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摘 要：用脂质体转染的方法将特定的RUVBL2 siRNA序列转染到真核细胞，并鉴定其在人肺纤维细胞（MRC5 SV）中的表达，以确保RUVBL2基因的knock-down效果。用Rad51和γ-H2AX的特异性抗体进行免疫荧光染色，应用荧光显微镜观察计数Rad51和γ-H2AX foci的数量。Western blot法证实了siRNA以及转染的效率，确定了RUVBL2基因的存在有利于诱导DNA双链断裂（DSB）条件下Rad51和γ-H2AX被招募到DNA损伤位点。
关键词：RUVBL2 siRNA RAD51 γ-H2AX foci
中图分类号：R113 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）01（b）-0200-03
在细胞生命活动过程中，基因组DNA常会受到内源和外源因子的攻击而发生不同类型的损伤。其中，对细胞最具伤害性的损伤是DNA双链断裂（double-strand break， DSB）。大分子蛋白复合体INO80就直接参与了DSB修复过程[1]。RUVBL蛋白是INO80复合体的一类重要亚基。RUVBL1（RuvB-like 1）和RUVBL2（RuvB-like 2）同属于ATPases（AAA+ ATPase）家族成員，是细菌DNA 解旋酶RuvB蛋白在哺乳动物中的同源蛋白[2]。
同源重组是DSB修复的一种重要修复方式，RAD51是一种重要的重组蛋白，主要寻找同源DNA的模板并且帮助在损伤DNA与未损伤DNA修复模板之间产生联系[3]。在酵母中，INO80复合体在染色体修饰和染色体重组过程中会将RAD51蛋白招募到DNA损伤位点[4]，而在哺乳动物细胞里INO80复合体也会在染色体修饰和染色体重组过程中将RAD51招募到了DNA损伤位点[5]。哺乳动物INO80复合体通过DNA末端切除的作用介导了DSB的修复[6]。RUVBL蛋白的缺失会影响RAD51被招募到DNA双链断裂位点，从而影响到后续进行的DNA末端切除修复[7]。小鼠和人体细胞内，在含有RUVBL蛋白的TIP60复合体缺失或者活性降低的情况下，RAD51被招募至DNA双链断裂损伤位点的进程也会被削弱[8]。也就是说RUVBL蛋白在DNA损伤修复过程，尤其是末端切除修复中有着不可替代的作用。细胞在电离辐射等因素作用下直接诱导形成的DSB可诱导H2AX磷酸化成γ-H2AX，γ-H2AX是DNA 双链断裂的一个标志[9]。细胞在受到DNA损伤后，尤其是DNA双链断裂后，在断裂位点会出现由γ-H2AX形成的焦点。γ-H2AX对于其他蛋白募集到焦点起着非常关键的作用[10]。INO80复合体通过与γ-H2AX相互作用而使得INO80被招募到DNA双链断裂处[11]。在人类细胞中，RUVBL就参与了与γ-H2AX的相互作用[12]。由此可以推测RUVBL蛋白在哺乳动物细胞DNA损伤修复的过程中有着重要的作用。
RUVBL1作为INO80的亚基之一，在DSB修复过程中起到了重要的作用，主要体现在诱导H2AX磷酸化变成γ-H2AX，然后将Rad51修复蛋白招募至DSB位点[13]。由于RUVBL2和RUVBL1的同源性，我们猜测RUVBL2和RUVBL1也有相似的作用。为了探究RUVBL2是否也参与了DSB的修复，在人类细胞里用siRNA的方法降低RUVBL2蛋白表达，X射线处理诱导DSB的形成，探索在此种情况下Rad51和γ-H2AXfoci的形成是否会受到RUVBL2蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人胚肺成纤维细胞MRC5 SV细胞系为本实验室保存，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，DMEM培养基购自Nissui公司，新生胎牛血清购自Biological Industries公司，兔抗RUVBL2（EPR4146）抗体购自Abcam 公司，HRP 标记山羊抗兔IgG（474-1516）购自KPL公司，β-Tubulin抗体（T8328）购自 Sigma公司，HRP标记抗鼠IgG （sc-2005）购自Santa Cruz Biotechnology公司，ECL 发光试剂盒购自Promega公司，DAPI细胞核荧光染剂购自WAKO公司，RAD51抗体（70-002）购自Bio Academia公司，γ-H2AX 抗体（05-636）购自MILLIPORE公司，鼠抗（Alexa Fluor 546）购自Invitrogen公司，兔抗（Alexa Fluor 488）购自Invitrogen公司，荧光封闭剂购自DAKO公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肺纤维细胞MRC5-SV细胞系用于进行RUVBL2 knock-down的实验。细胞系培养于DMEM培养基，内含有10% 胎牛血清，L-谷氨酰胺（584μg/mL）和卡那霉素（20 μg/mL）。细胞放置37°C，5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 siRNA
MRC5-SV细胞培养于直径为10 cm的培养皿中，当细胞密度达到约50%左右，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂将RUVBL2 siRNA （2～30 nM） 转入细胞。1 d以后将细胞分装成4盘，3d以后收集细胞检测蛋白。siRNA序列为5’-gctccacgcagtacatgaaggagta-3’。
1.2.3 Western blot分析
细胞培养5 d后收集细胞，低温RIPA 缓冲液（25 mM Tris-HCl （pH 7.6），150 mM，NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate和0.1% SDS） 重悬细胞，补充1 mM PMSF 放置10min， 涡旋震荡2次，2 s/次，4°C，22，000 ×g离心20 min，取上清。蛋白浓度的测定用BCA protein assay kit （Pierce）。蛋白样品上样至7.5%SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，转膜仪Trans-Blot Turbotransfer system （BIO-RAD）的作用下蛋白被转移至PDVF 膜。TBST（20 mM Tris-HCl（pH 7.6），150 mM NaCl和0.1% Tween 20）清洗PDVF膜。 用含有1% BSA 的TBST封闭PDVF膜，封闭后用TBST清洗。加入RUVBL2抗体（1：5000稀释），4 ℃ 过夜； 次日用TBST洗3次，10 min/次；加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（KPL 474-1516， 1：5000稀释），37 ℃，1 h； TBST 洗3 次，10 min/次。β-Tubulin作为对照蛋白，加入β-Tubulin抗体（1：5000稀释），4 ℃过夜；次日用TBST洗3次，10 min/次； 加入HRP 标记的抗鼠二抗（1：2000稀释）。用ECL显色，ChemiDoc XRS+ system（BIO-RAD）化学发光凝胶成像系统中检测杂交信号。目标条带密度将由Precision Plus Protein WesternC Standard（BIO-RAD）进行计算。 1.2.4 foci免疫荧光染色
细胞需要培养于盖玻片上：用镊子将高温灭菌后的盖玻片（MATSUNAMI S2112 microslide glass）放进直径为10 cm的培养皿中，每片盖玻片承载500 uL的细胞悬液（细胞悬液的浓度约为5×105个细胞/mL）。细胞培养箱培养30 min，细胞于盖玻片附着稳定后，加入10 mL培养基，培养箱中培养24 h。24 h后，真空泵吸除细胞培养基，10 mPBS清洗两次。将盖玻片浸泡于冰甲醇里，冰箱放置20 min，取出盖玻片，移除残留甲醇后，在冰丙酮里浸泡7 s后迅速取出干燥。加入300 uL封闭液封闭盖玻片，室温反应20 min。加入150 uL γ-H2AX/ RAD51抗体（10%BSA 15μL，γ-H2AX 1：150，RAD51 1：400稀釋于PBS），4 ℃过夜；次日用PBS 洗3次，10 min/次；加入二抗150 uL（10%BSA 15μL，抗鼠二抗1：500，抗兔二抗1：1000稀释于PBS），37 ℃，1 h；PBS 洗3次，10 min/次。将盖玻片放入有0.05% tween20%PBS 的罐子里避光放置5 min。取出盖玻片吸干PBS。将100 uL细胞核染液（DAKO：DAPI=1：500）均匀夹在固定有细胞的盖玻片上。将盖玻片放置在载玻片上，用指甲油封住边缘处。最后用荧光显微镜（Olympus FluoView）进行观察。
2 结果与分析
2.1 siRNA效果检测
siRNA序列作用于RUVBL2 mRNA。siRNA被转染进入MRC5-SV细胞， 用Western blot分析法分析了转染3 d后siRNA对RUVBL2 knock-down的效果。最适knock-down浓度为10 nM siRUVBL2，如图1所示。
2.2 RUVBL2knock-down对γ-H2AX的影响
如图2所示，没有抑制RUVBL2蛋白表达时，经X射线照射诱导了DSB形成后，γ-H2AX的foci数量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表达，再经X射线处理，γ-H2AX foci数量明显要比RUVBL2表达没有被抑制时的γ-H2AX的foci数量要少，这说明RUVBL2有可能参与；了DSB诱导γ-H2AX的形成。
2.3 RUVBL2的knock-down对RAD51 foci的影响
没有抑制RUVBL2蛋白表达时，经X射线照射诱导了DSB的形成，RAD51的foci数量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表达，再经X射线处理，RAD51 foci数量明显要比没有被knock-down的细胞RAD51的foci数量要少（图3），这说明siRUVBL2影响了RAD51被招募到细胞核，间接说明RUVBL2参与了将RAD51招募到DSB损伤位点处的作用。
3 结论
从荧光免疫的实验来看，我们可以说RAD51和γ-H2AX的foci是受到了RUVBL2 knock-down的影响。对于对照处理细胞来说，10Gy X射线处理过的细胞里RAD51和γ-H2AX的foci数量明显要比没有被射线照射的细胞多。由此我们可以初步得出以下结论：RUVBL2参与了招募RAD51至损伤位点的进程，一旦RUVBL2缺失，将会阻碍DNA损伤触发细胞周期中的信号传导等一系列级联反应，阻碍RAD51被招募到DNA损伤位点。
因此，这个结果揭示了抑制RUVBL2的表达会影响DSB诱发的RAD51分配失调进而阻碍DNA损伤修复应答的进程。
参考文献
[1] 周建杰，陈学峰.ATP依赖型染色质重塑复合物在DNA双链断裂修复中的作用[J].生命科学，2016（4）：452-463.
[2] 郑英，谢林俊，张露萍，等.人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa 细胞中的表达[J].细胞与分子免疫学杂志，2012， 28（6）：586-587.
[3] 乔贵宾.Rad51在同源重组中作用及其与肿瘤关系的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2010，17（4）：306-310.
[4] T.Tsukuda，A.B.Fleming，J.a Nickoloff，et al.Chromatin remodelling at a DNA double-strand break site in Saccharomyces cerevisiae[J].Nature，2005，438（7066）：379-383.
[5] T.Ikura，V.V Ogryzko，M.Grigoriev，et al. Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis[J]，Cell，2000，102（4）：463-473.
[6] 董立国.人INO80染色质重塑复合物调控基因的分析与基因间调控网络的构建[D].吉林大学，2016.
[7] Gospodinov A，Tsaneva I，Anachkova B. RAD51 foci formation inresponse to DNA damage is modulated by TIP49[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2009，41（4）：925-933.
[8] 杜凤霞.Tip60磷酸化和p400对Tip60活性及DNA双链断裂修复通路的调控[D].中国科学院北京基因组研究所，2013.
[9] 宾萍，郑玉新.γ-H2AX与DNA双链断裂关系的研究进展[J].卫生研究，2007，36（4）：520-522.
[10] 余艳柯，陆源，余应年，等.γH2AX：DNA双链断裂的标志[J].中国药理学与毒理学杂志，2005，19（3）：237-240.
[11] A.J.Morrison，J.Highland，N.J.Krogan，et al.INO80 and gamma-H2AX interaction links ATP-dependent chromatin remodeling to DNA damage repair[J].Cell，2004，119（6）：767-775.
[12] 樊嵘.Tip60蛋白对细胞DNA损伤反应的调节作用及机制研究[D].中国人民解放军军事医学科学院，2011.
[13] Gospodinov A，Tsaneva I，Anachkova B.RAD51 foci formation in response to DNA damage is modulated by TIP49[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2009，41（4）：925-933.
关键词：RUVBL2 siRNA RAD51 γ-H2AX foci
中图分类号：R113 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）01（b）-0200-03
在细胞生命活动过程中，基因组DNA常会受到内源和外源因子的攻击而发生不同类型的损伤。其中，对细胞最具伤害性的损伤是DNA双链断裂（double-strand break， DSB）。大分子蛋白复合体INO80就直接参与了DSB修复过程[1]。RUVBL蛋白是INO80复合体的一类重要亚基。RUVBL1（RuvB-like 1）和RUVBL2（RuvB-like 2）同属于ATPases（AAA+ ATPase）家族成員，是细菌DNA 解旋酶RuvB蛋白在哺乳动物中的同源蛋白[2]。
同源重组是DSB修复的一种重要修复方式，RAD51是一种重要的重组蛋白，主要寻找同源DNA的模板并且帮助在损伤DNA与未损伤DNA修复模板之间产生联系[3]。在酵母中，INO80复合体在染色体修饰和染色体重组过程中会将RAD51蛋白招募到DNA损伤位点[4]，而在哺乳动物细胞里INO80复合体也会在染色体修饰和染色体重组过程中将RAD51招募到了DNA损伤位点[5]。哺乳动物INO80复合体通过DNA末端切除的作用介导了DSB的修复[6]。RUVBL蛋白的缺失会影响RAD51被招募到DNA双链断裂位点，从而影响到后续进行的DNA末端切除修复[7]。小鼠和人体细胞内，在含有RUVBL蛋白的TIP60复合体缺失或者活性降低的情况下，RAD51被招募至DNA双链断裂损伤位点的进程也会被削弱[8]。也就是说RUVBL蛋白在DNA损伤修复过程，尤其是末端切除修复中有着不可替代的作用。细胞在电离辐射等因素作用下直接诱导形成的DSB可诱导H2AX磷酸化成γ-H2AX，γ-H2AX是DNA 双链断裂的一个标志[9]。细胞在受到DNA损伤后，尤其是DNA双链断裂后，在断裂位点会出现由γ-H2AX形成的焦点。γ-H2AX对于其他蛋白募集到焦点起着非常关键的作用[10]。INO80复合体通过与γ-H2AX相互作用而使得INO80被招募到DNA双链断裂处[11]。在人类细胞中，RUVBL就参与了与γ-H2AX的相互作用[12]。由此可以推测RUVBL蛋白在哺乳动物细胞DNA损伤修复的过程中有着重要的作用。
RUVBL1作为INO80的亚基之一，在DSB修复过程中起到了重要的作用，主要体现在诱导H2AX磷酸化变成γ-H2AX，然后将Rad51修复蛋白招募至DSB位点[13]。由于RUVBL2和RUVBL1的同源性，我们猜测RUVBL2和RUVBL1也有相似的作用。为了探究RUVBL2是否也参与了DSB的修复，在人类细胞里用siRNA的方法降低RUVBL2蛋白表达，X射线处理诱导DSB的形成，探索在此种情况下Rad51和γ-H2AXfoci的形成是否会受到RUVBL2蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人胚肺成纤维细胞MRC5 SV细胞系为本实验室保存，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，DMEM培养基购自Nissui公司，新生胎牛血清购自Biological Industries公司，兔抗RUVBL2（EPR4146）抗体购自Abcam 公司，HRP 标记山羊抗兔IgG（474-1516）购自KPL公司，β-Tubulin抗体（T8328）购自 Sigma公司，HRP标记抗鼠IgG （sc-2005）购自Santa Cruz Biotechnology公司，ECL 发光试剂盒购自Promega公司，DAPI细胞核荧光染剂购自WAKO公司，RAD51抗体（70-002）购自Bio Academia公司，γ-H2AX 抗体（05-636）购自MILLIPORE公司，鼠抗（Alexa Fluor 546）购自Invitrogen公司，兔抗（Alexa Fluor 488）购自Invitrogen公司，荧光封闭剂购自DAKO公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肺纤维细胞MRC5-SV细胞系用于进行RUVBL2 knock-down的实验。细胞系培养于DMEM培养基，内含有10% 胎牛血清，L-谷氨酰胺（584μg/mL）和卡那霉素（20 μg/mL）。细胞放置37°C，5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 siRNA
MRC5-SV细胞培养于直径为10 cm的培养皿中，当细胞密度达到约50%左右，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂将RUVBL2 siRNA （2～30 nM） 转入细胞。1 d以后将细胞分装成4盘，3d以后收集细胞检测蛋白。siRNA序列为5’-gctccacgcagtacatgaaggagta-3’。
1.2.3 Western blot分析
细胞培养5 d后收集细胞，低温RIPA 缓冲液（25 mM Tris-HCl （pH 7.6），150 mM，NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate和0.1% SDS） 重悬细胞，补充1 mM PMSF 放置10min， 涡旋震荡2次，2 s/次，4°C，22，000 ×g离心20 min，取上清。蛋白浓度的测定用BCA protein assay kit （Pierce）。蛋白样品上样至7.5%SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，转膜仪Trans-Blot Turbotransfer system （BIO-RAD）的作用下蛋白被转移至PDVF 膜。TBST（20 mM Tris-HCl（pH 7.6），150 mM NaCl和0.1% Tween 20）清洗PDVF膜。 用含有1% BSA 的TBST封闭PDVF膜，封闭后用TBST清洗。加入RUVBL2抗体（1：5000稀释），4 ℃ 过夜； 次日用TBST洗3次，10 min/次；加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（KPL 474-1516， 1：5000稀释），37 ℃，1 h； TBST 洗3 次，10 min/次。β-Tubulin作为对照蛋白，加入β-Tubulin抗体（1：5000稀释），4 ℃过夜；次日用TBST洗3次，10 min/次； 加入HRP 标记的抗鼠二抗（1：2000稀释）。用ECL显色，ChemiDoc XRS+ system（BIO-RAD）化学发光凝胶成像系统中检测杂交信号。目标条带密度将由Precision Plus Protein WesternC Standard（BIO-RAD）进行计算。 1.2.4 foci免疫荧光染色
细胞需要培养于盖玻片上：用镊子将高温灭菌后的盖玻片（MATSUNAMI S2112 microslide glass）放进直径为10 cm的培养皿中，每片盖玻片承载500 uL的细胞悬液（细胞悬液的浓度约为5×105个细胞/mL）。细胞培养箱培养30 min，细胞于盖玻片附着稳定后，加入10 mL培养基，培养箱中培养24 h。24 h后，真空泵吸除细胞培养基，10 mPBS清洗两次。将盖玻片浸泡于冰甲醇里，冰箱放置20 min，取出盖玻片，移除残留甲醇后，在冰丙酮里浸泡7 s后迅速取出干燥。加入300 uL封闭液封闭盖玻片，室温反应20 min。加入150 uL γ-H2AX/ RAD51抗体（10%BSA 15μL，γ-H2AX 1：150，RAD51 1：400稀釋于PBS），4 ℃过夜；次日用PBS 洗3次，10 min/次；加入二抗150 uL（10%BSA 15μL，抗鼠二抗1：500，抗兔二抗1：1000稀释于PBS），37 ℃，1 h；PBS 洗3次，10 min/次。将盖玻片放入有0.05% tween20%PBS 的罐子里避光放置5 min。取出盖玻片吸干PBS。将100 uL细胞核染液（DAKO：DAPI=1：500）均匀夹在固定有细胞的盖玻片上。将盖玻片放置在载玻片上，用指甲油封住边缘处。最后用荧光显微镜（Olympus FluoView）进行观察。
2 结果与分析
2.1 siRNA效果检测
siRNA序列作用于RUVBL2 mRNA。siRNA被转染进入MRC5-SV细胞， 用Western blot分析法分析了转染3 d后siRNA对RUVBL2 knock-down的效果。最适knock-down浓度为10 nM siRUVBL2，如图1所示。
2.2 RUVBL2knock-down对γ-H2AX的影响
如图2所示，没有抑制RUVBL2蛋白表达时，经X射线照射诱导了DSB形成后，γ-H2AX的foci数量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表达，再经X射线处理，γ-H2AX foci数量明显要比RUVBL2表达没有被抑制时的γ-H2AX的foci数量要少，这说明RUVBL2有可能参与；了DSB诱导γ-H2AX的形成。
2.3 RUVBL2的knock-down对RAD51 foci的影响
没有抑制RUVBL2蛋白表达时，经X射线照射诱导了DSB的形成，RAD51的foci数量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表达，再经X射线处理，RAD51 foci数量明显要比没有被knock-down的细胞RAD51的foci数量要少（图3），这说明siRUVBL2影响了RAD51被招募到细胞核，间接说明RUVBL2参与了将RAD51招募到DSB损伤位点处的作用。
3 结论
从荧光免疫的实验来看，我们可以说RAD51和γ-H2AX的foci是受到了RUVBL2 knock-down的影响。对于对照处理细胞来说，10Gy X射线处理过的细胞里RAD51和γ-H2AX的foci数量明显要比没有被射线照射的细胞多。由此我们可以初步得出以下结论：RUVBL2参与了招募RAD51至损伤位点的进程，一旦RUVBL2缺失，将会阻碍DNA损伤触发细胞周期中的信号传导等一系列级联反应，阻碍RAD51被招募到DNA损伤位点。
因此，这个结果揭示了抑制RUVBL2的表达会影响DSB诱发的RAD51分配失调进而阻碍DNA损伤修复应答的进程。
参考文献
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[6] 董立国.人INO80染色质重塑复合物调控基因的分析与基因间调控网络的构建[D].吉林大学，2016.
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[8] 杜凤霞.Tip60磷酸化和p400对Tip60活性及DNA双链断裂修复通路的调控[D].中国科学院北京基因组研究所，2013.
[9] 宾萍，郑玉新.γ-H2AX与DNA双链断裂关系的研究进展[J].卫生研究，2007，36（4）：520-522.
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[11] A.J.Morrison，J.Highland，N.J.Krogan，et al.INO80 and gamma-H2AX interaction links ATP-dependent chromatin remodeling to DNA damage repair[J].Cell，2004，119（6）：767-775.
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