下其活性诱导增强以消除体内过多的自由基，消化酶活性呈不同程度的升高则是为了补充机体能量消耗。
关键词： 尖吻鲈；稚鱼；氨氮胁迫；抗氧化酶；消化酶
中图分类号： S965.211 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2087-09
0 引言
【研究意义】氨氮是养殖环境中重要的水质指标，一般分为离子氨和非离子氨两大类（刘洪展等，2012）。非离子氨在低浓度下即会对鱼类产生较强的毒性作用，而离子氨的毒性相对较小（龙章强，2008）。大多数硬骨鱼类对非离子氨非常敏感，当其浓度大幅度超标时会直接损伤鳃组织，渗透进入血液淋巴组织，影响机体呼吸及免疫功能（de Freitas Rebelo et al.，2000；Koo et al.，2015），甚至引起发病死亡（Benli et al.，2008）。氨氮是引发鱼病的主要环境因子，当鱼类个体受氨氮刺激尤其在超出其可调节阈值时，机体抗氧化酶系统受损，鳃、肾脏及肝脏组织结构发生病变，机体呼吸及排泄系统将遭到破坏，进而影响机体的正常生理功能（王琨，2007）。因此，研究氨氮胁迫对水产动物生理指标及组织结构的影响，可为胁迫因子对机体的影响监测提供基础指标及明确鱼类对氨氮的耐受性，对促进水产养殖可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外学者已开展大量关于氨氮胁迫对水生生物影响的研究，如栉孔扇贝（Chlamys farreri）（樊甄姣等，2005）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（洪美玲等，2007）、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. areus）（韩春艳等，2014）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）（黎庆等，2015）等。不同水生生物对氨氮的耐受能力不同，同一物种不同规格及不同地理群体的氨氮耐受性也存在差异（王贞杰等，2017）。黄鹤忠等（2006）研究发现，随氨氮胁迫浓度的增加和胁迫时间的延长，中华绒螯蟹非特异性免疫防御系统遭受损伤的同时，其机体清除自由基的能力下降，导致细胞或组织受到伤害甚至出现死亡。邱德全等（2008）研究表明，高浓度的氨氮对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）影响显著，可致使对虾血细胞数减少，抗病酶活指标下降，进而严重影响噬菌体清除副溶血弧菌的效果，提示以噬菌体防治对虾弧菌病必须在水质条件良好的前提下才能发挥作用。强俊等（2011）探讨了氨氮和养殖密度对吉富罗非鱼幼鱼生长的联合影响，结果表明，氨氮浓度为0.02～0.20 mg/L，养殖密度在1～2尾/10 L时，幼鱼特定生长率较高；氨氮浓度高于0.20 mg/L，养殖密度为3尾/10 L左右时，生长速度较快。可见，氨氮胁迫下机体抗氧化系统受到严重干扰，鳃、肝脏及肾脏组织结构受损，显著影响个体消化酶活力，进而影响个体的生长与存活（艾春香和曾媛媛，2011；任海等，2014；李利红等，2015；王程昊等，2017）。因此，在实际生产中可通过加注新水或充氧等方式，降低非離子氨的毒性，以减少集约化养殖中氨氮胁迫的发生概率。【本研究切入点】尖吻鲈（Lates calcarifer）俗称金目鲈或红目鲈，隶属于鲈形目（Perciforme）鲈亚目（Percoidei）尖吻鲈科（Latidae），为暖水广盐性和降海产卵鱼类（Guiguen et al.，1994），广泛分布于印度及西太平洋地区（赵旺等，2017）。尖吻鲈生长迅速、肉质细嫩、口感鲜美，且养殖周期短，已成为热带、亚热带地区网箱和池塘养殖的热门鱼种（莫介化等，2002；孙典荣等，2012）。目前，国内外针对尖吻鲈的研究主要集中在人工繁育（杜涛等，2010）、营养成分分析（李卓佳等，2011）、分子标记（Wang et al.，2011；Newton et al.，2012）、捕食动力学（Robeiro and Qin，2015）等方面，而鲜见有关环境胁迫的研究报道。【拟解决的关键问题】研究氨氮急性胁迫下尖吻鲈稚鱼多种抗氧化酶和消化酶的变化规律，明确氨氮对其存活与生长的影响机制，为提高尖吻鲈仔、稚鱼养殖存活率及丰富尖吻鲈养殖生态学理论提供依据。 1 材料与方法
1. 1 试验材料
尖吻鲈受精卵由中国水产科学研究院南海水产研究所海南热带水产研究开发中心自行催产获得，受精卵于27.5 ℃水箱中平衡20 min后轻缓倒入500 L的玻璃纤维孵化器中孵化和暂养。养殖用水参数：温度（29.0±1.0）℃，pH 8.0～8.2，盐度（33.0±0.8）‰，溶氧≥6.5 mg/L，亚硝酸盐<0.03 mg/L，氨氮<0.01 mg/L，每日换水2次，每次换水10%，光照强度调至2000 lx。2日龄起投喂轮虫（Brachionus rotundiformis），轮虫密度10～20 ind/mL直至9日龄（4.50±0.10 mm），7日龄起混合投喂卤虫无节幼体（密度20～30 ind/mL），轮虫密度不变直至15日龄。生物饵料需进行营养强化后进行投喂，强化剂品牌为S.presso（INVE Aquaculture，Salt Lake City，UT，USA）。投喂轮虫时加入海水拟微球藻（Nannocho-loropsis sp. 青岛宏邦生物科技有限公司），以保证饵料充足及水體环境良好。每日定时清理排水口过滤网及育苗桶中的剩余饵料和排泄物。
1. 2 试验设计
正式试验开始前先进行预试验，将分析纯NH4Cl配制成不同浓度的溶液，观察尖吻鲈稚鱼的行为及存活状况，以获得96 h 100%死亡质量浓度（96 h-LC100）并确定NH4Cl浓度上限。本研究采用96 h半静水毒性试验法。为消除不同批次间的差异，试验鱼均来自同批受精卵且不重复使用，体长17.61±1.45 mm。试验用水为过滤的海水，其参数与养殖用水相同，试验过程控制pH在8.1并停止投食。参照龙章强（2008）的研究方法，设0（对照）、5和10 mg/L共3个氨氮浓度梯度组，每组3个平行（养殖容器），每个容器（50 L）内投放120尾15日龄健康尖吻鲈稚鱼，分别于0、6、12、24、36、48、72和96 h随机取样5尾。同时，每隔3 h从各容器中收集水样，及时调整至设定氨氮浓度。试验过程中定时观察记录尖吻鲈的中毒症状、存活率及生理活性状况，其中死亡判断标准为鱼鳃停止煽动超过15 s即视为死亡。
1. 3 样品处理
各试验组所取样品（尖吻鲈稚鱼）吸干体表水分后称量体质量，然后与0.2 mol/L生理盐水按指定比例进行研磨，研磨液在2.0 ℃下15000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃保存备用。各消化酶及抗氧化酶活性均采用相关试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行测定，酶活性以U/mg或U/g表示。
1. 4 统计分析
试验数据采用SPSS 19.0进行分析，先对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），若不同处理组间存在显著差异，再进行Duncan?s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼行为及存活率的影响
在各氨氮处理组中，随氨氮含量的升高，尖吻鲈稚鱼呈现出一定的应激行为，临床表现为狂躁不安、呼吸急促及痉挛，鳃盖煽动频率加快、局部充血及体表黏液分泌增多等；胁迫12 h左右时稚鱼活动缓慢，失去躲避能力，但经24 h适应后5 mg/L处理组个体基本恢复正常，10 mg/L处理组的应激程度减弱。10 mg/L处理组个别个体出现体色变淡现象，并于胁迫48 h后出现死亡个体，死亡鱼体僵硬弯曲、背鳍胸鳍张开，鳃盖及口裂亦剧烈张开，至试验结束时的存活率为99%；其余两处理组的尖吻鲈稚鱼存活率均为100%。
2. 2 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼抗氧化酶活性的影响
2. 2. 1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 由图1可知，不同氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性变化趋势存在明显差异。其中，5 mg/L处理组稚鱼SOD活性在胁迫6～24 h显著低于对照组（P<0.05，下同），于胁迫24 h时达最低值，胁迫24～36 h迅速上升至最高值，胁迫36～48 h酶活性略有下降，此后趋于平稳，从胁迫36 h起尖吻鲈稚鱼SOD活性始终高于对照组；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性呈下降—上升—下降—上升—下降的变化趋势，除胁迫72 h外，其他时间点均低于对照组。
2. 2. 2 过氧化物酶（POD）活性 由图2可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼POD活性变化趋势存在明显差异。在胁迫24 h内，2个氨氮处理组（5和10 mg/L）的尖吻鲈稚鱼POD活性变化趋势基本一致，但从胁迫24 h后二者的变化趋势截然不同；在整个试验过程中，5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼POD活性均显著高于对照组。
2. 2. 3 过氧化氢酶（CAT）活性 由图3可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性在整个试验过程中均显著高于对照组，整体上呈上升—下降—上升的变化趋势；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性变化波动明显，胁迫0～12 h呈缓慢上升趋势，从胁迫24 h起呈明显的上升—下降交替式波动变化趋势，且从胁迫36 h起尖吻鲈稚鱼CAT活性显著高于对照组。
2. 2. 4 酸性磷酸酶（ACP）活性 由图4可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性呈先下降后上升的变化趋势，在胁迫36 h时达最低值，且从试验开始后各时间点均显著低于对照组；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性整体上呈上升—下降—上升—下降的变化趋势，于胁迫48 h时达最高值，胁迫12 h后其ACP活性显著高于5 mg/L处理组和对照组。
2. 2. 5 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性 由图5可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性在胁迫6 h内迅速下降，胁迫6～36 h的变化相对较平缓，此后呈明显的上升—下降—上升变化趋势，整个试验过程中GSH-Px活性均低于对照组。10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性在胁迫36 h内显著低于对照组，但显著高于5 mg/L处理组，且整体上呈下降趋势；此后的GSH-Px活性变化趋势与5 mg/L处理组一致（上升—下降—上升），但活性高于5 mg/L处理组和对照组。 2. 3 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶活性的影响
2. 3. 1 脂肪酶（LPS）活性 由图6可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性整体上呈先上升再下降的变化趋势，于胁迫24 h时达最高值，至试验结束（胁迫96 h）时降至最低值，从胁迫12 h起尖吻鲈稚鱼LPS活性与对照组存在显著差异；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性在胁迫12 h内与对照组无显著差异，此后呈上升—下降—上升—下降的变化趋势，于胁迫72 h时达最高值，且从胁迫24 h起尖吻鲈稚鱼LPS活性显著高于5 mg/L处理组和对照组。
2. 3. 2 淀粉酶（AMS）活性 由图7可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性在氨氮胁迫即开始迅速下降，至胁迫24 h时达最低值，然后快速上升，至胁迫36 h时其AMS活性显著高于对照组，协迫36～48 h略有下降，之后持续上升，至试验结束（胁迫96 h）时达最高值；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性在胁迫6 h后迅速下降，于胁迫12 h时达最低值，然后持续上升，至胁迫72 h时达最高值，协迫72～96 h又呈下降趋势。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性在胁迫6和24 h时显著低于10 mg/L处理组和对照组，在胁迫36和96 h时则显著高于10 mg/L处理组和对照组。
2. 3. 3 胰蛋白酶（TRYP）活性 由图8可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼TRYP活性变化趋势基本一致，2个氨氮处理组（5和10 mg/L）尖吻鲈稚鱼TRYP活性均呈阶段性的上升—下降交替变化趋势。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼TRYP酶活性的最高值和最低值分别出现在胁迫6和12 h，10 mg/L处理组的最高值和最低值分别出现在胁迫72和48 h。
3 讨论
3. 1 氨氮对尖吻鲈稚鱼存活及活力的影响
高浓度氨氮刺激下，吉富罗非鱼幼鱼会出现胸鳍充血等症状（肖炜等，2015），而团头鲂幼鱼在氨氮胁迫下其鳃丝上皮组织增生，毛细血管扩张，鳃小片变短、卷曲、融合，肝细胞空泡化、充血、血窦扩张（张武肖等，2015）。本研究观察发现，在急性氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼也出现局部充血症状，且中毒初期表现出一定的应激行为，包括狂躁不安、频繁发生碰撞或侧翻，呼吸急促、鳃盖煽动频率加快。随着氨氮胁迫时间的延长和胁迫浓度的增加，尖吻鲈稚鱼个体活力降低，在中毒后期表现出呼吸受阻、活动缓慢，失去躲避能力，局部充血、体表黏液分泌增多及痉挛濒死等。尤其是高浓度（10 mg/L）处理组的尖吻鲈稚鱼还出现体色变淡、发白现象，且在胁迫48 h内出现死亡个体，死亡鱼体僵硬弯曲、背鳍胸鳍张开，鳃盖及口裂亦剧烈张开。氨氮胁迫前期尖吻鲈稚鱼呼吸急促，运动加剧，是由于高浓度氨氮致使其血氨浓度快速增加，而需在一定程度上提高机体换气率（Zhang and Wood，2009）。李波等（2011）研究表明，高浓度氨氮胁迫组黄颡鱼在试验开始即表现出强烈的应激反应，沿杯壁或在水上层快速游窜。杜浩等（2017）也曾研究发现，中华鱘稚鱼在高浓度氨氮中暴露1 h后，其平均心率显著高于对照组。此外，黄厚见（2012）研究发现，刚受氨氮胁迫的梭鱼幼鱼活动增加，高浓度组尤其明显，随着胁迫时间的延长，幼鱼运动明显减少，频临死亡的幼鱼身体剧烈抽搐，部分幼鱼嘴张开，鳃丝充血，鳃盖外翻，随后幼鱼原地打转，逐渐下沉、死亡。张武肖等（2015）研究急性氨氮胁迫对团头鲂幼鱼肝脏、肾脏和鳃组织结构的影响时发现，不同器官的损伤程度不同，以肝脏组织受损最严重，但鳃组织损伤易引发呼吸受阻，最终导致死亡。这些研究充分验证了氨氮的毒性机理。
3. 2 氨氮对尖吻鲈稚鱼抗氧化酶活性的影响
生态因子发生改变将诱发一系列的应激反应，其中活性氧自由基的大量产生会导致机体受损（胡静等，2015，2016）。机体免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫两类，鱼类的非特异性免疫在应对逆环境应激中起主导作用，具体表现为SOD、POD、CAT、ACP和GSH-Px等酶类在免疫调节中发挥重要作用。其中，SOD和CAT是机体发生氧化代谢的酶类，二者协同作用，使自由基的产生和清除达动态平衡，减少机体氧化损伤，是机体内重要的保护酶系统（鲁双庆等，2002；Martínez-?lvarez et al.，2005；臧学磊，2010；苏慧等，2012；韩春艳等，2014）；CAT与GSH-Px联合可将SOD反应产物进一步还原成分子氧和水，最终达到保护机体的目的（张克烽等，2007）；ACP广泛存在于生物体内，在酸性条件下打开磷酸酯键，将带有磷酸酯的异物水解，减少个体感染概率，还可改变或修饰外源异物的表面结构，促使血细胞更准确地识别异物，有助于提升吞噬细胞吞噬及降解异物的速度，具有离子分泌、机体防御、免疫调节等重要生理作用（Foss et al.，2009；Paust et al.，2011；班同等，2013）。本研究结果表明，在氨氮胁迫初期（胁迫6 h内）尖吻鲈稚鱼SOD活性呈下降趋势，胁迫36 h后5 mg/L处理组的SOD活性显著高于对照组；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性除胁迫72 h外，其他时间点均低于对照组。SOD活性呈先升高后下降的变化趋势与氨氮胁迫下脊尾白虾血淋巴及肝胰腺SOD活性的变化趋势（任海等，2014）一致。其原因可能是胁迫初期机体表现出积极作用，较低浓度的氨氮对SOD活性有诱导作用，且这种诱导作用体现在活性氧自由基水平升高，为维持机体组织抗氧化水平平衡而应对外界胁迫的生理调节，引发机体SOD活性代偿性升高；在氨氮胁迫后期，低浓度氨氮组SOD活性始终保持高水平，而高浓度氨氮组并未出现回升趋势且酶活性下降，说明在长时间胁迫下，高浓度氨氮胁迫可能已对尖吻鲈组织产生不可逆的毒害作用，破坏其正常组织的生理功能，机体调节氨氮胁迫的能力越来越弱，致使尖吻鲈体内出现过多的自由基而抑制SOD活性。 POD的主要作用是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物，其与SOD活性变化在一定程度上能反映机体在胁迫环境下免疫水平的变化，故可将二者结合作为水环境中氨氮胁迫的敏感生物指示剂。在本研究中，5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼POD活性随胁迫时间的延长始终高于对照组， 10 mg/L处理组的POD活性在胁迫6～24 h时远高于对照组，但低于5 mg/L处理组，表明氨氮对尖吻鲈稚鱼POD活性产生了抑制效应。本研究结果与樊甄姣等（2005）研究发现高浓度氨氮胁迫引起栉孔扇贝抗氧化系统受抑制的现象、赵海涛（2006）研究发现氨氮胁迫下南方鲇（Silurus meridionalis Chen）POD活性的变化规律一致，可能是高浓度氨氮引起油脂过氧化物反应并产生过多的H2O2，POD需分解大量H2O2而引起机体血清中POD活性下降，即鱼体抗氧化能力减弱，说明长时间氨氮胁迫导致抗氧化系统中活性反应组分损伤。氨氮在机体内部是一种累积效应，当其在体内的累积超过一定程度时即表现出中毒症状，POD活性下降（李飞等，2005）。GSH-Px在保护肝脏和清除体内自由基方面发挥重要作用（Sun et al.，2012）。本研究结果表明，氨氮胁迫36 h内尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性先保持相对稳定，且随胁迫时间的延长和胁迫程度的加深，GSH-Px活性始终低于对照组；10 mg/L处理组胁迫36～96 h时尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性呈先升高后快速下降再次升高的变化趋势，其原因是氨氮胁迫下尖吻鲈免疫组织具有一定的适应性，GSH-Px活性反馈性增强旨在对抗外界环境变化产生多余的活性氧，与韩春艳等（2014）的研究结果一致。此外，本研究结果表明，低浓度氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼合成的ACP不足以清除异物，高浓度氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼需合成更多ACP以提升机体的防御能力；氨氮胁迫下，2个氨氮处理组（5和10 mg/L）的尖吻鲈稚鱼CAT活性均高于对照组，可能是氨氮诱导尖吻鲈通过新陈代谢以应对环境胁迫，因此CAT活性的提升可视为生物体对新陈代谢的适应（强俊等，2011；姜会民，2012）。
3. 3 氨氮对尖吻鲈稚鱼消化酶活性的影响
消化酶活性能反映水产动物消化生理的基本特征。环境因子的改变引发机体较正常代谢消耗更多能量，在一定程度上即要求消化酶活性更高，用于消化食物以保证能量供给（徐武杰等，2011）。本研究結果表明， 5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼的LPS活性在氨氮胁迫36 h后开始显著低于对照组，而10 mg/L处理组LPS活性呈下降—上升—下降的变化趋势，说明在高浓度氨氮胁迫下，机体需要摄入额外的食物或大量利用体内现存的脂肪类物质，以补充所消耗的能量。在AMS活性方面，5和10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性整体上呈先下降后上升的变化趋势，与高体革鯻AMS活性在盐度胁迫下的变化趋势（张龙岗等，2011）一致，也说明机体需动用淀粉类物质，以补充逆境胁迫引发机体调节所消耗的能量。TRYP活性直接影响机体消化道对蛋白的吸收效率和代谢水平（徐武杰等，2011；张龙岗等，2011）。在氨氮胁迫下，5和10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼TRYP活性均呈阶段性的上升—下降交替变化趋势，表明机体在氨氮应激中分泌更多TRYP，以分解机体内的蛋白类物质，补充氨氮胁迫引发的能量消耗。
4 结论
氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶具有明显影响，在短时间（<6 h）内尖吻鲈稚鱼对氨氮有一定耐受性，SOD、CAT等部分抗氧化酶在氨氮浓度的剧烈变化下其活性诱导增强以消除体内过多的自由基，消化酶活性呈不同程度的升高则是为了补充机体能量消耗。
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 尖吻鲈；稚鱼；氨氮胁迫；抗氧化酶；消化酶
中图分类号： S965.211 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2087-09
0 引言
【研究意义】氨氮是养殖环境中重要的水质指标，一般分为离子氨和非离子氨两大类（刘洪展等，2012）。非离子氨在低浓度下即会对鱼类产生较强的毒性作用，而离子氨的毒性相对较小（龙章强，2008）。大多数硬骨鱼类对非离子氨非常敏感，当其浓度大幅度超标时会直接损伤鳃组织，渗透进入血液淋巴组织，影响机体呼吸及免疫功能（de Freitas Rebelo et al.，2000；Koo et al.，2015），甚至引起发病死亡（Benli et al.，2008）。氨氮是引发鱼病的主要环境因子，当鱼类个体受氨氮刺激尤其在超出其可调节阈值时，机体抗氧化酶系统受损，鳃、肾脏及肝脏组织结构发生病变，机体呼吸及排泄系统将遭到破坏，进而影响机体的正常生理功能（王琨，2007）。因此，研究氨氮胁迫对水产动物生理指标及组织结构的影响，可为胁迫因子对机体的影响监测提供基础指标及明确鱼类对氨氮的耐受性，对促进水产养殖可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外学者已开展大量关于氨氮胁迫对水生生物影响的研究，如栉孔扇贝（Chlamys farreri）（樊甄姣等，2005）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（洪美玲等，2007）、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. areus）（韩春艳等，2014）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）（黎庆等，2015）等。不同水生生物对氨氮的耐受能力不同，同一物种不同规格及不同地理群体的氨氮耐受性也存在差异（王贞杰等，2017）。黄鹤忠等（2006）研究发现，随氨氮胁迫浓度的增加和胁迫时间的延长，中华绒螯蟹非特异性免疫防御系统遭受损伤的同时，其机体清除自由基的能力下降，导致细胞或组织受到伤害甚至出现死亡。邱德全等（2008）研究表明，高浓度的氨氮对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）影响显著，可致使对虾血细胞数减少，抗病酶活指标下降，进而严重影响噬菌体清除副溶血弧菌的效果，提示以噬菌体防治对虾弧菌病必须在水质条件良好的前提下才能发挥作用。强俊等（2011）探讨了氨氮和养殖密度对吉富罗非鱼幼鱼生长的联合影响，结果表明，氨氮浓度为0.02～0.20 mg/L，养殖密度在1～2尾/10 L时，幼鱼特定生长率较高；氨氮浓度高于0.20 mg/L，养殖密度为3尾/10 L左右时，生长速度较快。可见，氨氮胁迫下机体抗氧化系统受到严重干扰，鳃、肝脏及肾脏组织结构受损，显著影响个体消化酶活力，进而影响个体的生长与存活（艾春香和曾媛媛，2011；任海等，2014；李利红等，2015；王程昊等，2017）。因此，在实际生产中可通过加注新水或充氧等方式，降低非離子氨的毒性，以减少集约化养殖中氨氮胁迫的发生概率。【本研究切入点】尖吻鲈（Lates calcarifer）俗称金目鲈或红目鲈，隶属于鲈形目（Perciforme）鲈亚目（Percoidei）尖吻鲈科（Latidae），为暖水广盐性和降海产卵鱼类（Guiguen et al.，1994），广泛分布于印度及西太平洋地区（赵旺等，2017）。尖吻鲈生长迅速、肉质细嫩、口感鲜美，且养殖周期短，已成为热带、亚热带地区网箱和池塘养殖的热门鱼种（莫介化等，2002；孙典荣等，2012）。目前，国内外针对尖吻鲈的研究主要集中在人工繁育（杜涛等，2010）、营养成分分析（李卓佳等，2011）、分子标记（Wang et al.，2011；Newton et al.，2012）、捕食动力学（Robeiro and Qin，2015）等方面，而鲜见有关环境胁迫的研究报道。【拟解决的关键问题】研究氨氮急性胁迫下尖吻鲈稚鱼多种抗氧化酶和消化酶的变化规律，明确氨氮对其存活与生长的影响机制，为提高尖吻鲈仔、稚鱼养殖存活率及丰富尖吻鲈养殖生态学理论提供依据。 1 材料与方法
1. 1 试验材料
尖吻鲈受精卵由中国水产科学研究院南海水产研究所海南热带水产研究开发中心自行催产获得，受精卵于27.5 ℃水箱中平衡20 min后轻缓倒入500 L的玻璃纤维孵化器中孵化和暂养。养殖用水参数：温度（29.0±1.0）℃，pH 8.0～8.2，盐度（33.0±0.8）‰，溶氧≥6.5 mg/L，亚硝酸盐<0.03 mg/L，氨氮<0.01 mg/L，每日换水2次，每次换水10%，光照强度调至2000 lx。2日龄起投喂轮虫（Brachionus rotundiformis），轮虫密度10～20 ind/mL直至9日龄（4.50±0.10 mm），7日龄起混合投喂卤虫无节幼体（密度20～30 ind/mL），轮虫密度不变直至15日龄。生物饵料需进行营养强化后进行投喂，强化剂品牌为S.presso（INVE Aquaculture，Salt Lake City，UT，USA）。投喂轮虫时加入海水拟微球藻（Nannocho-loropsis sp. 青岛宏邦生物科技有限公司），以保证饵料充足及水體环境良好。每日定时清理排水口过滤网及育苗桶中的剩余饵料和排泄物。
1. 2 试验设计
正式试验开始前先进行预试验，将分析纯NH4Cl配制成不同浓度的溶液，观察尖吻鲈稚鱼的行为及存活状况，以获得96 h 100%死亡质量浓度（96 h-LC100）并确定NH4Cl浓度上限。本研究采用96 h半静水毒性试验法。为消除不同批次间的差异，试验鱼均来自同批受精卵且不重复使用，体长17.61±1.45 mm。试验用水为过滤的海水，其参数与养殖用水相同，试验过程控制pH在8.1并停止投食。参照龙章强（2008）的研究方法，设0（对照）、5和10 mg/L共3个氨氮浓度梯度组，每组3个平行（养殖容器），每个容器（50 L）内投放120尾15日龄健康尖吻鲈稚鱼，分别于0、6、12、24、36、48、72和96 h随机取样5尾。同时，每隔3 h从各容器中收集水样，及时调整至设定氨氮浓度。试验过程中定时观察记录尖吻鲈的中毒症状、存活率及生理活性状况，其中死亡判断标准为鱼鳃停止煽动超过15 s即视为死亡。
1. 3 样品处理
各试验组所取样品（尖吻鲈稚鱼）吸干体表水分后称量体质量，然后与0.2 mol/L生理盐水按指定比例进行研磨，研磨液在2.0 ℃下15000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃保存备用。各消化酶及抗氧化酶活性均采用相关试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行测定，酶活性以U/mg或U/g表示。
1. 4 统计分析
试验数据采用SPSS 19.0进行分析，先对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），若不同处理组间存在显著差异，再进行Duncan?s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼行为及存活率的影响
在各氨氮处理组中，随氨氮含量的升高，尖吻鲈稚鱼呈现出一定的应激行为，临床表现为狂躁不安、呼吸急促及痉挛，鳃盖煽动频率加快、局部充血及体表黏液分泌增多等；胁迫12 h左右时稚鱼活动缓慢，失去躲避能力，但经24 h适应后5 mg/L处理组个体基本恢复正常，10 mg/L处理组的应激程度减弱。10 mg/L处理组个别个体出现体色变淡现象，并于胁迫48 h后出现死亡个体，死亡鱼体僵硬弯曲、背鳍胸鳍张开，鳃盖及口裂亦剧烈张开，至试验结束时的存活率为99%；其余两处理组的尖吻鲈稚鱼存活率均为100%。
2. 2 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼抗氧化酶活性的影响
2. 2. 1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 由图1可知，不同氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性变化趋势存在明显差异。其中，5 mg/L处理组稚鱼SOD活性在胁迫6～24 h显著低于对照组（P<0.05，下同），于胁迫24 h时达最低值，胁迫24～36 h迅速上升至最高值，胁迫36～48 h酶活性略有下降，此后趋于平稳，从胁迫36 h起尖吻鲈稚鱼SOD活性始终高于对照组；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性呈下降—上升—下降—上升—下降的变化趋势，除胁迫72 h外，其他时间点均低于对照组。
2. 2. 2 过氧化物酶（POD）活性 由图2可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼POD活性变化趋势存在明显差异。在胁迫24 h内，2个氨氮处理组（5和10 mg/L）的尖吻鲈稚鱼POD活性变化趋势基本一致，但从胁迫24 h后二者的变化趋势截然不同；在整个试验过程中，5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼POD活性均显著高于对照组。
2. 2. 3 过氧化氢酶（CAT）活性 由图3可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性在整个试验过程中均显著高于对照组，整体上呈上升—下降—上升的变化趋势；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼CAT活性变化波动明显，胁迫0～12 h呈缓慢上升趋势，从胁迫24 h起呈明显的上升—下降交替式波动变化趋势，且从胁迫36 h起尖吻鲈稚鱼CAT活性显著高于对照组。
2. 2. 4 酸性磷酸酶（ACP）活性 由图4可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性呈先下降后上升的变化趋势，在胁迫36 h时达最低值，且从试验开始后各时间点均显著低于对照组；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼ACP活性整体上呈上升—下降—上升—下降的变化趋势，于胁迫48 h时达最高值，胁迫12 h后其ACP活性显著高于5 mg/L处理组和对照组。
2. 2. 5 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性 由图5可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性在胁迫6 h内迅速下降，胁迫6～36 h的变化相对较平缓，此后呈明显的上升—下降—上升变化趋势，整个试验过程中GSH-Px活性均低于对照组。10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性在胁迫36 h内显著低于对照组，但显著高于5 mg/L处理组，且整体上呈下降趋势；此后的GSH-Px活性变化趋势与5 mg/L处理组一致（上升—下降—上升），但活性高于5 mg/L处理组和对照组。 2. 3 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶活性的影响
2. 3. 1 脂肪酶（LPS）活性 由图6可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性整体上呈先上升再下降的变化趋势，于胁迫24 h时达最高值，至试验结束（胁迫96 h）时降至最低值，从胁迫12 h起尖吻鲈稚鱼LPS活性与对照组存在显著差异；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼LPS活性在胁迫12 h内与对照组无显著差异，此后呈上升—下降—上升—下降的变化趋势，于胁迫72 h时达最高值，且从胁迫24 h起尖吻鲈稚鱼LPS活性显著高于5 mg/L处理组和对照组。
2. 3. 2 淀粉酶（AMS）活性 由图7可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性变化趋势存在明显差异。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性在氨氮胁迫即开始迅速下降，至胁迫24 h时达最低值，然后快速上升，至胁迫36 h时其AMS活性显著高于对照组，协迫36～48 h略有下降，之后持续上升，至试验结束（胁迫96 h）时达最高值；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性在胁迫6 h后迅速下降，于胁迫12 h时达最低值，然后持续上升，至胁迫72 h时达最高值，协迫72～96 h又呈下降趋势。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性在胁迫6和24 h时显著低于10 mg/L处理组和对照组，在胁迫36和96 h时则显著高于10 mg/L处理组和对照组。
2. 3. 3 胰蛋白酶（TRYP）活性 由图8可知，不同浓度氨氮胁迫导致各处理组尖吻鲈稚鱼TRYP活性变化趋势基本一致，2个氨氮处理组（5和10 mg/L）尖吻鲈稚鱼TRYP活性均呈阶段性的上升—下降交替变化趋势。5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼TRYP酶活性的最高值和最低值分别出现在胁迫6和12 h，10 mg/L处理组的最高值和最低值分别出现在胁迫72和48 h。
3 讨论
3. 1 氨氮对尖吻鲈稚鱼存活及活力的影响
高浓度氨氮刺激下，吉富罗非鱼幼鱼会出现胸鳍充血等症状（肖炜等，2015），而团头鲂幼鱼在氨氮胁迫下其鳃丝上皮组织增生，毛细血管扩张，鳃小片变短、卷曲、融合，肝细胞空泡化、充血、血窦扩张（张武肖等，2015）。本研究观察发现，在急性氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼也出现局部充血症状，且中毒初期表现出一定的应激行为，包括狂躁不安、频繁发生碰撞或侧翻，呼吸急促、鳃盖煽动频率加快。随着氨氮胁迫时间的延长和胁迫浓度的增加，尖吻鲈稚鱼个体活力降低，在中毒后期表现出呼吸受阻、活动缓慢，失去躲避能力，局部充血、体表黏液分泌增多及痉挛濒死等。尤其是高浓度（10 mg/L）处理组的尖吻鲈稚鱼还出现体色变淡、发白现象，且在胁迫48 h内出现死亡个体，死亡鱼体僵硬弯曲、背鳍胸鳍张开，鳃盖及口裂亦剧烈张开。氨氮胁迫前期尖吻鲈稚鱼呼吸急促，运动加剧，是由于高浓度氨氮致使其血氨浓度快速增加，而需在一定程度上提高机体换气率（Zhang and Wood，2009）。李波等（2011）研究表明，高浓度氨氮胁迫组黄颡鱼在试验开始即表现出强烈的应激反应，沿杯壁或在水上层快速游窜。杜浩等（2017）也曾研究发现，中华鱘稚鱼在高浓度氨氮中暴露1 h后，其平均心率显著高于对照组。此外，黄厚见（2012）研究发现，刚受氨氮胁迫的梭鱼幼鱼活动增加，高浓度组尤其明显，随着胁迫时间的延长，幼鱼运动明显减少，频临死亡的幼鱼身体剧烈抽搐，部分幼鱼嘴张开，鳃丝充血，鳃盖外翻，随后幼鱼原地打转，逐渐下沉、死亡。张武肖等（2015）研究急性氨氮胁迫对团头鲂幼鱼肝脏、肾脏和鳃组织结构的影响时发现，不同器官的损伤程度不同，以肝脏组织受损最严重，但鳃组织损伤易引发呼吸受阻，最终导致死亡。这些研究充分验证了氨氮的毒性机理。
3. 2 氨氮对尖吻鲈稚鱼抗氧化酶活性的影响
生态因子发生改变将诱发一系列的应激反应，其中活性氧自由基的大量产生会导致机体受损（胡静等，2015，2016）。机体免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫两类，鱼类的非特异性免疫在应对逆环境应激中起主导作用，具体表现为SOD、POD、CAT、ACP和GSH-Px等酶类在免疫调节中发挥重要作用。其中，SOD和CAT是机体发生氧化代谢的酶类，二者协同作用，使自由基的产生和清除达动态平衡，减少机体氧化损伤，是机体内重要的保护酶系统（鲁双庆等，2002；Martínez-?lvarez et al.，2005；臧学磊，2010；苏慧等，2012；韩春艳等，2014）；CAT与GSH-Px联合可将SOD反应产物进一步还原成分子氧和水，最终达到保护机体的目的（张克烽等，2007）；ACP广泛存在于生物体内，在酸性条件下打开磷酸酯键，将带有磷酸酯的异物水解，减少个体感染概率，还可改变或修饰外源异物的表面结构，促使血细胞更准确地识别异物，有助于提升吞噬细胞吞噬及降解异物的速度，具有离子分泌、机体防御、免疫调节等重要生理作用（Foss et al.，2009；Paust et al.，2011；班同等，2013）。本研究结果表明，在氨氮胁迫初期（胁迫6 h内）尖吻鲈稚鱼SOD活性呈下降趋势，胁迫36 h后5 mg/L处理组的SOD活性显著高于对照组；10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼SOD活性除胁迫72 h外，其他时间点均低于对照组。SOD活性呈先升高后下降的变化趋势与氨氮胁迫下脊尾白虾血淋巴及肝胰腺SOD活性的变化趋势（任海等，2014）一致。其原因可能是胁迫初期机体表现出积极作用，较低浓度的氨氮对SOD活性有诱导作用，且这种诱导作用体现在活性氧自由基水平升高，为维持机体组织抗氧化水平平衡而应对外界胁迫的生理调节，引发机体SOD活性代偿性升高；在氨氮胁迫后期，低浓度氨氮组SOD活性始终保持高水平，而高浓度氨氮组并未出现回升趋势且酶活性下降，说明在长时间胁迫下，高浓度氨氮胁迫可能已对尖吻鲈组织产生不可逆的毒害作用，破坏其正常组织的生理功能，机体调节氨氮胁迫的能力越来越弱，致使尖吻鲈体内出现过多的自由基而抑制SOD活性。 POD的主要作用是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物，其与SOD活性变化在一定程度上能反映机体在胁迫环境下免疫水平的变化，故可将二者结合作为水环境中氨氮胁迫的敏感生物指示剂。在本研究中，5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼POD活性随胁迫时间的延长始终高于对照组， 10 mg/L处理组的POD活性在胁迫6～24 h时远高于对照组，但低于5 mg/L处理组，表明氨氮对尖吻鲈稚鱼POD活性产生了抑制效应。本研究结果与樊甄姣等（2005）研究发现高浓度氨氮胁迫引起栉孔扇贝抗氧化系统受抑制的现象、赵海涛（2006）研究发现氨氮胁迫下南方鲇（Silurus meridionalis Chen）POD活性的变化规律一致，可能是高浓度氨氮引起油脂过氧化物反应并产生过多的H2O2，POD需分解大量H2O2而引起机体血清中POD活性下降，即鱼体抗氧化能力减弱，说明长时间氨氮胁迫导致抗氧化系统中活性反应组分损伤。氨氮在机体内部是一种累积效应，当其在体内的累积超过一定程度时即表现出中毒症状，POD活性下降（李飞等，2005）。GSH-Px在保护肝脏和清除体内自由基方面发挥重要作用（Sun et al.，2012）。本研究结果表明，氨氮胁迫36 h内尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性先保持相对稳定，且随胁迫时间的延长和胁迫程度的加深，GSH-Px活性始终低于对照组；10 mg/L处理组胁迫36～96 h时尖吻鲈稚鱼GSH-Px活性呈先升高后快速下降再次升高的变化趋势，其原因是氨氮胁迫下尖吻鲈免疫组织具有一定的适应性，GSH-Px活性反馈性增强旨在对抗外界环境变化产生多余的活性氧，与韩春艳等（2014）的研究结果一致。此外，本研究结果表明，低浓度氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼合成的ACP不足以清除异物，高浓度氨氮胁迫下尖吻鲈稚鱼需合成更多ACP以提升机体的防御能力；氨氮胁迫下，2个氨氮处理组（5和10 mg/L）的尖吻鲈稚鱼CAT活性均高于对照组，可能是氨氮诱导尖吻鲈通过新陈代谢以应对环境胁迫，因此CAT活性的提升可视为生物体对新陈代谢的适应（强俊等，2011；姜会民，2012）。
3. 3 氨氮对尖吻鲈稚鱼消化酶活性的影响
消化酶活性能反映水产动物消化生理的基本特征。环境因子的改变引发机体较正常代谢消耗更多能量，在一定程度上即要求消化酶活性更高，用于消化食物以保证能量供给（徐武杰等，2011）。本研究結果表明， 5 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼的LPS活性在氨氮胁迫36 h后开始显著低于对照组，而10 mg/L处理组LPS活性呈下降—上升—下降的变化趋势，说明在高浓度氨氮胁迫下，机体需要摄入额外的食物或大量利用体内现存的脂肪类物质，以补充所消耗的能量。在AMS活性方面，5和10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼AMS活性整体上呈先下降后上升的变化趋势，与高体革鯻AMS活性在盐度胁迫下的变化趋势（张龙岗等，2011）一致，也说明机体需动用淀粉类物质，以补充逆境胁迫引发机体调节所消耗的能量。TRYP活性直接影响机体消化道对蛋白的吸收效率和代谢水平（徐武杰等，2011；张龙岗等，2011）。在氨氮胁迫下，5和10 mg/L处理组尖吻鲈稚鱼TRYP活性均呈阶段性的上升—下降交替变化趋势，表明机体在氨氮应激中分泌更多TRYP，以分解机体内的蛋白类物质，补充氨氮胁迫引发的能量消耗。
4 结论
氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶具有明显影响，在短时间（<6 h）内尖吻鲈稚鱼对氨氮有一定耐受性，SOD、CAT等部分抗氧化酶在氨氮浓度的剧烈变化下其活性诱导增强以消除体内过多的自由基，消化酶活性呈不同程度的升高则是为了补充机体能量消耗。
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（責任编辑 兰宗宝）