第一部分Caspase-1在慢性应激诱导的小鼠抑郁样行为中的作用目的:半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 1(cysteinyl aspartate-specific protease-1,caspase-1)属于半胱氨酸蛋白酶家族成员之一,以无活性的前体存在于胞内,可被炎症小体激活,从而调控炎症反应,已被证实在多种神经疾病中发挥重要作用。有研究报道caspase-l参与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的抑郁样行为,然而,尚不清楚caspase-1是否在慢性应激诱导的抑郁样行为中发挥作用。因此,本实验采用多种抑郁模型和方法研究caspase-1在抑郁行为中的作用。方法:采用慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress,CSDS)模型诱导抑郁样行为;酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CSDS模型小鼠血清中IL-1p和皮质酮表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和western blotting实验方法检测CSDS模型小鼠外周血单核细胞(periphery mononuclear blood cells,PBMC)和脑内 caspase-1 mRNA 和蛋白;慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型观察海马脑区caspase-1蛋白表达;普通PCR和western blotting检测野生型(wild-type,WT)小鼠和caspase-1基因敲除(Caspase-1s/-)小鼠海马脑区caspase-1和caspase-1前体的mRNA和蛋白质水平;应用尼氏染色和脑片免疫荧光法观察敲除caspase-1基因后小鼠脑组织结构和功能的变化;旷场(open filed test,OF)和高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)检测 capsase-1敲除小鼠的焦虑行为;观察caspase-1基因敲除小鼠对慢性束缚应激(chronic restrain stress,CRS)和CSDS所诱导的抑郁样行为;腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)介导的病毒技术过表达(overexpression)caspase-1基因至小鼠海马脑区,应用阈下社会挫败应激,悬尾实验(tail suspension test,TST)和强迫游泳实验(forced swim test,FST)等行为学实验观察小鼠抑郁和焦虑样行为;脑区定位注射给药研究小鼠侧脑室外源性给予caspase-1抑制剂对小鼠悬尾和强迫游泳行为学及CSDS所致小鼠抑郁样行为的影响。结果:(1)经CSDS造模易感小鼠表现出显著的抑郁样行为和认知损伤,qRT-PCR发现PBMC中caspase-1 mRNA的表达相对于对照组显著上调3.31 ± 0.73(n = 8,P<0.01 vs Control),同时发现易感小鼠海马脑区caspase-1mRNA显著增加2.40±0.38(n = 6,P<0.01vsControl),但在杏仁核和纹状体脑区无显著差异。此外,海马脑区caspase-1mRNA与社会接触比值呈显著负相关性(Pearson’s,r =-0.481,P<0.01)。Western blotting证实仅易感小鼠海马脑区caspase-1被激活,其表达相对于对照组上调1.69±0.08(n = 10,P<0.01vsControl)。与此同时,CUMS也可显著上调海马脑区caspase-1表达(1.30±0.03,n = 6-7,P<0.01 vs Control)。(2)Western blotting 发现Caspase-1-/小鼠海马脑区 caspase-1前体蛋白表达水平显著下调5.08 ±0.33%(n = 5-6,P<0.001 vs WT),同时钙调蛋白激酶信号未受影响(WT 组:100.0±18.9%,Caspase-1-/-组:83.5±3.8%,n = 5-6)。尼氏染色和免疫荧光证实敲除caspase-1基因不影响小鼠海马脑组织结构和功能。在旷场和高架十字迷宫实验中Caspase-1-/小鼠表现出抗焦虑行为,但基础运动能力并未受影响。另外,连续糖水测试中,敲除caspase-1基因并不影响小鼠糖水偏好行为。与WT相比,Caspase-1-/-小鼠的嘶叫和跳跃的电刺激强度无显著差异。(3)与WT模型小鼠比较,敲除caspase-1基因增加了小鼠对CSDS造模后抑郁样行为的抵抗作用,如阻断社会回避和糖水偏好的降低,同时阻断慢性应激引起的认知障碍。(4)在CRS模型中,Caspase-1-/-小鼠也能阻断慢性应激诱导的糖水偏好降低,此外还能显著性降低强迫游泳中的不动时间(WT组:77.1 ± 10.7 sec;WT-CSDS 组:138.9 ± 13.4 sec;Caspase-1-/-组:64.4 ± 7.3 sec;Caspase-1-/--CSDS 组:68.2±9.8sec)和悬尾实验中的不动时间(WT 组:69.0±6.2sec;WT-CSDS 组:118.7±10.6sec;Caspase-1-/-组:60.9±8.6sec;Caspase-1-/--CSDS组:58.3± 7.6 sec)(n = 10-11,P<0.01 vsWT-CRS)。(5)利用腺相关病毒过表达海马脑区caspase-1(AAV-caspase-1)可诱导小鼠抑郁样行为。在悬尾和强迫游泳实验中,AAV-caspase-1小鼠不动时间显著性增加(TST:AAV-GFP 组:49.6±7.0sec;AAV-caspase-1 组:87.2± 13.2 sec;FST:AAV-GFP 组:85.2 ± 8.6 sec;AAV-caspase-1 组:122.6 ± 15.4 sec)(n = 10-11,P<0.05 vs AAV-GFP)。经阈下社会挫败应激后,AAV-caspase-1小鼠易感性显著性增加,在社会接触行为实验中,AAV-caspase-1小鼠在Target阶段的社会接触时间由54.0 ± 3.7 sec降低为 33.5 ± 6.4 sec(n = 10-11,P<0.01 vs AAV-GFP),在糖水偏好率则由 78.4 ± 3.7%降低为57.8 ± 4.5%(n = 10-11,P<0.01 vs AAV-GFP)。(6)利用侧脑室定位单次给予caspase-1特异性阻断剂AC-YVAD-CMK可剂量依赖性降低小鼠在悬尾和强迫游泳行为中的不动时间(TST:Control 组:116.5 ± 7.3 sec;DMSO 组:119.3 ± 10.4 sec;5 μg/kg AC-YVAD-CMK:89.0 ± 10.0 sec;10 μg/kg AC-YVAD-CMK:85.3 ± 3.7 sec;FST:Control组:106.6±8.4sec;DMSO组:105.6±5.5sec;5μg/kgAC-YVAD-CMK:75.2±5.0sec;10 μg/kg AC-YVAD-CMK:60.8 ±7.7 sec)(n = 9-10,P<0.05 vs DMSO)。在每天 CSDS造模前30 min,预先侧脑室注射10μg/kg AC-YVAD-CMK可显著阻断社会回避行为(Target:DMSO组:47.0 ± 3.4 sec;10 μg/kg AC-YVAD-CMK 组:49.1 ± 4.0 sec;CSDS-DMSO组:18.8 ±2.5 sec;CSDS-10μg/kg AC-YVAD-CMK组:46.2 ±5.6 sec)(n =9-11,P<0.01 vs CSDS-DMSO)和糖水偏好降低(DMSO 组:82.4 ± 4.5%;10 μg/kg AC-YVAD-CMK 组:81.8 ± 3.9%;CSDS-DMSO 组:56.6 ± 5.9%;CSDS-10 μg/kg AC-YVAD-CMK组:88.0±3.5%)(n = 9-11,P<0.01vsCSDS-DMSO)。结论:海马脑区caspase-1在小鼠抑郁样行为形成过程中发挥关键作用。上调海马脑区caspase-1表达水平可促进抑郁样行为和认知障碍产生,相反,基因敲除或者药理学方法抑制caspase-1表达水平可阻断应激引起的抑郁样行为。第二部分Caspase-1介导慢性应激诱导的小鼠抑郁行为的机制目的:Caspase-1又称白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)转化酶,它是促进前体IL-1β和IL-18向成熟体转化的关键酶。其中,IL-1β是脑内主要的促炎因子,可通过炎症反应实现对认知和突触可塑性的调控。目前抑郁症病理机制不明,其中神经炎症与谷氨酸能突触传递紊乱是导致抑郁症的重要原因,但尚不清楚caspase-1介导的炎症反应是否通过作用于谷氨酸能系统参与抑郁症发生。因此,本实验探讨caspase-1介导慢性应激诱导的小鼠抑郁行为的机制。方法:急性离体场电位记录和全细胞脑片膜片钳方法分别记录海马Schaffer侧枝至CA1脑区(Schaffer collateral-CA1)通路的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials,fEPSPs)和海马CA1锥体神经元的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs);BS3 介导的膜蛋白交联技术和 western blotting 方法检测WT小鼠和Caspase-1-/小鼠应激前后海马脑区膜蛋白和总蛋白的表达;脑片荧光观察WT小鼠和Caspase-1-/-小鼠应激前后海马CA1区突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein-95,PSD95)和 DAPI 表达水平;qRT-PCR 方法检测 WT 小鼠和 Caspase-1-/-小鼠应激前后海马脑区核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor pyrin domain-containing protein 1,NLRP1)、NLRP3、黑素瘤缺乏因子2(absent in melaloma 2,AIM2)、凋亡相关的包含CARD功能域的斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD,ASC)和 IL-1βmRNA的表达水平;ELISA检测WT小鼠和Caspase-1-/-小鼠应激前后血清IL-1β表达水平;侧脑室定位注射外源性IL-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1ra),研究caspase-1介导的IL-1β信号在CSDS所致小鼠抑郁样行为和突触可塑性中作用;侧脑室定位给药技术研究外源性IL-1β对WT小鼠和Caspase-1-/小鼠抑郁和焦虑样行为的影响。结果:(1)电生理实验结果表明,CSDS引起WT小鼠海马脑区SC-CA1通路LTP受损,但不影响 Caspase-1-/-小鼠的 LTP(WT 组:142.7 ± 4.6%;WT-CSDS 组:116.6 ± 3.7%;Caspase-1-/-组:168.1 ± 5.7%;Caspase-1/--CSDS组:167.9 ± 6.2%)(n = 8-11 slices from 4-7 mice,P<0.001 vs WT-CSDS)。CSDS 显著降低 WT 小鼠 CA1 区 mEPSC 幅度(WT 组:14.0 ± 0.9 pA;WT-CSDS组:9.0 ± 0.4 pA;Caspase-1-/-组:15.5 ± 1.1 pA;Caspase-1-/--CSDS组:14.7 ±0.8 pA)(n= 10-12 cells from 4-6 mice,P<0.01 vs WT-CSDS),但不影响 LTD和mEPSC频率。(2)Caspase-1-/-小鼠可显著阻断CSDS所致的海马脑区AMPA受体膜表达下调,对GluA1和GluA2具体而言,分别由60.2 ± 3.4%和63.9 ± 3.7%上调至120.1 ±5.9%和 112.6 ± 9.6%(n = 7,P<0.01vsWT-CSDS),这与 PSD95 荧光和蛋白结果一致,但对AMPA受体总蛋白无影响,同时发现WT小鼠和Caspase-1-/-小鼠应激前后海马CA1区NMDA受体膜蛋白和总蛋白均无变化。(3)ELISA结果表明,Caspase-1-/-小鼠显著抑制 CSDS 增加血清 IL-1β 水平的作用(WT 组:66.4 ± 19.3 pg/ml;WT-CSDS 组:283.6 ± 24.8 pg/ml;Caspase-1-/-组:76.0 ± 10.9 pg/ml;Caspase-1-/--CSDS 组:86.7 ± 9.9 pg/ml)(n = 10-12,P<0.001 vs WT-CSDS),qRT-PCR结果证实海马IL-1β mRNA也被显著抑制,从18.48 ±4.62 降低为 2.84 ± 0.90(n = 5-6,P<0.01 vs WT-CSDS)。此外,敲除 caspase-1 基因不能阻止CSDS对NLRP3 mRNA的上调作用,但可抑制CSDS对ASC mRNA的上调作用,对 NLRP1 和 AIM2mRNA 无明显影响。(4)Western blotting 结果证实,Caspase-1-/-小鼠对CSDS的抵抗作用依赖于抑制海马脑区IL-1β产生,IL-1β蛋白表达水平从WT-CSDS组的 155.1 ± 6.5%下调至 97.7 ± 8.5%(n = 6-7,P<0.01 vs WT-CSDS),进而取消 CSDS对BDNF信号通路的抑制作用。(5)侧脑室重复注射IL-1ra可剂量依赖性阻断CSDS诱导的抑郁样行为。此外,90μg/kg的IL-1ra可通过抑制海马脑区IL-1β信号,逆转慢性应激引起的 AMPA 受体膜表达水平降低(GluA1:Vehicle 组:100-0 ± 10.2%;CSDS-vehicle组:57.1 ± 3.6%;90 μg/kg IL-1ra 组:102.0 ± 8.8%;CSDS-90 μg/kg IL-1ra 组:99.8 ± 9.8%;GluA2:Vehicle 组:100.0±4.7%;CSDS-vehicle 组:59.8±6.4%;90 μg/kg IL-1ra 组:96.8±10.8%;CSDS-90μg/kg IL-1ra组:93.3±7.6%)(n = 5-6,P<0.05 vs CSDS-vehicle)和mEPSC 幅度下调(Vehicle 组:20.7 ± 1.3 pA;CSDS-vehicle 组:14.0 ± 1.0 pA;90 μg/kg IL-1ra组:20.7 ± 1.0 pA;CSDS-90 μg/kg IL-1ra 组:19.2 ± 0.8 pA)(n = 10-12 cells from 4-6 mice pergroup,P<0.01vsCSDS-vehicle)。(6)重复侧脑室注射 IL-1p(5μg/kg,10 天)诱导WT和Caspase-1-/-小鼠抑郁和焦虑样行为产生。结论:CSDS可激活海马脑区caspase-1依赖性的IL-1p信号,进而减少AMPA受体的膜表达和谷氨酸能突触传递,敲除或者抑制caspase-1-IL-1β信号通路可取消CSDS所致的突触可塑性损伤。慢性侧脑室注射IL-1β诱导Caspase-1-/-小鼠产生抑郁和焦虑样行为,提示caspase-1-IL-1β信号是治疗抑郁症的新靶点。