论文部分内容阅读
摘要：【目的】考察不同剂量女黄颗粒对免疫抑制小鼠外周血T淋巴细胞亚群及细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ表达量的影响，旨在明确女黄颗粒对小鼠免疫的调节作用。【方法】选取50只健康昆明小鼠，随机分为阴性对照组、模型组及女黄颗粒高、中、低剂量组，每组10只。除阴性对照组外，其他处理组均通过腹腔注射环磷酰胺（80 mg/kg，1次/d，连续5 d）建立小鼠免疫抑制模型；建模后，阴性对照组和模型组灌胃生理盐水，女黄颗粒处理组则分别按0.5、1.0和1.5 g/kg剂量灌胃女黄粒颗溶液（以水稀释），1次/d，连续7 d。采用流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+和CD8+的百分率及CD4+/CD8+比值，以实时荧光定量PCR检测小鼠脾脏细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的表达情况。【结果】经腹腔注射环磷酰胺后，小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值较阴性对照组小鼠极显著降低（P<0.01，下同），小鼠脾脏IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量极显著下降。灌胃给药（女黄颗粒）后，CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值均有所升高，其中女黄颗粒高、中剂量组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率较模型组小鼠极显著升高；除女黄颗粒高剂量组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表量较模型组小鼠极显著下降外，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量均呈上升趋势，尤其是女黄颗粒中剂量组小鼠脾脏IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量均极显著高于模型组小鼠。【结论】女黄颗粒通过上调CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞百分率及提高IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的相对表达量以增强免疫抑制小鼠的免疫功能，临床推荐使用剂量为1.0 g/kg。
關键词： 女黄颗粒；昆明小鼠；免疫抑制；T淋巴细胞亚群；细胞因子
中图分类号： S853.74 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2070-07
0 引言
【研究意义】免疫抑制是由于免疫器官、免疫组织或免疫细胞遭到损伤而出现暂时性或永久性免疫应答功能不全。当机体出现免疫抑制时，其抗病能力低下，对外界病原的敏感性增强，一些病原微生物可轻易侵入机体，造成发病甚至死亡（应志雄等，2018）。近年来，我国养殖业中由于抗生素的滥用，导致免疫抑制疾病发生率逐年增加（康昭风等，2010；曹慧慧等，2016；刘青涛等，2018），且当前治疗动物免疫抑制疾病仍是采用抗生素对症治疗，效果不佳。因此，加强动物免疫抑制疾病防治已成为兽医兽药研究工作的重点。【前人研究进展】引起机体免疫抑制的因素有病毒、细菌及其他致病微生物等，包括鸡的传染性法氏囊病和马立克病（荣茂伶等，2015），猪的蓝耳病和圆环病毒病（陈张华，2015；罗文娟等，2018），牛的病毒性腹泻（陈斐等，2017）等。目前，针对免疫抑制疾病的治疗主要依靠化学合成的抗生素，但由于不合理使用，导致细菌、病毒等病原微生物不断变种，而出现严重的耐药性问题（史若男等，2014；赵凤菊等，2017）。李欣南等（2018）对某如牛场金黄色葡萄球菌的耐药性进行研究，结果发现该奶牛场金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率保持在100%左右；王学君等（2018）通过分析贵州省猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药性，发现贵州省猪源大肠杆菌对土霉素、四环素的耐药率分别为97.3%和97.6%。相对于化学合成药物，中药具有毒性低、无毒副作用、多靶点、不易产生耐药性等优点（周雄等，2016；于明鹤等，2017；靳二辉等，2018），且已有研究表明单味中药提取物对免疫抑制疾病也有一定的治疗效果。帅学宏等（2015）研究表明，青蒿多糖是通过增强免疫器官的功能而缓解环磷酰胺对小鼠免疫系统的抑制作用；史晶晶等（2016）、邵晶等（2017）的研究结果均表明黄芪对免疫抑制小鼠有免疫调节作用；黄振华等（2018）使用枸杞多糖对免疫抑制剂小鼠进行治疗，结果表明枸杞多糖能改善免疫抑制小鼠的红细胞免疫。【本研究切入点】由于单一药物并不能全面改善动物免疫抑制疾病的继发病（张召兴等，2018），因此有必要依据中兽医辨证原则和中药组方原则对免疫抑制疾病进行辨证并组方，但至今鲜见相关研究报道。【拟解决的关键问题】通过腹腔注射环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，经灌胃给药后观察不同剂量女黄颗粒对免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞亚群及细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ表达量的影响，旨在明确女黄颗粒对小鼠免疫的调节作用。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
健康昆明小鼠购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心[许可证号SCXK-（军）2012-0011]，共50只，雌雄各半，体质量17.0±2.0 g。女黄颗粒中女贞子、黄芪、枸杞子和菟丝子比例为4∶4∶1∶1，均购自重庆荣昌区桐君阁大药房，各中药经提取后湿法制粒，其规格为1.0 g颗粒中含原生药1.0 g，特女贞苷含量为1.46 mg/g。注射用环磷酰胺（批号17020525）购自江苏盛迪医药有限公司。Pharmingen? FITC Hamster Anti-Mouse CD3e、Pharmingen? PerCP Rat Anti-Mouse CD8a、Pharmingen? PE Rat Anti-Mouse CD4、FACS? Lysing Solution 10X Concentrate购自美国BD公司；B511321-UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Ultra SYBR Mixture购自康为世纪生物科技有限公司。主要仪器设备：高通道组织破碎机（Schwingmuhle Tissuelyser II，QIAGEN）、低温高速离心机（5415R，Eppendoorf）、流式细胞仪（Beckman Coulter，CytoFLEX）和荧光定量PCR仪（LightCycler 96，Roche）。 1. 2 小鼠免疫抑制模型建立
参照余树民等（2014）的方法，以注射用环磷酰胺（以生理盐水稀释）建立小鼠免疫抑制模型，即按80 mg/kg剂量进行腹腔注射，1次/d，连续5 d。
1. 3 试验分组及处理
经适应性饲养3 d后，将50只健康昆明小鼠随机分为阴性对照组、模型组及女黄颗粒高、中、低剂量组（用水将女黄颗粒溶解成1.0 g/mL，按需要进行稀释），共计5个处理组，每组10只，自由采食和饮水。除阴性对照组外，其余4个处理组按照1.2的方法进行建模，建模后阴性对照组和模型组灌胃生理盐水，3个女黄颗粒处理组则分别按0.5、1.0和1.5 g/kg剂量灌胃给药，1次/d，连续7 d。
1. 4 女黄颗粒对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
给药7 d后，各处理组小鼠经摘眼球采血，肝素抗凝，取100 μL抗凝血加入CD3、CD4和CD8抗体各5 μL，混匀，4 ℃避光30 min后加入1.0 mL溶血素，10 min后加入1.0 mL PBS，然后300×g离心5 min，弃上清液；再加入2.0 mL PBS，漩涡振荡混匀，300×g离心5 min，弃上清液；最后加入450 μL PBS重悬细胞，以流式细胞仪进行数据采集并采用Kaluza 2.0进行数据分析。
1. 5 女黄颗粒对小鼠脾脏IL-2、IL-4、TNF-α和TNF-γ表达的影响
无菌条件下摘取小鼠脾脏立即放入液氮中， -80 ℃保存备用。按照Trizol试剂盒说明提取脾脏总RNA，再逆转录合成cDNA，并以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。检测结果在凝胶成像系统上拍照，通过图像分析软件读取目的条带密度扫描值，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。实时荧光定量PCR扩增引物详见表1。
1. 6 统计分析
试验数据采用SPSS 20.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 女黄颗粒对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
以流式细胞仪进行小鼠外周血T淋巴细胞亚群数据采集，并采用Kaluza 2.0进行数据分析，结果详见图1和表2。由表2可看出，在给药7 d后，模型组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率较阴性对照组小鼠极显著降低（P<0.01，下同）；与模型组相比，女黄颗粒高、中剂量组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率极显著升高，而女黄颗粒低剂量组的变化不显著（P>0.05，下同）。与阴性对照组比较，模型组小鼠的CD4+/CD8+比值显著降低（P<0.05，下同）；而与模型组相比，女黄颗粒高剂量组小鼠的CD4+/CD8+比值显著升高。
2. 2 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-2 mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-2 mRNA相对表达量的影响见图2。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表达量极显著下降；与模型组相比，女黄颗粒中、低剂量组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表达量略有增加，但差异不显著，女黄颗粒高剂量组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表达量则极显著下降。
2. 3 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-4 mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-4 mRNA相对表达的影响见图3。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏IL-4 mRNA的相对表达量极显著下降；相对于模型组，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏IL-4 mRNA的相对表达量均呈上升趋势，其中女黄颗粒中、低剂量组小鼠脾脏IL-4 mRNA的相对表达量极显著高于模型组小鼠。
2. 4 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏TNF-α mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏TNF-α mRNA相对表达量的影响见图4。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏TNF-α mRNA的相对表达量极显著下降；与模型组相比，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏TNF-α mRNA的相对表达量均呈极显著上升趋势，且以女黄颗粒中剂量组的相对表达量最高。
2. 5 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IFN-γ mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IFN-γ mRNA相对表达量的影響见图5。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏IFN-γ mRNA的相对表达量呈极显著下降趋势；相对于模型组，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏IFN-γ mRNA的相对表达量均呈极显著上升趋势，也是以女黄颗粒中剂量组的相对表达量最高。
3 讨论
环磷酰胺是临床常用的烷化剂类抗肿瘤药，进入机体后分解释放出氯乙基磷酰胺，而氯乙基磷酰胺对肿瘤细胞会产生细胞毒作用（史晶晶等，2016）。低剂量的环磷酰胺可促进机体的免疫功能，高剂量的环磷酰胺则通过损伤机体的免疫器官或组织，对机体各免疫细胞产生强烈的细胞毒性作用，而表现出明显的免疫抑制作用（Miao et al.，2015）。因此，本研究选用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，用于探讨女黄颗粒对免疫抑制小鼠外周血T淋巴细胞亚群及细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ表达的影响。
T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分，具有直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B淋巴细胞产生抗体，以及产生细胞因子等多种生物学功能。只有成熟的T淋巴细胞才能发挥免疫作用，而CD3+是成熟T淋巴细胞表面标志，因此通过检测CD3+ T淋巴细胞数量可间接反映机体的免疫功能水平（陈功义等，2015）。此外，T淋巴细胞还有两个重要的表面标志（CD4+和CD8+）。CD4+ T淋巴细胞的主要功能是辅助T淋巴细胞转变为效应细胞，促进B淋巴细胞转化为浆细胞及活化巨噬细胞；CD8+T淋巴细胞主要是指细胞毒性T淋巴细胞，对细胞免疫应答起重要作用。因此，CD4+和CD8+ T淋巴细胞数及CD4+/CD8+比值平衡是维持机体免疫功能的关键（孙晓雨等，2015；靳二辉等，2017；刘娟等，2017）。本研究结果表明，环磷酰胺可降低小鼠CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值，而造成免疫抑制；但灌胃给药（女黄颗粒）后，CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值均有所升高，说明女黄颗粒对T淋巴细胞亚群比例失调具有正向调节作用，可能与女黄颗粒中的黄芪、枸杞和女贞子含有大量多糖有关（吕小成等，2016）。 CD4+ T淋巴细胞根据其分泌细胞因子的类型不同可分为Th1型和Th2型。其中，Th1型细胞主要分泌INF-γ和IL-2等，INF-γ可增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，同时促进CD8+ T淋巴细胞增殖分化（涂浩等，2015；姜建强等，2017）；IL-2是T淋巴细胞增殖的主要细胞因子，同时可促进B淋巴细胞的增殖、分化，增强单核细胞及NK细胞的杀伤活性，从而全面调节机体免疫功能（李慧峰等，2014）。Th2型细胞主要分泌IL-4和IL-6等，IL-4被认为是巨噬细胞活化因子，可增加对B淋巴细胞刺激作用，诱发B淋巴细胞产生高水平IgE和IgG（刘志超和岳屹囡，2008）；TNF-α是由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞产生，参与免疫应答和炎症反应（宋玉龙等，2017）。本研究结果表明，按80 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺建立的小鼠免疫抑制模型，能下调小鼠脾脏IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量，致使机体免疫系统紊乱、免疫力下降；经胃灌服女黄颗粒后，IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量明显回升，表明女黄颗粒可通过调节部分细胞因子的表达而增强机体的免疫作用，但要完全康复可能需要长时间用药。
4 结论
女黄颗粒通过上调CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞百分率及提高IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的相对表达量以增强免疫抑制小鼠的免疫功能，临床推荐使用剂量为1.0 g/kg。
参考文献：
曹慧慧，孙文超，郑敏，韦显凯，苏姣秀，蒙振亩，黄宝学，刘棋. 2016. 广西鹅圆环病毒全基因组序列测定[J]. 南方农业学报，47（1）：122-127. [Cao H H，Sun W C，Zheng M，Wei X K，Su J X，Meng Z M，Huang B X，Liu Q. 2016. Genome sequencing of goose Circovirus from Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，47（1）：122-127.]
陈斐，周澎，王智慧，刘进华，王永. 2017. 牛免疫抑制性疾病引起混合感染的诊断[J]. 黑龙江畜牧兽医，（22）：98-101. [Chen F，Zhou P，Wang Z H，Liu J H，Wang Y. 2017. Diagnosis of mixed infection caused by bovine immunosuppressive diseases[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（22）：98-101.]
陈功义，银岭，肖传斌. 2015. 板蓝根多糖对缺乳仔鼠免疫器官发育及T淋巴细胞亚群的影响[J]. 中兽医医药杂志，（1）：15-18. [Chen G Y，Yin L，Xiao C B. 2015. Effects of Radix isatidis polysaccharide on immune organic develop-ment and T lymphocyte subpopulation in the lacking milk renewal rats[J]. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine，（1）：15-18.]
陳张华. 2015. 中草药在猪的免疫抑制性疾病中的应用[J]. 南方农业，9（3）：140. [Chen Z H. 2015. Application of Chinese herbal medicine in immunosuppressive diseases of pig[J]. South China Agriculture，9（3）：140.]
黄振华，邓向亮，张凯敏，赖柳婷，胡明华，马方励，罗霞，周联. 2018. 枸杞多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响[J]. 中国免疫学杂志，34（2）：214-217. [Huang Z H，Deng X L，Zhang K M，Lai L T，Hu M H，Ma F L，Luo X，Zhou L. 2018. Effect of Lycium barbarum polysaccharides on immune function of erythrocytes in immunosuppressed mice[J]. Chinese Journal of Immunology，34（2）：214-217.]
姜建强，刘图雅，戴钦，安希文，图雅，包花尔，王瑞，王秀珍，李盈，额尔敦木图. 2017. 阴道蝇蛆病对阿拉善双峰驼外周血清中细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ含量的影响[J]. 中国兽医学报，37（7）：1343-1347. [Jiang J Q，Liu T Y，Dai Q，An X W，Tu Y，Bao H E，Wang R，Wang X Z，Li Y，Eerdunmutu. 2017. Influence of vaginal magoots inoculation on IL-4，IL-10，IFN-γ content in peripheral serum in Alxa bactrian camels[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，37（7）：1343-1347.]
靳二辉，陈耀星，周金星，李升和，任曼，胡倩倩，金光明. 2017. 黄芪、枸杞、金银花等中草药复方制剂对肉鸡免疫器官发育及免疫功能的影响[J]. 畜牧兽医学报，48（6）：1128-1139. [Jin E H，Chen Y X，Zhou J X，Li S H，Ren M，Hu Q Q，Jin G M. 2017. The effect of compound Chinese herbal medicine preparation of astiagalus，wolfberry and honeysuckle flower on immune organ development and immune functions of broiler[J]. Acta Veterinaria et Zootechica Sinica，48（6）：1128-1139.] 靳二辉，周先建，孙启，周金星，李升和，金光明. 2018. 复方中草药制剂对肉鸡肌肉发育和肉品质的影响[J]. 江苏农业学报，34（2）：374-384. [Jin E H，Zhou X J，Sun Q，Zhou J X，Li S H，Jin G M. 2018. The effect of compound Chinese herbal preparation on muscle development and meat quality of broiler[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（2）：374-384.]
康昭风，谢金防，韦启鹏，谢明贵，武艳平，邹志恒，李思明. 2010. 江西省主要养鸡地区4种鸡免疫抑制病的血清学调查[J]. 江西农业学报，22（11）：125-127. [Kang Z F，Xie J F，Wei Q P，Xie M G，Wu Y P，Zou Z H，Li S M. 2010. Serological survey on antibodies against four immune suppression diseases in chicken in Jiangxi Province[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，22（11）：125-127.]
李慧峰，单明辉，程淑琴. 2014. 归参汤对免疫抑制小鼠血清中IL-2、TNF-α和脾细胞Th1/Th2细胞因子的影响[J]. 中国兽医学报，34（6）：973-976. [Li H F，Shan M H，Cheng S Q. 2014. Effect of Guishen decoction on IL-2 and TNF-α in serum and Th1/Th2 in splenic cell of immunosuppressive mice[J].Chinese Journal of Veterinary Science，34（6）：973-976.]
李欣南，韩镌竹，高铎，匡德春，玄兵. 2018. 某奶牛场牛乳中金黄色葡萄球菌的耐药性分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，（9）：28-30. [Li X N，Han J Z，Gao D，Kuang D C，Xuan B. 2018. Analysis of resistance to Staphylococcus aureus in milk of a dairy farm[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（9）：28-30.]
刘娟，吴秋月，邱洪. 2017. 复方苦芩对细小病毒感染犬血液T细胞亚群和细胞因子的影响[J]. 畜牧兽医学报，48（2）：369-376. [Liu J，Wu Q Y，Qiu H. 2017. Effect of compound Kuqin on T cell subsets and cytokines of blood in canines with canine parvovirous[J]. Acta Veterinaria et Zootechica Sinica，48（2）：369-376.]
劉青涛，李银，刘娜，杨婧，韩凯凯，刘宇卓，赵冬敏，黄欣梅，田宇杰. 2018. H9N2亚型禽流感病毒对鸡的免疫抑制机制[J]. 江苏农业学报，34（2）：368-373. [Liu Q T，Li Y，Liu N，Yang J，Han K K，Liu Y Z，Zhao D M，Huang X M，Tian Y J. 2018. The immunosuppressive mechanism of H9N2 subtype avian influenza virus infection in chickens[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（2）：368-373.]
刘志超，岳屹囡. 2008. 细胞因子与临床疾病[M]. 海口：海南出版社. [Liu Z C，Yue Y N. 2008. Cytokines and Clinical Diseases[M]. Haikou：Hainan Publishing House.]
罗文涓，杨剑，敖妙，刘妍璨，覃一峰，文露婷，黎江，韦英益，胡庭俊. 2018. PRRSV诱导猪体内肺泡巨噬细胞炎症模型的建立[J]. 南方农业学报，49（1）：155-163. [Luo W J，Yang J，Ao M，Liu Y C，Qin Y F，Wen L T，Li J，Wei Y Y，Hu T J. 2018. Establishment of inflammatory model of porcine alveolar macrophages induced by PRRSV[J]. Journal of Southern Agriculture，49（1）：155-163.]
吕小成，张乐帅，王富军. 2016. 中药多糖的免疫调节作用及研究进展[J]. 上海中医药大学学报，30（3）：97-101. [Lü X C，Zhang L S，Wang F J. 2016. Recent advances on immune regulation of herbal polysaccharide[J]. Acta Universitatis Traditionis Medicalis Sinensis Pharmacologiaeque Shanghai，30（3）：97-101.]
荣茂伶，徐小桐，计慧姝，文娟，杨晓农. 2015. 鸡常见免疫抑制性疾病研究进展[J].中国畜牧兽医，42（12）：3344-3350. [Rong M L，Xu X T，Ji H S，Wen J，Yang X N. 2015. Research progress on chicken common immunosuppressive diseases[J]. China Animal Husbandary & Ve-terinary Medicine，42（12）：3344-3350.] 邵晶，杜丽东，吴国泰，杨志军，郭玫. 2017. 红芪等4种中药多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠模型的免疫调节作用对比研究[J]. 中国临床药理学杂志，33（21）：2175-2178. [Shao J，Du L D，Wu G T，Yang Z J，Guo M. 2017. Comparative study of the immunomodulatory effects of Hedysarum polybotrys etc. four species traditional Chinese medicine polysaccharides on immunocompromised mice model made by cyclophosphamide[J]. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology，33（21）：2175-2178.]
史晶晶，时博，苗明三. 2016. 黄芪多糖对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J]. 中医学报，31（2）：243-246. [Shi J J，Shi B，Miao M S. 2016. Effects of astragalus polysaccharides on immunological function of the immunosuppressional model mice caused by cyclophosphamide[J]. Acta Chinese Medicine，31（2）：243-246.]
史若男，李婉，宋丽婷，周姗，刘水平，刘进辉. 2014. 动物免疫抑制研究进展[J]. 动物医学进展，35（9）：93-96. [Shi R N，Li W，Song L T，Zhou S，Liu S P，Liu J H. 2014. Progress on animal immunosuppression[J]. Progress in Veterinary Medicine，35（9）：93-96.]
帅学宏，施君，陈吉轩，黄庆洲，伍莉，胡庭俊. 2015. 青蒿多糖对免疫抑制小鼠免疫器官的影响[J]. 动物医学进展，36（11）：59-62. [Shuai X H，Shi J，Chen J X，Huang Q Z，Wu L，Hu T J. 2015. Effects of herba Artemisia annua polysaccharides on immune organs in immunosuppressed mice[J]. Progress in Veterinary Medicine，36（11）：59-62.]
宋玉龙，丘富安，吴秀钦，任喆，秦韬，黄一帆. 2017. 硒化修饰太子参多糖对免疫损伤小鼠的免疫保护作用[J]. 中国兽医学报，37（11）：2163-2167. [Song Y L，Qiu F A，Wu X Q，Ren Z，Qin T，Huang Y F. 2017. Immunoprotection effect of selenium radix pseudostellaria polysaccharide on immune injured mice[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，37（11）：2163-2167.]
孙晓雨，崔子寅，张明亮，孙长江，佟春玉，冯新，顾敬敏，雷连成，韩文瑜. 2015. 枸杞多糖和茯苓多糖对免疫抑制小鼠免疫增强及对肠道黏膜的免疫调节作用[J]. 中国兽医学报，35（3）：450-455. [Sun X Y，Cui Z Y，Zhang M L，Sun C J，Tong C Y，Feng X，Gu J M，Lei L C，Han W Y. 2015. Effect of Lycium barbarum polysaccharides and Pachymaran on immune function and intestinal mucosal system in immunosuppressive mice[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，35（3）：450-455.]
涂浩，赵星灿，杨占娜，李梦辉，徐立新，严若峰，宋小凯，李祥瑞. 2015. 猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用研究[J]. 畜牧兽医学报，46（8）：1390-1399. [Tu H，Zhao X C，Yang Z N，Li M H，Xu L X，Yan R F，Song X K，Li X R. 2015. Immunological enhancement of recombinant porcine IL-2，IL-4 and INF-γ on foot-and-mouth disease synthetic peptide vaccine[J]. Acta Veterinaria et Zootechica Sinica，46（8）：1390-1399.]
王學君，谭艾娟，吕世明，杜安定，陈波利，张盛珣. 2018. 贵州省猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药性及耐药基因检测[J]. 中国畜牧兽医，45（5）：1367-1373. [Wang X J，Tan A J，Lü S M，Du A D，Chen B L，Zhang S X. 2018. Detection of resistance and resistance genes of swine Escherichia coli in Guizhou to tetracycline[J]. China Ani-mal Husbandry & Veterinary Medicine，45（5）：1367-1373.] 应志雄，李悦，张昊，苏伟鹏，黄强，张莉莉，陆兆新，王恬. 2018. 解淀粉芽孢杆菌对免疫抑制肉鸡生长性能和肝脏抗氧化功能的影响[J]. 中国兽医学报，38（8）：1609-1615. [Ying Z X，Li Y，Zhang H，Su W P，Huang Q，Zhang L L，Lu Z X，Wang T. 2018. Effects of Bacillus amyloliquefaciens on growth performance and liver antioxidant function of immunosuppressed broilers[J]. Chinese Journal of Veterinary Science ，38（8）：1609-1615.]
于明鹤，史秋梅，柴铁瑛，柴楠楠，王会敏，高光平，高桂生，张艳英，高景龙. 2017. 黄芪和板蓝根超微粉的粒径观察及其抗鸡新城疫病毒效果[J]. 河南农业科学，46（5）：140-143. [Yu M H，Shi Q M，Chai T Y，Chai N N，Wang H M，Gao G P，Gao G S，Zhang Y Y，Gao J L. 2017. Size observation and anti-NDV activity of ultrafine particle of Radix astragali and Radix isatidis[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，46（5）：140-143.]
余樹民，甘梦，左之才，崔恒敏，彭西，王娅，邓俊良. 2014. 中药复方对免疫抑制模型小鼠细胞因子、免疫球蛋白及红细胞免疫黏附功能的影响[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），42（4）：27-32. [Yu S M，Gan M，Zuo Z C，Cui H M，Peng X，Wang Y，Deng J L. 2014. Effects of Chinese herbal compound on cytokines，immunoglobulins and erythrocyte immune adhesion function of immunosuppressive mice[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），42（4）：27-32.]
张召兴，李蕴玉，贾青辉，张香斋，李佩国. 2018. 中草药在防治鸡大肠杆菌病中的应用研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，（8）：168-170. [Zhang Z X，Li Y Y，Jia Q H，Zhang X Z，Li P G. 2018. Application of Chinese herbal medicine in controlling Escherichia coli disease of chicken[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（8）：168-170.]
赵凤菊，关淼，李清竹，顾贵波. 2017. 辽宁地区猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检测与分析[J]. 河南农业科学，46（12）：126-129. [Zhao F J，Guan M，Li Q Z，Gu G B. 2017. Detection and analysis of quinolone resistance genes in swine Escherichia coli from Liaoning Area[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，46（12）：126-129.]
周雄，周汉林，王定发，施力光，曹婷. 2016. 中草药添加剂在养殖生产中的应用现状及展望[J]. 贵州农业科学，44（7）：77-80. [Zhou X，Zhou H L，Wang D F，Shi L G，Cao T. 2016. Current situation and prospects of the application of Chinese herbal medicine feed additives[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（7）：77-80.]
Miao M S，Cheng B L，Guo L，Shi J J. 2015. Effects of Fuzheng Paidu tablet on peripheral blood T lymphocytes，intestinal mucosa T lymphocytes，and immune organs in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics，11（11）：2659-2663.
（责任编辑 兰宗宝）
關键词： 女黄颗粒；昆明小鼠；免疫抑制；T淋巴细胞亚群；细胞因子
中图分类号： S853.74 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2070-07
0 引言
【研究意义】免疫抑制是由于免疫器官、免疫组织或免疫细胞遭到损伤而出现暂时性或永久性免疫应答功能不全。当机体出现免疫抑制时，其抗病能力低下，对外界病原的敏感性增强，一些病原微生物可轻易侵入机体，造成发病甚至死亡（应志雄等，2018）。近年来，我国养殖业中由于抗生素的滥用，导致免疫抑制疾病发生率逐年增加（康昭风等，2010；曹慧慧等，2016；刘青涛等，2018），且当前治疗动物免疫抑制疾病仍是采用抗生素对症治疗，效果不佳。因此，加强动物免疫抑制疾病防治已成为兽医兽药研究工作的重点。【前人研究进展】引起机体免疫抑制的因素有病毒、细菌及其他致病微生物等，包括鸡的传染性法氏囊病和马立克病（荣茂伶等，2015），猪的蓝耳病和圆环病毒病（陈张华，2015；罗文娟等，2018），牛的病毒性腹泻（陈斐等，2017）等。目前，针对免疫抑制疾病的治疗主要依靠化学合成的抗生素，但由于不合理使用，导致细菌、病毒等病原微生物不断变种，而出现严重的耐药性问题（史若男等，2014；赵凤菊等，2017）。李欣南等（2018）对某如牛场金黄色葡萄球菌的耐药性进行研究，结果发现该奶牛场金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率保持在100%左右；王学君等（2018）通过分析贵州省猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药性，发现贵州省猪源大肠杆菌对土霉素、四环素的耐药率分别为97.3%和97.6%。相对于化学合成药物，中药具有毒性低、无毒副作用、多靶点、不易产生耐药性等优点（周雄等，2016；于明鹤等，2017；靳二辉等，2018），且已有研究表明单味中药提取物对免疫抑制疾病也有一定的治疗效果。帅学宏等（2015）研究表明，青蒿多糖是通过增强免疫器官的功能而缓解环磷酰胺对小鼠免疫系统的抑制作用；史晶晶等（2016）、邵晶等（2017）的研究结果均表明黄芪对免疫抑制小鼠有免疫调节作用；黄振华等（2018）使用枸杞多糖对免疫抑制剂小鼠进行治疗，结果表明枸杞多糖能改善免疫抑制小鼠的红细胞免疫。【本研究切入点】由于单一药物并不能全面改善动物免疫抑制疾病的继发病（张召兴等，2018），因此有必要依据中兽医辨证原则和中药组方原则对免疫抑制疾病进行辨证并组方，但至今鲜见相关研究报道。【拟解决的关键问题】通过腹腔注射环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，经灌胃给药后观察不同剂量女黄颗粒对免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞亚群及细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ表达量的影响，旨在明确女黄颗粒对小鼠免疫的调节作用。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
健康昆明小鼠购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心[许可证号SCXK-（军）2012-0011]，共50只，雌雄各半，体质量17.0±2.0 g。女黄颗粒中女贞子、黄芪、枸杞子和菟丝子比例为4∶4∶1∶1，均购自重庆荣昌区桐君阁大药房，各中药经提取后湿法制粒，其规格为1.0 g颗粒中含原生药1.0 g，特女贞苷含量为1.46 mg/g。注射用环磷酰胺（批号17020525）购自江苏盛迪医药有限公司。Pharmingen? FITC Hamster Anti-Mouse CD3e、Pharmingen? PerCP Rat Anti-Mouse CD8a、Pharmingen? PE Rat Anti-Mouse CD4、FACS? Lysing Solution 10X Concentrate购自美国BD公司；B511321-UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Ultra SYBR Mixture购自康为世纪生物科技有限公司。主要仪器设备：高通道组织破碎机（Schwingmuhle Tissuelyser II，QIAGEN）、低温高速离心机（5415R，Eppendoorf）、流式细胞仪（Beckman Coulter，CytoFLEX）和荧光定量PCR仪（LightCycler 96，Roche）。 1. 2 小鼠免疫抑制模型建立
参照余树民等（2014）的方法，以注射用环磷酰胺（以生理盐水稀释）建立小鼠免疫抑制模型，即按80 mg/kg剂量进行腹腔注射，1次/d，连续5 d。
1. 3 试验分组及处理
经适应性饲养3 d后，将50只健康昆明小鼠随机分为阴性对照组、模型组及女黄颗粒高、中、低剂量组（用水将女黄颗粒溶解成1.0 g/mL，按需要进行稀释），共计5个处理组，每组10只，自由采食和饮水。除阴性对照组外，其余4个处理组按照1.2的方法进行建模，建模后阴性对照组和模型组灌胃生理盐水，3个女黄颗粒处理组则分别按0.5、1.0和1.5 g/kg剂量灌胃给药，1次/d，连续7 d。
1. 4 女黄颗粒对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
给药7 d后，各处理组小鼠经摘眼球采血，肝素抗凝，取100 μL抗凝血加入CD3、CD4和CD8抗体各5 μL，混匀，4 ℃避光30 min后加入1.0 mL溶血素，10 min后加入1.0 mL PBS，然后300×g离心5 min，弃上清液；再加入2.0 mL PBS，漩涡振荡混匀，300×g离心5 min，弃上清液；最后加入450 μL PBS重悬细胞，以流式细胞仪进行数据采集并采用Kaluza 2.0进行数据分析。
1. 5 女黄颗粒对小鼠脾脏IL-2、IL-4、TNF-α和TNF-γ表达的影响
无菌条件下摘取小鼠脾脏立即放入液氮中， -80 ℃保存备用。按照Trizol试剂盒说明提取脾脏总RNA，再逆转录合成cDNA，并以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。检测结果在凝胶成像系统上拍照，通过图像分析软件读取目的条带密度扫描值，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。实时荧光定量PCR扩增引物详见表1。
1. 6 统计分析
试验数据采用SPSS 20.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 女黄颗粒对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
以流式细胞仪进行小鼠外周血T淋巴细胞亚群数据采集，并采用Kaluza 2.0进行数据分析，结果详见图1和表2。由表2可看出，在给药7 d后，模型组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率较阴性对照组小鼠极显著降低（P<0.01，下同）；与模型组相比，女黄颗粒高、中剂量组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率极显著升高，而女黄颗粒低剂量组的变化不显著（P>0.05，下同）。与阴性对照组比较，模型组小鼠的CD4+/CD8+比值显著降低（P<0.05，下同）；而与模型组相比，女黄颗粒高剂量组小鼠的CD4+/CD8+比值显著升高。
2. 2 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-2 mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-2 mRNA相对表达量的影响见图2。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表达量极显著下降；与模型组相比，女黄颗粒中、低剂量组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表达量略有增加，但差异不显著，女黄颗粒高剂量组小鼠脾脏IL-2 mRNA的相对表达量则极显著下降。
2. 3 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-4 mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IL-4 mRNA相对表达的影响见图3。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏IL-4 mRNA的相对表达量极显著下降；相对于模型组，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏IL-4 mRNA的相对表达量均呈上升趋势，其中女黄颗粒中、低剂量组小鼠脾脏IL-4 mRNA的相对表达量极显著高于模型组小鼠。
2. 4 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏TNF-α mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏TNF-α mRNA相对表达量的影响见图4。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏TNF-α mRNA的相对表达量极显著下降；与模型组相比，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏TNF-α mRNA的相对表达量均呈极显著上升趋势，且以女黄颗粒中剂量组的相对表达量最高。
2. 5 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IFN-γ mRNA相对表达量的影响
女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾脏IFN-γ mRNA相对表达量的影響见图5。与阴性对照组相比，模型组小鼠脾脏IFN-γ mRNA的相对表达量呈极显著下降趋势；相对于模型组，各女黄颗粒处理组小鼠脾脏IFN-γ mRNA的相对表达量均呈极显著上升趋势，也是以女黄颗粒中剂量组的相对表达量最高。
3 讨论
环磷酰胺是临床常用的烷化剂类抗肿瘤药，进入机体后分解释放出氯乙基磷酰胺，而氯乙基磷酰胺对肿瘤细胞会产生细胞毒作用（史晶晶等，2016）。低剂量的环磷酰胺可促进机体的免疫功能，高剂量的环磷酰胺则通过损伤机体的免疫器官或组织，对机体各免疫细胞产生强烈的细胞毒性作用，而表现出明显的免疫抑制作用（Miao et al.，2015）。因此，本研究选用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，用于探讨女黄颗粒对免疫抑制小鼠外周血T淋巴细胞亚群及细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ表达的影响。
T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分，具有直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B淋巴细胞产生抗体，以及产生细胞因子等多种生物学功能。只有成熟的T淋巴细胞才能发挥免疫作用，而CD3+是成熟T淋巴细胞表面标志，因此通过检测CD3+ T淋巴细胞数量可间接反映机体的免疫功能水平（陈功义等，2015）。此外，T淋巴细胞还有两个重要的表面标志（CD4+和CD8+）。CD4+ T淋巴细胞的主要功能是辅助T淋巴细胞转变为效应细胞，促进B淋巴细胞转化为浆细胞及活化巨噬细胞；CD8+T淋巴细胞主要是指细胞毒性T淋巴细胞，对细胞免疫应答起重要作用。因此，CD4+和CD8+ T淋巴细胞数及CD4+/CD8+比值平衡是维持机体免疫功能的关键（孙晓雨等，2015；靳二辉等，2017；刘娟等，2017）。本研究结果表明，环磷酰胺可降低小鼠CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值，而造成免疫抑制；但灌胃给药（女黄颗粒）后，CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值均有所升高，说明女黄颗粒对T淋巴细胞亚群比例失调具有正向调节作用，可能与女黄颗粒中的黄芪、枸杞和女贞子含有大量多糖有关（吕小成等，2016）。 CD4+ T淋巴细胞根据其分泌细胞因子的类型不同可分为Th1型和Th2型。其中，Th1型细胞主要分泌INF-γ和IL-2等，INF-γ可增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，同时促进CD8+ T淋巴细胞增殖分化（涂浩等，2015；姜建强等，2017）；IL-2是T淋巴细胞增殖的主要细胞因子，同时可促进B淋巴细胞的增殖、分化，增强单核细胞及NK细胞的杀伤活性，从而全面调节机体免疫功能（李慧峰等，2014）。Th2型细胞主要分泌IL-4和IL-6等，IL-4被认为是巨噬细胞活化因子，可增加对B淋巴细胞刺激作用，诱发B淋巴细胞产生高水平IgE和IgG（刘志超和岳屹囡，2008）；TNF-α是由活化的巨噬细胞和T淋巴细胞产生，参与免疫应答和炎症反应（宋玉龙等，2017）。本研究结果表明，按80 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺建立的小鼠免疫抑制模型，能下调小鼠脾脏IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量，致使机体免疫系统紊乱、免疫力下降；经胃灌服女黄颗粒后，IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达量明显回升，表明女黄颗粒可通过调节部分细胞因子的表达而增强机体的免疫作用，但要完全康复可能需要长时间用药。
4 结论
女黄颗粒通过上调CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞百分率及提高IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的相对表达量以增强免疫抑制小鼠的免疫功能，临床推荐使用剂量为1.0 g/kg。
参考文献：
曹慧慧，孙文超，郑敏，韦显凯，苏姣秀，蒙振亩，黄宝学，刘棋. 2016. 广西鹅圆环病毒全基因组序列测定[J]. 南方农业学报，47（1）：122-127. [Cao H H，Sun W C，Zheng M，Wei X K，Su J X，Meng Z M，Huang B X，Liu Q. 2016. Genome sequencing of goose Circovirus from Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，47（1）：122-127.]
陈斐，周澎，王智慧，刘进华，王永. 2017. 牛免疫抑制性疾病引起混合感染的诊断[J]. 黑龙江畜牧兽医，（22）：98-101. [Chen F，Zhou P，Wang Z H，Liu J H，Wang Y. 2017. Diagnosis of mixed infection caused by bovine immunosuppressive diseases[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（22）：98-101.]
陈功义，银岭，肖传斌. 2015. 板蓝根多糖对缺乳仔鼠免疫器官发育及T淋巴细胞亚群的影响[J]. 中兽医医药杂志，（1）：15-18. [Chen G Y，Yin L，Xiao C B. 2015. Effects of Radix isatidis polysaccharide on immune organic develop-ment and T lymphocyte subpopulation in the lacking milk renewal rats[J]. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine，（1）：15-18.]
陳张华. 2015. 中草药在猪的免疫抑制性疾病中的应用[J]. 南方农业，9（3）：140. [Chen Z H. 2015. Application of Chinese herbal medicine in immunosuppressive diseases of pig[J]. South China Agriculture，9（3）：140.]
黄振华，邓向亮，张凯敏，赖柳婷，胡明华，马方励，罗霞，周联. 2018. 枸杞多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响[J]. 中国免疫学杂志，34（2）：214-217. [Huang Z H，Deng X L，Zhang K M，Lai L T，Hu M H，Ma F L，Luo X，Zhou L. 2018. Effect of Lycium barbarum polysaccharides on immune function of erythrocytes in immunosuppressed mice[J]. Chinese Journal of Immunology，34（2）：214-217.]
姜建强，刘图雅，戴钦，安希文，图雅，包花尔，王瑞，王秀珍，李盈，额尔敦木图. 2017. 阴道蝇蛆病对阿拉善双峰驼外周血清中细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ含量的影响[J]. 中国兽医学报，37（7）：1343-1347. [Jiang J Q，Liu T Y，Dai Q，An X W，Tu Y，Bao H E，Wang R，Wang X Z，Li Y，Eerdunmutu. 2017. Influence of vaginal magoots inoculation on IL-4，IL-10，IFN-γ content in peripheral serum in Alxa bactrian camels[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，37（7）：1343-1347.]
靳二辉，陈耀星，周金星，李升和，任曼，胡倩倩，金光明. 2017. 黄芪、枸杞、金银花等中草药复方制剂对肉鸡免疫器官发育及免疫功能的影响[J]. 畜牧兽医学报，48（6）：1128-1139. [Jin E H，Chen Y X，Zhou J X，Li S H，Ren M，Hu Q Q，Jin G M. 2017. The effect of compound Chinese herbal medicine preparation of astiagalus，wolfberry and honeysuckle flower on immune organ development and immune functions of broiler[J]. Acta Veterinaria et Zootechica Sinica，48（6）：1128-1139.] 靳二辉，周先建，孙启，周金星，李升和，金光明. 2018. 复方中草药制剂对肉鸡肌肉发育和肉品质的影响[J]. 江苏农业学报，34（2）：374-384. [Jin E H，Zhou X J，Sun Q，Zhou J X，Li S H，Jin G M. 2018. The effect of compound Chinese herbal preparation on muscle development and meat quality of broiler[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（2）：374-384.]
康昭风，谢金防，韦启鹏，谢明贵，武艳平，邹志恒，李思明. 2010. 江西省主要养鸡地区4种鸡免疫抑制病的血清学调查[J]. 江西农业学报，22（11）：125-127. [Kang Z F，Xie J F，Wei Q P，Xie M G，Wu Y P，Zou Z H，Li S M. 2010. Serological survey on antibodies against four immune suppression diseases in chicken in Jiangxi Province[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，22（11）：125-127.]
李慧峰，单明辉，程淑琴. 2014. 归参汤对免疫抑制小鼠血清中IL-2、TNF-α和脾细胞Th1/Th2细胞因子的影响[J]. 中国兽医学报，34（6）：973-976. [Li H F，Shan M H，Cheng S Q. 2014. Effect of Guishen decoction on IL-2 and TNF-α in serum and Th1/Th2 in splenic cell of immunosuppressive mice[J].Chinese Journal of Veterinary Science，34（6）：973-976.]
李欣南，韩镌竹，高铎，匡德春，玄兵. 2018. 某奶牛场牛乳中金黄色葡萄球菌的耐药性分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，（9）：28-30. [Li X N，Han J Z，Gao D，Kuang D C，Xuan B. 2018. Analysis of resistance to Staphylococcus aureus in milk of a dairy farm[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（9）：28-30.]
刘娟，吴秋月，邱洪. 2017. 复方苦芩对细小病毒感染犬血液T细胞亚群和细胞因子的影响[J]. 畜牧兽医学报，48（2）：369-376. [Liu J，Wu Q Y，Qiu H. 2017. Effect of compound Kuqin on T cell subsets and cytokines of blood in canines with canine parvovirous[J]. Acta Veterinaria et Zootechica Sinica，48（2）：369-376.]
劉青涛，李银，刘娜，杨婧，韩凯凯，刘宇卓，赵冬敏，黄欣梅，田宇杰. 2018. H9N2亚型禽流感病毒对鸡的免疫抑制机制[J]. 江苏农业学报，34（2）：368-373. [Liu Q T，Li Y，Liu N，Yang J，Han K K，Liu Y Z，Zhao D M，Huang X M，Tian Y J. 2018. The immunosuppressive mechanism of H9N2 subtype avian influenza virus infection in chickens[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（2）：368-373.]
刘志超，岳屹囡. 2008. 细胞因子与临床疾病[M]. 海口：海南出版社. [Liu Z C，Yue Y N. 2008. Cytokines and Clinical Diseases[M]. Haikou：Hainan Publishing House.]
罗文涓，杨剑，敖妙，刘妍璨，覃一峰，文露婷，黎江，韦英益，胡庭俊. 2018. PRRSV诱导猪体内肺泡巨噬细胞炎症模型的建立[J]. 南方农业学报，49（1）：155-163. [Luo W J，Yang J，Ao M，Liu Y C，Qin Y F，Wen L T，Li J，Wei Y Y，Hu T J. 2018. Establishment of inflammatory model of porcine alveolar macrophages induced by PRRSV[J]. Journal of Southern Agriculture，49（1）：155-163.]
吕小成，张乐帅，王富军. 2016. 中药多糖的免疫调节作用及研究进展[J]. 上海中医药大学学报，30（3）：97-101. [Lü X C，Zhang L S，Wang F J. 2016. Recent advances on immune regulation of herbal polysaccharide[J]. Acta Universitatis Traditionis Medicalis Sinensis Pharmacologiaeque Shanghai，30（3）：97-101.]
荣茂伶，徐小桐，计慧姝，文娟，杨晓农. 2015. 鸡常见免疫抑制性疾病研究进展[J].中国畜牧兽医，42（12）：3344-3350. [Rong M L，Xu X T，Ji H S，Wen J，Yang X N. 2015. Research progress on chicken common immunosuppressive diseases[J]. China Animal Husbandary & Ve-terinary Medicine，42（12）：3344-3350.] 邵晶，杜丽东，吴国泰，杨志军，郭玫. 2017. 红芪等4种中药多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠模型的免疫调节作用对比研究[J]. 中国临床药理学杂志，33（21）：2175-2178. [Shao J，Du L D，Wu G T，Yang Z J，Guo M. 2017. Comparative study of the immunomodulatory effects of Hedysarum polybotrys etc. four species traditional Chinese medicine polysaccharides on immunocompromised mice model made by cyclophosphamide[J]. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology，33（21）：2175-2178.]
史晶晶，时博，苗明三. 2016. 黄芪多糖对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J]. 中医学报，31（2）：243-246. [Shi J J，Shi B，Miao M S. 2016. Effects of astragalus polysaccharides on immunological function of the immunosuppressional model mice caused by cyclophosphamide[J]. Acta Chinese Medicine，31（2）：243-246.]
史若男，李婉，宋丽婷，周姗，刘水平，刘进辉. 2014. 动物免疫抑制研究进展[J]. 动物医学进展，35（9）：93-96. [Shi R N，Li W，Song L T，Zhou S，Liu S P，Liu J H. 2014. Progress on animal immunosuppression[J]. Progress in Veterinary Medicine，35（9）：93-96.]
帅学宏，施君，陈吉轩，黄庆洲，伍莉，胡庭俊. 2015. 青蒿多糖对免疫抑制小鼠免疫器官的影响[J]. 动物医学进展，36（11）：59-62. [Shuai X H，Shi J，Chen J X，Huang Q Z，Wu L，Hu T J. 2015. Effects of herba Artemisia annua polysaccharides on immune organs in immunosuppressed mice[J]. Progress in Veterinary Medicine，36（11）：59-62.]
宋玉龙，丘富安，吴秀钦，任喆，秦韬，黄一帆. 2017. 硒化修饰太子参多糖对免疫损伤小鼠的免疫保护作用[J]. 中国兽医学报，37（11）：2163-2167. [Song Y L，Qiu F A，Wu X Q，Ren Z，Qin T，Huang Y F. 2017. Immunoprotection effect of selenium radix pseudostellaria polysaccharide on immune injured mice[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，37（11）：2163-2167.]
孙晓雨，崔子寅，张明亮，孙长江，佟春玉，冯新，顾敬敏，雷连成，韩文瑜. 2015. 枸杞多糖和茯苓多糖对免疫抑制小鼠免疫增强及对肠道黏膜的免疫调节作用[J]. 中国兽医学报，35（3）：450-455. [Sun X Y，Cui Z Y，Zhang M L，Sun C J，Tong C Y，Feng X，Gu J M，Lei L C，Han W Y. 2015. Effect of Lycium barbarum polysaccharides and Pachymaran on immune function and intestinal mucosal system in immunosuppressive mice[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，35（3）：450-455.]
涂浩，赵星灿，杨占娜，李梦辉，徐立新，严若峰，宋小凯，李祥瑞. 2015. 猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用研究[J]. 畜牧兽医学报，46（8）：1390-1399. [Tu H，Zhao X C，Yang Z N，Li M H，Xu L X，Yan R F，Song X K，Li X R. 2015. Immunological enhancement of recombinant porcine IL-2，IL-4 and INF-γ on foot-and-mouth disease synthetic peptide vaccine[J]. Acta Veterinaria et Zootechica Sinica，46（8）：1390-1399.]
王學君，谭艾娟，吕世明，杜安定，陈波利，张盛珣. 2018. 贵州省猪源大肠杆菌对四环素类药物的耐药性及耐药基因检测[J]. 中国畜牧兽医，45（5）：1367-1373. [Wang X J，Tan A J，Lü S M，Du A D，Chen B L，Zhang S X. 2018. Detection of resistance and resistance genes of swine Escherichia coli in Guizhou to tetracycline[J]. China Ani-mal Husbandry & Veterinary Medicine，45（5）：1367-1373.] 应志雄，李悦，张昊，苏伟鹏，黄强，张莉莉，陆兆新，王恬. 2018. 解淀粉芽孢杆菌对免疫抑制肉鸡生长性能和肝脏抗氧化功能的影响[J]. 中国兽医学报，38（8）：1609-1615. [Ying Z X，Li Y，Zhang H，Su W P，Huang Q，Zhang L L，Lu Z X，Wang T. 2018. Effects of Bacillus amyloliquefaciens on growth performance and liver antioxidant function of immunosuppressed broilers[J]. Chinese Journal of Veterinary Science ，38（8）：1609-1615.]
于明鹤，史秋梅，柴铁瑛，柴楠楠，王会敏，高光平，高桂生，张艳英，高景龙. 2017. 黄芪和板蓝根超微粉的粒径观察及其抗鸡新城疫病毒效果[J]. 河南农业科学，46（5）：140-143. [Yu M H，Shi Q M，Chai T Y，Chai N N，Wang H M，Gao G P，Gao G S，Zhang Y Y，Gao J L. 2017. Size observation and anti-NDV activity of ultrafine particle of Radix astragali and Radix isatidis[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，46（5）：140-143.]
余樹民，甘梦，左之才，崔恒敏，彭西，王娅，邓俊良. 2014. 中药复方对免疫抑制模型小鼠细胞因子、免疫球蛋白及红细胞免疫黏附功能的影响[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），42（4）：27-32. [Yu S M，Gan M，Zuo Z C，Cui H M，Peng X，Wang Y，Deng J L. 2014. Effects of Chinese herbal compound on cytokines，immunoglobulins and erythrocyte immune adhesion function of immunosuppressive mice[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），42（4）：27-32.]
张召兴，李蕴玉，贾青辉，张香斋，李佩国. 2018. 中草药在防治鸡大肠杆菌病中的应用研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，（8）：168-170. [Zhang Z X，Li Y Y，Jia Q H，Zhang X Z，Li P G. 2018. Application of Chinese herbal medicine in controlling Escherichia coli disease of chicken[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（8）：168-170.]
赵凤菊，关淼，李清竹，顾贵波. 2017. 辽宁地区猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检测与分析[J]. 河南农业科学，46（12）：126-129. [Zhao F J，Guan M，Li Q Z，Gu G B. 2017. Detection and analysis of quinolone resistance genes in swine Escherichia coli from Liaoning Area[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，46（12）：126-129.]
周雄，周汉林，王定发，施力光，曹婷. 2016. 中草药添加剂在养殖生产中的应用现状及展望[J]. 贵州农业科学，44（7）：77-80. [Zhou X，Zhou H L，Wang D F，Shi L G，Cao T. 2016. Current situation and prospects of the application of Chinese herbal medicine feed additives[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（7）：77-80.]
Miao M S，Cheng B L，Guo L，Shi J J. 2015. Effects of Fuzheng Paidu tablet on peripheral blood T lymphocytes，intestinal mucosa T lymphocytes，and immune organs in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics，11（11）：2659-2663.
（责任编辑 兰宗宝）