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【摘要】 无菌检查法系用于检查《中国药典》要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。提高药品质量可控、有效、安全的技术保障。
【关键词】 《中国药典》2010年版；无菌检验方法
1 无菌检查的要求
无菌检查应在环境洁净度10000级下，局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。为了保证无菌检查所用洁净区环境的稳定性，保证检验结果的可靠性，对洁净区的环境质量采用合理的控制措施和评价方法。应定期按《医药工业洁净（室）区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。每次实验前要用适宜的消毒液清洁工作台面，地板，传递窗等，开启空气过滤器、紫外灯照射1小时。每次实验结束后应先用湿抹布或拖布清理污迹，再用消毒液清洁台面及地面和传递窗等，清洁消毒程序是从内向外，从高洁净区到低洁净区，开启紫外灯照射30分钟。
2 菌种及菌液制备
2.1 菌种名称 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代，其转种的培养物为第一代），以保证试验菌株的生物特性。
2.2 菌种及菌液制备 ①液体培养物直接稀释法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于9-10ml的液体培养基中，按要求的温度和时间培养后作为原液。取原液1ml用适宜的稀释剂做10倍系列稀释至每1ml含菌数50-100cfu（菌落形成单位）。采用平皿计数法测定活菌数。②细菌标准浓度比浊法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于琼脂培养基或液体培养基中，按要求的温度和时间培养后备用。取琼脂培养基上的培养物于适宜的稀释剂中制成均匀的菌悬液；液体培养物一般要比标准比浊管的浓度稀，同时培养基的颜色也影响比浊的结果，所以可采取离心集菌，去掉上清液，底部培养物再用适宜的稀释剂制成均匀的菌悬液，将上述菌悬液稀释至与标准比浊管（由国家药品检定机构分发）相同之浓度，此时的菌悬液作为原液。比较浊度时，应注意光线的强度，并从各个角度比较，以保证测定的菌数在要求的范围内，然后根据标准比浊管的说明书，同①操作。
3 注意事项
当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。
4 培养基
4.1 一般采用脱水培养基，按说明书配制 硫乙醇酸盐液体培养基它的装量和容量的高度比要对应。在完成培养的时候，培养计划层要保持在其深度的一半。在接种供应品之前要确保其高度控制在培养基深度的两成，不然在一百摄氏度的属于加热之后其粉红色就会失去。培养基的灭菌应采用验证合格的灭菌程序进行。
4.2 培养基的储存条件 未开封的脱水培养基应避光储存于25℃以下阴凉干燥处，已开封的脱水培养基，应盖紧避光储存于25℃以下阴凉干燥处，制备好的培养基应保存在2-25℃避光环境中，保存在非密闭容器中的培养基，应在3周内使用完。
4.3 培养基的装量 采用直接接种法检查的液体样品，应根据供试品的接种量确定培养基的装量，使供试品的接种体积不大于培养基体积的10%。
4.4 培养基的适用性检查 ①培养基的无菌性检查：每批配制的培养基随机抽取不少于5瓶，按规定温度培养14天，应无菌生长。②培养基的灵敏度检查：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，每支接种量为1ml，（含菌小于100cfu），另一支不接菌作为空白对照，培养3天；再取装量为9ml的改良马丁培养基5支，每支接种量为1ml，另一支作为空白对照，培养5天，空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均应生长良好。判该培养基的灵敏度符合规定。
5 无菌检查方法验证实验
5.1 为什么进行验证 无菌检查方法的验证是为了保证无菌检查结果的准确可靠，以确认供试品在该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
5.2 薄膜过滤法验证 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤，滤净后每个培养器内注入100ml培养基，取装有同体积培养基的容器不加供试品，只加入等量的试验菌，作为阳性对照，验证用的菌种同培养基的灵敏度，只是用大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。
5.3 操作的注意事项 ①过滤前要根据供试品的抗菌活性强弱，选用适宜的溶剂溶解及适量的溶剂稀释。②冲洗样品时流速不宜过快。③每张滤膜每次的冲洗量为50-100ml。④保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。判断：如果采用薄膜过法，可采用增加冲洗液的用量，改变冲洗液的种类，更换滤膜材质，或使用中和剂，灭活剂或表面活性剂等方法消除供试品的抑菌作用。
5.4 直接接种法验证 取适宜装量的硫乙醇酸盐培养基8管，分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌液各2管；取适宜装量的改良马丁培养基4管，分别加入白色念珠菌、黑曲霉各2支，每管加菌量小于100cfu，其中一管接入规定量的供试品，另一管为阳性对照，各试验管按规定的温度培养3-5天。判断：和阳性对照管相比，生长于含供试品管中的試验菌生长状况好，同时和阳性对照管之间的培养结果一致，折旧说明供应品在这个检验量，这个检验环境下无抑菌活性或抑菌活性已经被消除。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用，如果采用直接接种法，可根据情况增加培养基的用量，或在稀释液或培养基中加入中和剂，灭活剂或表面活性剂。
6 供试品的无菌检查
6.1 检验数量 是指一次检验所用供试品最小包装容器的数量
6.2 检验量 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。使用薄膜过滤法的时候，要控制检验量大于等于直接接种法的总量，如果供试品的属性可以，就要把容器中的所有物质进行整体过滤。
6.3 无菌检查法 包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品的性状允许，应采用薄膜过滤法
6.4 供试品的无菌检查 ①阳性对照：供试品的无菌检查应进行阳性对照试验。阳性对照菌的选择原则：根据验证试验结果和供试品的特性选择相应对照菌。无抑菌作用及抗细菌的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌，抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌；加菌量小于100cfu.②阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂、稀释剂及同批次滤器同法操作，作为阴性对照。③供试品的制备：操作时应对供试品容器表面和取样部位进行彻底消毒，供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次。
7 结果判断及确证
7.1 培养 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。
7.2 结果判断 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌长，判供试品不符合规定。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M]. 一部.二部.北京：中国医药科技出版社， 2010.
[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S]. 北京：中国医药科技出版社， 2010.
【关键词】 《中国药典》2010年版；无菌检验方法
1 无菌检查的要求
无菌检查应在环境洁净度10000级下，局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。为了保证无菌检查所用洁净区环境的稳定性，保证检验结果的可靠性，对洁净区的环境质量采用合理的控制措施和评价方法。应定期按《医药工业洁净（室）区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。每次实验前要用适宜的消毒液清洁工作台面，地板，传递窗等，开启空气过滤器、紫外灯照射1小时。每次实验结束后应先用湿抹布或拖布清理污迹，再用消毒液清洁台面及地面和传递窗等，清洁消毒程序是从内向外，从高洁净区到低洁净区，开启紫外灯照射30分钟。
2 菌种及菌液制备
2.1 菌种名称 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代，其转种的培养物为第一代），以保证试验菌株的生物特性。
2.2 菌种及菌液制备 ①液体培养物直接稀释法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于9-10ml的液体培养基中，按要求的温度和时间培养后作为原液。取原液1ml用适宜的稀释剂做10倍系列稀释至每1ml含菌数50-100cfu（菌落形成单位）。采用平皿计数法测定活菌数。②细菌标准浓度比浊法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于琼脂培养基或液体培养基中，按要求的温度和时间培养后备用。取琼脂培养基上的培养物于适宜的稀释剂中制成均匀的菌悬液；液体培养物一般要比标准比浊管的浓度稀，同时培养基的颜色也影响比浊的结果，所以可采取离心集菌，去掉上清液，底部培养物再用适宜的稀释剂制成均匀的菌悬液，将上述菌悬液稀释至与标准比浊管（由国家药品检定机构分发）相同之浓度，此时的菌悬液作为原液。比较浊度时，应注意光线的强度，并从各个角度比较，以保证测定的菌数在要求的范围内，然后根据标准比浊管的说明书，同①操作。
3 注意事项
当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。
4 培养基
4.1 一般采用脱水培养基，按说明书配制 硫乙醇酸盐液体培养基它的装量和容量的高度比要对应。在完成培养的时候，培养计划层要保持在其深度的一半。在接种供应品之前要确保其高度控制在培养基深度的两成，不然在一百摄氏度的属于加热之后其粉红色就会失去。培养基的灭菌应采用验证合格的灭菌程序进行。
4.2 培养基的储存条件 未开封的脱水培养基应避光储存于25℃以下阴凉干燥处，已开封的脱水培养基，应盖紧避光储存于25℃以下阴凉干燥处，制备好的培养基应保存在2-25℃避光环境中，保存在非密闭容器中的培养基，应在3周内使用完。
4.3 培养基的装量 采用直接接种法检查的液体样品，应根据供试品的接种量确定培养基的装量，使供试品的接种体积不大于培养基体积的10%。
4.4 培养基的适用性检查 ①培养基的无菌性检查：每批配制的培养基随机抽取不少于5瓶，按规定温度培养14天，应无菌生长。②培养基的灵敏度检查：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，每支接种量为1ml，（含菌小于100cfu），另一支不接菌作为空白对照，培养3天；再取装量为9ml的改良马丁培养基5支，每支接种量为1ml，另一支作为空白对照，培养5天，空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均应生长良好。判该培养基的灵敏度符合规定。
5 无菌检查方法验证实验
5.1 为什么进行验证 无菌检查方法的验证是为了保证无菌检查结果的准确可靠，以确认供试品在该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
5.2 薄膜过滤法验证 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤，滤净后每个培养器内注入100ml培养基，取装有同体积培养基的容器不加供试品，只加入等量的试验菌，作为阳性对照，验证用的菌种同培养基的灵敏度，只是用大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。
5.3 操作的注意事项 ①过滤前要根据供试品的抗菌活性强弱，选用适宜的溶剂溶解及适量的溶剂稀释。②冲洗样品时流速不宜过快。③每张滤膜每次的冲洗量为50-100ml。④保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。判断：如果采用薄膜过法，可采用增加冲洗液的用量，改变冲洗液的种类，更换滤膜材质，或使用中和剂，灭活剂或表面活性剂等方法消除供试品的抑菌作用。
5.4 直接接种法验证 取适宜装量的硫乙醇酸盐培养基8管，分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌液各2管；取适宜装量的改良马丁培养基4管，分别加入白色念珠菌、黑曲霉各2支，每管加菌量小于100cfu，其中一管接入规定量的供试品，另一管为阳性对照，各试验管按规定的温度培养3-5天。判断：和阳性对照管相比，生长于含供试品管中的試验菌生长状况好，同时和阳性对照管之间的培养结果一致，折旧说明供应品在这个检验量，这个检验环境下无抑菌活性或抑菌活性已经被消除。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用，如果采用直接接种法，可根据情况增加培养基的用量，或在稀释液或培养基中加入中和剂，灭活剂或表面活性剂。
6 供试品的无菌检查
6.1 检验数量 是指一次检验所用供试品最小包装容器的数量
6.2 检验量 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。使用薄膜过滤法的时候，要控制检验量大于等于直接接种法的总量，如果供试品的属性可以，就要把容器中的所有物质进行整体过滤。
6.3 无菌检查法 包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品的性状允许，应采用薄膜过滤法
6.4 供试品的无菌检查 ①阳性对照：供试品的无菌检查应进行阳性对照试验。阳性对照菌的选择原则：根据验证试验结果和供试品的特性选择相应对照菌。无抑菌作用及抗细菌的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌，抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌；加菌量小于100cfu.②阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂、稀释剂及同批次滤器同法操作，作为阴性对照。③供试品的制备：操作时应对供试品容器表面和取样部位进行彻底消毒，供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次。
7 结果判断及确证
7.1 培养 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。
7.2 结果判断 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌长，判供试品不符合规定。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M]. 一部.二部.北京：中国医药科技出版社， 2010.
[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S]. 北京：中国医药科技出版社， 2010.