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摘要：【目的】利用ISSR分子標记分析不同类型甘薯种质的遗传多样性，为甘薯种质资源的传播途径分析、分类鉴定、有效利用及杂交亲本选择等提供参考依据。【方法】从100条ISSR引物中筛选出多态性好、扩增条带清晰且重复性好的ISSR引物，利用其对129份甘薯种质材料进行扩增，通过DPS 7.05计算不同种质间的遗传距离，并采用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。【结果】以筛选获得的20条ISSR引物对129份甘薯种质材料进行扩增，共获得232条条带，其中多态性条带230条，多态性条带比例达99.14%，平均每条ISSR引物扩增出11.60条条带。基于ISSR分子标记的5份野生种平均遗传距离为0.4637，124份甘薯栽培种平均遗传距离为0.1805。野生种与地方品种、引进品种和育成品种间的平均遗传距离分别为0.4688、0.4618和0.4643;而在124份栽培种中，地方品种与引进品种间的平均遗传距离最大（0.2024），引进品种与育成品种间的平均遗传距离最小（0.1673），地方品种与育成品种间的平均遗传距离为0.1978。聚类分析结果表明，当在遗传距离为0.3200时可将野生种与栽培种完全区分开;5份野生种在遗传距离为0.3200时又被划分为4个类别;124份栽培种在遗传距离为0.2000时可划分为6个类别，其中，新种花、福菜薯18号和黄皮9号3个品种各自单独组成一个类群（第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ类），金山57、豫薯8号和瑞薯1号组成第Ⅲ类;第Ⅳ类包含93个地方品种和育成品种;第Ⅵ类由25个地方品种和育成品种组成。【结论】不同类型和不同来源地的甘薯种质资源间存在较大遗传差异，以野生种与栽培种间的遗传差异最大，而栽培种间又以地方品种和引进品种间差异较大，即地方品种资源在我国甘薯育种亲本选择利用方面还具有很大的应用潜力。ISSR分子标记是一种适用于甘薯资源遗传多样性分析的理想分子标记。
关键词： 甘薯;种质资源;ISSR分子标记;遗传多样性;聚类分析
中图分类号： S531.024 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2392-09
Genetic diversity analysis of sweetpotato [Ipomoea batatas（L.） Lam.] by ISSR molecular markers
LIU Zhong-hua， LIN Zhi-jian， LI Hua-wei， XU Yong-qing， LI Guo-liang，
QIU Yong-xiang， QIU Si-xin*， TANG Hao*
（Crops Research Institute， Fujian Academy of Agriculture Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Tuber and Root Crops in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs ， Fuzhou 350013， China）
Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for analysis of the domestication pathways， classification and identification， effective utilization and selection of hybrid parents of sweet potato germplasm， the ISSR molecular markers were used to analyze the genetic diversity of different types of sweet potato. 【Method】ISSR primers with rich polymorphism， clear amplified bands and good repeatability were screened out from 100 primers. The DNA of 129 sweet potato accessions were amplified by the selected ISSR primers， and amplified bands were analyzed. The genetic distances among various varieties were calculated using DPS 7.05， and the cluster analysis was performed using the un-weighted pair-group arithmetical mean method（UPGMA）. 【Result】The results showed that∶232 bands were amplified by 20 polymorphic ISSR primers selected from 100， of which 230 were polymorphic bands， with a polymorphic ratio of 99.14%， and the average bands amplified by each primer were 11.60. The average genetic distance of five wild species based on ISSR marker was 0.4637， which among 124 sweet potato cultivars was 0.1805. The average genetic distance between wild varieties and local varieties， between wild varieties and introduced varieties and wild varieties and bred varieties were 0.4688， 0.4618 and 0.4643. Among all 124 cultivars， the average genetic distance between local accessions and the introduced varieties was the largest（0.2024）， while which between the introduced varieties and the bred varieties was the smallest（0.1673）. The average genetic distance between local accessions and bred cultivars was 0.1978. The results of cluster analysis showed that wild species were completely distinguished from cultivars when the genetic distance was 0.3200. Furthermore， five wild species were divided into four categories at this level， while 124 cultivars were divided into 6 categories at the level of 0.2000. Among them， Xinzhonghua， Fucaishu No.18 and Huangpi No.9 were in three single groups（Categories I， II， and V） separately， and Jinshan 57， Yushu No.8 and Ruishu No.1 were classified in group III. Meanwhile， Group IV contained 93 local accessions and bred cultivars， and group VI consisted of 25 local accessions and bred cultivars. 【Conclusion】There are wide genetic differences between different types and different sources of sweet potato germplasm. The genetic difference between wild species and cultivars is the largest. Among cultivars， the differences between local accessions and introduced cultivars are larger than others. That means local accessions have great application potential for the selection and utilization of breeding parents of sweet potato in China. ISSR molecular marker is an ideal molecular marker suitable for analysis of genetic diversity of sweet potato germplasm. Key words： sweet potato; germplasm resources; ISSR molecular marker; genetic diversity; cluster analysis
0 引言
【研究意义】甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是世界上重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源作物，也是世界七大作物之一，我国甘薯产量占世界总产量的67.3%（苏一钧等，2018）。甘薯在我国已有400多年的种植历史，且地方品种层出不穷（范泽民，2015）。虽然我国甘薯育种已取得长足进展，处于世界先进水平（张立明等，2003;马代夫等，2005），但甘薯育种的种间遗传背景狭窄（贺学勤等，2005），其亲本集中在少数品种之间，非常不利于甘薯品种的遗传改良（吴觐宇等，2009）。因此，利用分子标记技术开展甘薯种质的遗传多样性分析，明确各类种质间的遗传背景、加强亲本选配等，对推进甘薯育种具有重要意义。【前人研究进展】ISSR分子标记兼具RAPD和SSR分子标记的优点，现已广泛应用于生物品种鉴定（Culley and Wolfe，2001;赵谦等，2007）、遗传图谱构建（易克等，2003）、基因定位（李冬梅，2016）及遗传多样性分析（朱岩芳等，2010;张盾等，2018;闫林等，2019）等领域。贺学勤等（2005）利用RAPD、ISSR和AFLP分子标记对系谱关系明确的7个甘薯品种进行亲缘关系分析，结果发现基于ISSR分子标记得到的聚类图与系谱图最吻合，因此认为ISSR分子标记更适于分析甘薯品种的亲缘关系。郝玉民等（2007）利用SRAP分子标记对36份甘薯品种进行DNA多态性分析，结果表明所选材料间具有较高的遗传相似度。吴洁等（2007）利用SRAP分子标记对四川省86份甘薯品种亲缘关系进行分析，结果证实四川省育成的甘薯品种资源遗传范围较狭窄。李强等（2008，2009）利用ISSR和AFLP分子标记分析我国62份甘薯主要亲本和26份主要育成品種的遗传多样性以明确其遗传差异，结果显示我国甘薯育成品种遗传基础狭窄的局面尚未得到改观。陈新起等（2009）利用ISSR分子标记分析10个菜用甘薯材料的遗传多样性和亲缘关系，结果显示菜用甘薯材料的遗传差异较明显。吴觐宇等（2009）对25份美国甘薯品系及我国47份甘薯种质资源进行ISSR多态性分析，结果表明美国甘薯育种材料遗传多样性较高，可将其应用到国内甘薯育种中以扩大遗传背景。宋吉轩等（2011，2017）利用ISSR分子标记分析贵州甘薯地方品种资源和紫心甘薯种质的遗传多样性，结果发现23份贵州紫心甘薯种质资源间的亲缘关系较近。季志仙等（2014）选用6个ISSR分子标记对l7份甘薯品种进行DNA指纹扩增，结果表明甘薯主要食用品种间具有较好的遗传多样性，但同类型品种间又具有较高的遗传相似性，即这类品种需要引进或创制新资源。赵冬兰等（2015）利用形态农艺性状标记对来自17个省份的176份我国甘薯地方种质资源进行遗传多样性分析，结果发现形态标记并未按照这些地方种质的来源地进行聚类。刘中华等（2018）采用SRAP分子标记对129份甘薯种质进行遗传多样性和起源演化分析，结果证实SRAP分子标记可有效应用于甘薯遗传多样性及其起源与演化分析。【本研究切入点】至今，鲜见利用ISSR分子标记同时对野生资源、地方品种、引进品种和育成品种等4类甘薯种质开展遗传多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】利用ISSR分子标记分析129份不同类型甘薯种质的遗传多样性，以期为甘薯种质资源的传播途径分析、分类鉴定、有效利用及杂交亲本选择等提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料包含野生种、地方品种、引进品种和育成品种等4类129种甘薯种质（表1），均种植于福建省农业科学院作物所薯类作物种质资源圃内。ISSR引物、琼脂糖和40%丙烯酰胺溶液购自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司;DL2000 DNA Marker购自贵州弥勒天根生物科技有限公司。主要仪器设备：垂直电泳槽（DYCZ-24A，北京六一有限公司）、移液器（Eppendorf，德国）、Veriti 96well PCR仪（ABI，美国）、离心机（Eppendorf，德国）、-80 ℃超低温冰箱（SANYO，日本）、水平电泳槽（DYCZ-22A，北京六一有限公司）和Nanodrop2000C超微量分光光度计（Thermo，美国）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 甘薯基因组DNA提取 采用改进后的甘薯基因组DNA高效快速提取方法（李强等，2007）提取甘薯鲜幼嫩叶片总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并以Nanodrop2000C超微量分光光度计测定DNA浓度，-20 ℃保存备用。
1. 2. 2 ISSR引物筛选 利用8份材料的基因组DNA从100条ISSR引物中筛选出重复性好、条带清晰、多态性丰富，且扩增条带（100～1000 bp）数目较多（不少于5条）的引物进行正式扩增。
1. 2. 3 PCR扩增 PCR反应体系20.0 μL：ISSR引物2.0 μL，DNA模板2.0 μL，PCR SuperMix（含DNA Polymerase和dNTPs的反应缓冲液）10.0 μL，蒸馏水6.0 μL。扩增程序参照宋吉轩等（2009，2010）的方法，即95 ℃预变性5 min;95 ℃ 45 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行41个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物以8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压130 V，功率4 W，时间90 min）进行分离检测后，采用银染法（固定→银染→显色）进行染色，最后观察并拍照。
1. 3 统计分析 应用DPS 7.05对扩增条带的有无进行计数，当某一扩增条带出现时赋值为“1”，不存在时赋值为“0”，从而将图形资料转换成数据资料，计算不同种质间的遗传距离（Genetic distance，GD），然后采用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。
GD=-ln[2Nij/（Ni+Nj）]
式中，Ni表示种质i的条带数目，Nj表示种质j的条带数目，Nij表示种质i和种质j共有的条带数目。
2 结果与分析
2. 1 ISSR引物筛选及扩增结果
利用8份材料的基因组DNA分别对100条ISSR引物进行多态性筛选，结果筛选出20条多态性好、扩增条带清晰且重复性好的ISSR引物（表2和图1）;利用筛选获得的20条ISSR引物对129份甘薯种质材料进行扩增，共获得232条条带，其中多态性条带230条，多态性条带比例达99.14%，平均每条ISSR引物扩增出11.60条条带。引物UBC811的多态性最高，能扩增出16条条带（图2）。
2. 2 聚类分析结果
基于ISSR分子標记的5份野生种平均遗传距离为0.4637，124份甘薯栽培种平均遗传距离为0.1805。其中，84份育成品种的平均遗传距离为0.1670，28份地方品种的平均遗传距离为0.1968;12份引进品种的平均遗传距离为0.1791。由图3可看出，当遗传距离按0.3200（线L1）划分时，能将5份野生种与124份栽培种完全区分开;5份野生种在遗传距离为0.3200时又被划分为4个类别：来自澳大利亚的二倍体I. quamoclit单独归为一类;来自委内瑞拉的二倍体材料I. trifida和来自多米尼加的二倍体材料I. triloba归为一类;来自巴西的二倍体材料I. setosa和来自巴拉圭的二倍体材料I. nil分别归为一类。124份甘薯栽培种在遗传距离为0.2000（线L2）时可划分为2个大类、4个小类共计6个类别，其中，新种花、福菜薯18号和黄皮9号3个品种各自单独组成一个类群，分别为第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ类;金山57、豫薯8号和瑞薯1号组成第Ⅲ类;第Ⅳ类包含93个地方品种和育成品种;第Ⅵ类由25个地方品种和育成品种组成。
124份栽培种中，新种花在自然条件下极难开花，难以有效地与其他品种进行传粉、结实并形成后代，其单独聚为一类为第Ⅰ类，与其他品种的遗传距离较远;第Ⅱ类的福菜薯18号是一个叶菜专用型品种，其亲本材料以福建和台湾的叶菜型品种为主;金山57、豫薯8号和瑞薯1号3个品种组成第Ⅲ类，发现这3个品种中均具有来自广东甘薯品种的遗传背景;湘薯75-55、济薯20和岩高糖等93个品种组成第Ⅳ类，其几乎涵盖了大部分来源的甘薯品种，日本、美国和菲律宾等地区的引入品种均聚类在此类中，其中，来自菲律宾的2个品种DaJa和Kccane分别与我国福建和台湾地区的品种乌骨仔和台农63聚在一起;黄皮9号单独聚为一类（第Ⅴ类）;广薯87、徐28、徐紫薯2号等25个品种聚在一类（第Ⅵ类），此类甘薯主要为来源于福建、广东的地方品种和育成品种，少数来自山东、河北和江苏等地，另有一个引自日本的品种——胜利百号。经聚类分析发现，我国福建地方品种乌骨仔与菲律宾引进品种DaJa的遗传距离仅为0.0333，另外，台农63与来自菲律宾的Kccane也聚在一起，遗传距离只有0.1147。
2. 3 遗传距离分析结果
ISSR数据经DPS 7.05分析发现野生种与地方品种、引进品种和育成品种间的平均遗传距离分别为0.4688、0.4618和0.4643（表3），其中，野生种与我国地方品种间的平均遗传距离最大，与引进品种间的平均遗传距离最小。此外，引进品种与地方品种间的平均遗传距离为0.2024，育成品种与地方品种间的平均遗传距离为0.1978，引进品种与育成品种间的平均遗传距离为0.1673，说明我国地方品种在品种选育过程中应用的频率和范围较小，而引进品种在育种亲本选择时占比相对较高，因此导致地方品种与育成品种间的亲缘关系较远、遗传距离较大。可见，地方品种在我国甘薯育种中还具有很大的应用潜力。
通过对不同来源地甘薯种质的平均遗传距离进行比较分析，结果（表4）发现不同地区间的甘薯种质平均遗传距离差异较大，其中，中国大陆品种与尼日利亚品种的平均遗传距离最远（0.2127），而与中国台湾品种的平均遗传距离最近（0.1357），与菲律宾品种和日本品种间的平均遗传距离分别为0.1989和0.1905，与美国、秘鲁和巴西等美洲品种间的平均遗传距离也相对较低（0.1529～0.1794）。可见，中国大陆的甘薯种质与非洲种质差异较大，存在亲本选择利用的潜力，其次是菲律宾和日本的甘薯种质也具有一定的杂交利用潜力。此外，中国大陆品种间的平均遗传距离在0.0492～0.4583，变幅最大，说明我国的甘薯种质利用潜力十分巨大，特别是地方品种与育成品种间应充分发掘利用，加大亲本选择力度，创制优势杂交组合，选择优势后代。
3 讨论
ISSR分子标记在引物设计上较SSR分子标记更简单，不需要知道DNA序列即可使用引物进行扩增，且能揭示比RFLP、RAPD和SSR分子标记更丰富的多态性，现已广泛应用于遗传作图、基因定位、遗传多样性及系统发育等研究领域（王建波，2002;赵谦等，2007;李强等，2008）。本研究采用ISSR分子标记开展甘薯种质资源遗传多样性分析，结果发现124份栽培种的平均遗传距离为0.1805（最大为0.4583，最小为0.0492），即育成品种间的遗传距离较近，说明我国甘薯育成品种间遗传基础狭窄，与前人的研究结果（贺学勤等，2005;李强等，2009;赵冬兰等，2015）一致。此外，本研究中的甘薯品种红姑娘与东兴红姑娘间的遗传距离为0.2364，虽然名字相近但遗传距离较远，与本课题组前期基于SRAP分子标记的分析结果（刘中华等，2018）一致。与SRAP分子标记分析的甘薯遗传多样性相比，基于ISSR分子标记的遗传距离变幅更大，更适合用于甘薯遗传多样性分析。在本研究的129份甘薯种质材料中，二倍体野生种I. quamoclit与育成品种杭香1号间的遗传距离最大，达0.6327，表明甘薯野生种与栽培种间存在较大差异，也说明ISSR分子标记是评价甘薯遗传多样性的有效途径之一，且检测效率高。 本研究发现甘薯野生种与栽培种间存在着丰富的遗传多样性，因此可利用野生种中的某些优异基因对栽培种加以改良利用（曹清河等，2009）。在栽培种内，引进品种、地方品种和育成品种间的遗传距离与其来源地关系不明显，主要影响因素是其血缘关系和遗传背景，与前人的研究结果（赵冬兰等，2015;罗凯等，2016;邓吉良等，2018）一致。不同类型、不同来源地的甘薯种质遗传距离差异也不同。本研究结果表明，相对于引进品种和育成品种，地方品种的遗传多样性更丰富，具体表现为中国大陆品种与来自非洲尼日利亚及亚洲菲律宾和日本的品种遗传距离差异较大，而与我国台湾地区的种质遗传距离最小;聚类分析结果表明，124份甘薯栽培种可划分为6个类别，其中，新种花、福菜薯18号和黄皮9号3个品种各自单独组成一个类群，分别为第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ类;金山57、豫薯8号和瑞薯1号组成第Ⅲ类;第Ⅳ类包含93个地方品种和育成品种;第Ⅵ类由25个地方品种和育成品种组成。其中，菲律宾品种DaJa和Kccane分别与我国地方品种乌骨仔和台农63聚在一起，遗传距离较近，分别为0.0333和0.1147，推测与我国甘薯經水路由菲律宾引入我国东南地区这一传入途径有关（邵侃和卜凤贤，2007）。此外，我国地方品种与育成品种间的亲缘关系远、遗传距离大，而引进品种与我国育成品种间距离较小，说明地方品种资源在我国甘薯育种亲本选择利用方面还具有很大的应用潜力。
4 结论
不同类型和不同来源地的甘薯种质资源间存在较大遗传差异，以野生种与栽培种间的遗传差异最大，而栽培种间又以地方品种和引进品种间差异较大，即地方品种资源在我国甘薯育种亲本选择利用方面还具有很大的应用潜力。ISSR分子标记是一种适用于甘薯资源遗传多样性分析的理想分子标记。
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（责任编辑 兰宗宝）
关键词： 甘薯;种质资源;ISSR分子标记;遗传多样性;聚类分析
中图分类号： S531.024 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2392-09
Genetic diversity analysis of sweetpotato [Ipomoea batatas（L.） Lam.] by ISSR molecular markers
LIU Zhong-hua， LIN Zhi-jian， LI Hua-wei， XU Yong-qing， LI Guo-liang，
QIU Yong-xiang， QIU Si-xin*， TANG Hao*
（Crops Research Institute， Fujian Academy of Agriculture Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Tuber and Root Crops in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs ， Fuzhou 350013， China）
Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for analysis of the domestication pathways， classification and identification， effective utilization and selection of hybrid parents of sweet potato germplasm， the ISSR molecular markers were used to analyze the genetic diversity of different types of sweet potato. 【Method】ISSR primers with rich polymorphism， clear amplified bands and good repeatability were screened out from 100 primers. The DNA of 129 sweet potato accessions were amplified by the selected ISSR primers， and amplified bands were analyzed. The genetic distances among various varieties were calculated using DPS 7.05， and the cluster analysis was performed using the un-weighted pair-group arithmetical mean method（UPGMA）. 【Result】The results showed that∶232 bands were amplified by 20 polymorphic ISSR primers selected from 100， of which 230 were polymorphic bands， with a polymorphic ratio of 99.14%， and the average bands amplified by each primer were 11.60. The average genetic distance of five wild species based on ISSR marker was 0.4637， which among 124 sweet potato cultivars was 0.1805. The average genetic distance between wild varieties and local varieties， between wild varieties and introduced varieties and wild varieties and bred varieties were 0.4688， 0.4618 and 0.4643. Among all 124 cultivars， the average genetic distance between local accessions and the introduced varieties was the largest（0.2024）， while which between the introduced varieties and the bred varieties was the smallest（0.1673）. The average genetic distance between local accessions and bred cultivars was 0.1978. The results of cluster analysis showed that wild species were completely distinguished from cultivars when the genetic distance was 0.3200. Furthermore， five wild species were divided into four categories at this level， while 124 cultivars were divided into 6 categories at the level of 0.2000. Among them， Xinzhonghua， Fucaishu No.18 and Huangpi No.9 were in three single groups（Categories I， II， and V） separately， and Jinshan 57， Yushu No.8 and Ruishu No.1 were classified in group III. Meanwhile， Group IV contained 93 local accessions and bred cultivars， and group VI consisted of 25 local accessions and bred cultivars. 【Conclusion】There are wide genetic differences between different types and different sources of sweet potato germplasm. The genetic difference between wild species and cultivars is the largest. Among cultivars， the differences between local accessions and introduced cultivars are larger than others. That means local accessions have great application potential for the selection and utilization of breeding parents of sweet potato in China. ISSR molecular marker is an ideal molecular marker suitable for analysis of genetic diversity of sweet potato germplasm. Key words： sweet potato; germplasm resources; ISSR molecular marker; genetic diversity; cluster analysis
0 引言
【研究意义】甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是世界上重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源作物，也是世界七大作物之一，我国甘薯产量占世界总产量的67.3%（苏一钧等，2018）。甘薯在我国已有400多年的种植历史，且地方品种层出不穷（范泽民，2015）。虽然我国甘薯育种已取得长足进展，处于世界先进水平（张立明等，2003;马代夫等，2005），但甘薯育种的种间遗传背景狭窄（贺学勤等，2005），其亲本集中在少数品种之间，非常不利于甘薯品种的遗传改良（吴觐宇等，2009）。因此，利用分子标记技术开展甘薯种质的遗传多样性分析，明确各类种质间的遗传背景、加强亲本选配等，对推进甘薯育种具有重要意义。【前人研究进展】ISSR分子标记兼具RAPD和SSR分子标记的优点，现已广泛应用于生物品种鉴定（Culley and Wolfe，2001;赵谦等，2007）、遗传图谱构建（易克等，2003）、基因定位（李冬梅，2016）及遗传多样性分析（朱岩芳等，2010;张盾等，2018;闫林等，2019）等领域。贺学勤等（2005）利用RAPD、ISSR和AFLP分子标记对系谱关系明确的7个甘薯品种进行亲缘关系分析，结果发现基于ISSR分子标记得到的聚类图与系谱图最吻合，因此认为ISSR分子标记更适于分析甘薯品种的亲缘关系。郝玉民等（2007）利用SRAP分子标记对36份甘薯品种进行DNA多态性分析，结果表明所选材料间具有较高的遗传相似度。吴洁等（2007）利用SRAP分子标记对四川省86份甘薯品种亲缘关系进行分析，结果证实四川省育成的甘薯品种资源遗传范围较狭窄。李强等（2008，2009）利用ISSR和AFLP分子标记分析我国62份甘薯主要亲本和26份主要育成品種的遗传多样性以明确其遗传差异，结果显示我国甘薯育成品种遗传基础狭窄的局面尚未得到改观。陈新起等（2009）利用ISSR分子标记分析10个菜用甘薯材料的遗传多样性和亲缘关系，结果显示菜用甘薯材料的遗传差异较明显。吴觐宇等（2009）对25份美国甘薯品系及我国47份甘薯种质资源进行ISSR多态性分析，结果表明美国甘薯育种材料遗传多样性较高，可将其应用到国内甘薯育种中以扩大遗传背景。宋吉轩等（2011，2017）利用ISSR分子标记分析贵州甘薯地方品种资源和紫心甘薯种质的遗传多样性，结果发现23份贵州紫心甘薯种质资源间的亲缘关系较近。季志仙等（2014）选用6个ISSR分子标记对l7份甘薯品种进行DNA指纹扩增，结果表明甘薯主要食用品种间具有较好的遗传多样性，但同类型品种间又具有较高的遗传相似性，即这类品种需要引进或创制新资源。赵冬兰等（2015）利用形态农艺性状标记对来自17个省份的176份我国甘薯地方种质资源进行遗传多样性分析，结果发现形态标记并未按照这些地方种质的来源地进行聚类。刘中华等（2018）采用SRAP分子标记对129份甘薯种质进行遗传多样性和起源演化分析，结果证实SRAP分子标记可有效应用于甘薯遗传多样性及其起源与演化分析。【本研究切入点】至今，鲜见利用ISSR分子标记同时对野生资源、地方品种、引进品种和育成品种等4类甘薯种质开展遗传多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】利用ISSR分子标记分析129份不同类型甘薯种质的遗传多样性，以期为甘薯种质资源的传播途径分析、分类鉴定、有效利用及杂交亲本选择等提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料包含野生种、地方品种、引进品种和育成品种等4类129种甘薯种质（表1），均种植于福建省农业科学院作物所薯类作物种质资源圃内。ISSR引物、琼脂糖和40%丙烯酰胺溶液购自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司;DL2000 DNA Marker购自贵州弥勒天根生物科技有限公司。主要仪器设备：垂直电泳槽（DYCZ-24A，北京六一有限公司）、移液器（Eppendorf，德国）、Veriti 96well PCR仪（ABI，美国）、离心机（Eppendorf，德国）、-80 ℃超低温冰箱（SANYO，日本）、水平电泳槽（DYCZ-22A，北京六一有限公司）和Nanodrop2000C超微量分光光度计（Thermo，美国）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 甘薯基因组DNA提取 采用改进后的甘薯基因组DNA高效快速提取方法（李强等，2007）提取甘薯鲜幼嫩叶片总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并以Nanodrop2000C超微量分光光度计测定DNA浓度，-20 ℃保存备用。
1. 2. 2 ISSR引物筛选 利用8份材料的基因组DNA从100条ISSR引物中筛选出重复性好、条带清晰、多态性丰富，且扩增条带（100～1000 bp）数目较多（不少于5条）的引物进行正式扩增。
1. 2. 3 PCR扩增 PCR反应体系20.0 μL：ISSR引物2.0 μL，DNA模板2.0 μL，PCR SuperMix（含DNA Polymerase和dNTPs的反应缓冲液）10.0 μL，蒸馏水6.0 μL。扩增程序参照宋吉轩等（2009，2010）的方法，即95 ℃预变性5 min;95 ℃ 45 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行41个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物以8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压130 V，功率4 W，时间90 min）进行分离检测后，采用银染法（固定→银染→显色）进行染色，最后观察并拍照。
1. 3 统计分析 应用DPS 7.05对扩增条带的有无进行计数，当某一扩增条带出现时赋值为“1”，不存在时赋值为“0”，从而将图形资料转换成数据资料，计算不同种质间的遗传距离（Genetic distance，GD），然后采用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。
GD=-ln[2Nij/（Ni+Nj）]
式中，Ni表示种质i的条带数目，Nj表示种质j的条带数目，Nij表示种质i和种质j共有的条带数目。
2 结果与分析
2. 1 ISSR引物筛选及扩增结果
利用8份材料的基因组DNA分别对100条ISSR引物进行多态性筛选，结果筛选出20条多态性好、扩增条带清晰且重复性好的ISSR引物（表2和图1）;利用筛选获得的20条ISSR引物对129份甘薯种质材料进行扩增，共获得232条条带，其中多态性条带230条，多态性条带比例达99.14%，平均每条ISSR引物扩增出11.60条条带。引物UBC811的多态性最高，能扩增出16条条带（图2）。
2. 2 聚类分析结果
基于ISSR分子標记的5份野生种平均遗传距离为0.4637，124份甘薯栽培种平均遗传距离为0.1805。其中，84份育成品种的平均遗传距离为0.1670，28份地方品种的平均遗传距离为0.1968;12份引进品种的平均遗传距离为0.1791。由图3可看出，当遗传距离按0.3200（线L1）划分时，能将5份野生种与124份栽培种完全区分开;5份野生种在遗传距离为0.3200时又被划分为4个类别：来自澳大利亚的二倍体I. quamoclit单独归为一类;来自委内瑞拉的二倍体材料I. trifida和来自多米尼加的二倍体材料I. triloba归为一类;来自巴西的二倍体材料I. setosa和来自巴拉圭的二倍体材料I. nil分别归为一类。124份甘薯栽培种在遗传距离为0.2000（线L2）时可划分为2个大类、4个小类共计6个类别，其中，新种花、福菜薯18号和黄皮9号3个品种各自单独组成一个类群，分别为第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ类;金山57、豫薯8号和瑞薯1号组成第Ⅲ类;第Ⅳ类包含93个地方品种和育成品种;第Ⅵ类由25个地方品种和育成品种组成。
124份栽培种中，新种花在自然条件下极难开花，难以有效地与其他品种进行传粉、结实并形成后代，其单独聚为一类为第Ⅰ类，与其他品种的遗传距离较远;第Ⅱ类的福菜薯18号是一个叶菜专用型品种，其亲本材料以福建和台湾的叶菜型品种为主;金山57、豫薯8号和瑞薯1号3个品种组成第Ⅲ类，发现这3个品种中均具有来自广东甘薯品种的遗传背景;湘薯75-55、济薯20和岩高糖等93个品种组成第Ⅳ类，其几乎涵盖了大部分来源的甘薯品种，日本、美国和菲律宾等地区的引入品种均聚类在此类中，其中，来自菲律宾的2个品种DaJa和Kccane分别与我国福建和台湾地区的品种乌骨仔和台农63聚在一起;黄皮9号单独聚为一类（第Ⅴ类）;广薯87、徐28、徐紫薯2号等25个品种聚在一类（第Ⅵ类），此类甘薯主要为来源于福建、广东的地方品种和育成品种，少数来自山东、河北和江苏等地，另有一个引自日本的品种——胜利百号。经聚类分析发现，我国福建地方品种乌骨仔与菲律宾引进品种DaJa的遗传距离仅为0.0333，另外，台农63与来自菲律宾的Kccane也聚在一起，遗传距离只有0.1147。
2. 3 遗传距离分析结果
ISSR数据经DPS 7.05分析发现野生种与地方品种、引进品种和育成品种间的平均遗传距离分别为0.4688、0.4618和0.4643（表3），其中，野生种与我国地方品种间的平均遗传距离最大，与引进品种间的平均遗传距离最小。此外，引进品种与地方品种间的平均遗传距离为0.2024，育成品种与地方品种间的平均遗传距离为0.1978，引进品种与育成品种间的平均遗传距离为0.1673，说明我国地方品种在品种选育过程中应用的频率和范围较小，而引进品种在育种亲本选择时占比相对较高，因此导致地方品种与育成品种间的亲缘关系较远、遗传距离较大。可见，地方品种在我国甘薯育种中还具有很大的应用潜力。
通过对不同来源地甘薯种质的平均遗传距离进行比较分析，结果（表4）发现不同地区间的甘薯种质平均遗传距离差异较大，其中，中国大陆品种与尼日利亚品种的平均遗传距离最远（0.2127），而与中国台湾品种的平均遗传距离最近（0.1357），与菲律宾品种和日本品种间的平均遗传距离分别为0.1989和0.1905，与美国、秘鲁和巴西等美洲品种间的平均遗传距离也相对较低（0.1529～0.1794）。可见，中国大陆的甘薯种质与非洲种质差异较大，存在亲本选择利用的潜力，其次是菲律宾和日本的甘薯种质也具有一定的杂交利用潜力。此外，中国大陆品种间的平均遗传距离在0.0492～0.4583，变幅最大，说明我国的甘薯种质利用潜力十分巨大，特别是地方品种与育成品种间应充分发掘利用，加大亲本选择力度，创制优势杂交组合，选择优势后代。
3 讨论
ISSR分子标记在引物设计上较SSR分子标记更简单，不需要知道DNA序列即可使用引物进行扩增，且能揭示比RFLP、RAPD和SSR分子标记更丰富的多态性，现已广泛应用于遗传作图、基因定位、遗传多样性及系统发育等研究领域（王建波，2002;赵谦等，2007;李强等，2008）。本研究采用ISSR分子标记开展甘薯种质资源遗传多样性分析，结果发现124份栽培种的平均遗传距离为0.1805（最大为0.4583，最小为0.0492），即育成品种间的遗传距离较近，说明我国甘薯育成品种间遗传基础狭窄，与前人的研究结果（贺学勤等，2005;李强等，2009;赵冬兰等，2015）一致。此外，本研究中的甘薯品种红姑娘与东兴红姑娘间的遗传距离为0.2364，虽然名字相近但遗传距离较远，与本课题组前期基于SRAP分子标记的分析结果（刘中华等，2018）一致。与SRAP分子标记分析的甘薯遗传多样性相比，基于ISSR分子标记的遗传距离变幅更大，更适合用于甘薯遗传多样性分析。在本研究的129份甘薯种质材料中，二倍体野生种I. quamoclit与育成品种杭香1号间的遗传距离最大，达0.6327，表明甘薯野生种与栽培种间存在较大差异，也说明ISSR分子标记是评价甘薯遗传多样性的有效途径之一，且检测效率高。 本研究发现甘薯野生种与栽培种间存在着丰富的遗传多样性，因此可利用野生种中的某些优异基因对栽培种加以改良利用（曹清河等，2009）。在栽培种内，引进品种、地方品种和育成品种间的遗传距离与其来源地关系不明显，主要影响因素是其血缘关系和遗传背景，与前人的研究结果（赵冬兰等，2015;罗凯等，2016;邓吉良等，2018）一致。不同类型、不同来源地的甘薯种质遗传距离差异也不同。本研究结果表明，相对于引进品种和育成品种，地方品种的遗传多样性更丰富，具体表现为中国大陆品种与来自非洲尼日利亚及亚洲菲律宾和日本的品种遗传距离差异较大，而与我国台湾地区的种质遗传距离最小;聚类分析结果表明，124份甘薯栽培种可划分为6个类别，其中，新种花、福菜薯18号和黄皮9号3个品种各自单独组成一个类群，分别为第Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ类;金山57、豫薯8号和瑞薯1号组成第Ⅲ类;第Ⅳ类包含93个地方品种和育成品种;第Ⅵ类由25个地方品种和育成品种组成。其中，菲律宾品种DaJa和Kccane分别与我国地方品种乌骨仔和台农63聚在一起，遗传距离较近，分别为0.0333和0.1147，推测与我国甘薯經水路由菲律宾引入我国东南地区这一传入途径有关（邵侃和卜凤贤，2007）。此外，我国地方品种与育成品种间的亲缘关系远、遗传距离大，而引进品种与我国育成品种间距离较小，说明地方品种资源在我国甘薯育种亲本选择利用方面还具有很大的应用潜力。
4 结论
不同类型和不同来源地的甘薯种质资源间存在较大遗传差异，以野生种与栽培种间的遗传差异最大，而栽培种间又以地方品种和引进品种间差异较大，即地方品种资源在我国甘薯育种亲本选择利用方面还具有很大的应用潜力。ISSR分子标记是一种适用于甘薯资源遗传多样性分析的理想分子标记。
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（责任编辑 兰宗宝）