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摘要[目的]建立水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星3种氟喹诺酮类药物残留测定的超高效液相色谱法。[方法]以0.10%甲酸-乙腈为提取溶剂，提取液经浓缩，正己烷净化去脂，采用超高效液相色谱-荧光检测器检测3种氟喹诺酮类药物，外标法定量。[结果]该方法的相对标准偏差为1.4%～8.1%，回收率为82%～106%，3种氟喹诺酮类药物在0.01～1.00 μg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.995，方法检出限为5.00 μg/kg。[结论]该检测方法准确、快捷、高效，可广泛应用于水产品中氟喹诺酮类药物残留的检测。
关键词 超高效液相色谱；水产品；氟喹诺酮类
中图分类号 S912 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）28-0092-02
Abstract[Objective]An ultra performance liquid chromatography method was developed for the simultaneous determination of 3 quinolone antibiotics in norfloxacin， ciproxacin， enrofloxacin. [Method]The method with 0.10% formic acid and acetonitrile as extraction solvent， the extract was concentrated and degreased by hexane， 3 kinds of quinolones antibiotics were detected by ultraliquid chromatographic with fluorescence detector， and were quantified using external standard method. [Result]The relative standard deviations（RSD） were 1.4%-8.1%； recoveries were 82%-106%； a variety of quinolone antibiotics showed good linearity in the concentration range of 0.01-1.00 μg/mL， correlation coefficients were greater than 0.995； detection limits were 5.00 μg/kg. [Conclusion]The detection method is accurate， fast and efficient， and can be widely used in the daily detection of quinolone antibiotics in aquatic products.
Key words Ultra performance liquid chromatography； Aquatic products； Quinolone antibiotics
氟喹诺酮类药物属于合成抗生素类物质。我国农业部颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部2002年235号公告）[1]中规定了水产品中氟喹诺酮类药物的最高残留限量。水产品养殖户可能会通过添加氟喹诺酮类药物来提高水产品的存活率，这易导致水产品对抗生素产生耐药性，从而影响后续治疗效果；如果含有抗生素类的食品在市场上销售流通，消费者长期食用后，会对抗生素产生一定的耐药性。从相关文献报道来看，有关氟喹诺酮类药物的检测方法主要集中在环境和食品方面 [2-4]，检测使用的仪器方法主要为液相色谱法[5-7]和液相色谱-质谱联用法[8-12]。液相色谱能检测的氟喹诺酮类药物种类有限，而且分析时间长，普遍都需要30 min以上，检测效率低下，试剂流动相消耗较多，不符合高通量、绿色化学检测要求；而液相色谱-质谱联用法因为仪器成本较高，难以推广使用，并且准确定量能力较弱，这些因素在一定程度上制约了液相色谱-质谱联用法在分析测定氟喹诺酮类药物的应用。
笔者建立了一种超高效液相法测定水产品中3种氟喹诺酮类药物的检测方法，研究并优化了水产品中3种氟喹诺酮类药物的前处理方法和仪器分离条件，以期为市售水产品中氟喹诺酮类药物的准确、快捷、高效检测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 供试水产品：鲫鱼、鲤鱼、大黄鱼、鲳鱼、对虾，市售。
主要仪器：超高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；高速离心机，德国Hettich公司；旋涡振荡器，德国IKA公司；0.22 μm滤膜，上海安谱；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。
主要试剂：诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星，国家标准物质中心；甲酸（纯度99%）；乙腈（色谱纯），德国Merck公司；娃哈哈超纯水。
1.2 方法
1.2.1 样品提取与净化 。
称取5.00 g（精确到 0.01 g）去鳞、腮、内脏后绞碎的水产品样品，置于50 mL 离心管中，加入15.0 g无水硫酸钠，用15 mL 酸化乙腈（1%甲酸）旋涡充分混合振荡2 min，6 000 r/min 离心5 min，倒出上清液。残渣重复提取 1 次，合并上清液，混匀，备用。提取液经40 ℃以下水浴旋转蒸发至近干，准确加入初始流动相2 mL，超声振荡溶解残渣，加入5 mL正己烷旋涡充分振荡，6 000 r/min离心 5 min，吸取下层液，过0.22 μm微孔滤膜，备用。
1.2.2 仪器条件。
色谱柱为ACQUITY UPLCTMBEH C18 柱（2.1 μm×150.0 mm×1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈（87.5∶12.5，V/V），等度洗脱，流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，样品室温度4 ℃，进样量10 μL，激发波长280 nm，发射波长450 nm。 2 结果与分析
2.1 流动相条件
氟喹诺酮类药物属于酸碱两性化合物，因其化学结构中含有羧基和哌嗪基，酸性的流动相对氟喹诺酮类药物的响应和峰型都具有较为明显的影响。该试验在流动相的水相中加入甲酸来控制pH，达到了较为理想的分离度和响应值。0.1%、0.5%、1.0%甲酸水溶液对氟喹诺酮类药物在色谱柱上响应值的影响结果见图1。通过图1得出，0.1%甲酸水溶液作为水相时各组分峰型和响应值都较好，符合检测要求。
由于各类氟喹诺酮类药物的化学结构较为相近，在色谱柱上的保留时间较为接近或者重叠，故对其色谱分离带来了一定的影响。该试验通过优化0.1%甲酸水溶液和乙腈的不同比例来达到较好的分离度，比较了0.1%甲酸水溶液和乙腈在80.0∶20.0、90.0∶10.0和87.5∶12.5（V/V）几种不同比例条件下的色谱图，见图2。当流动相甲酸水溶液-乙腈比例为87.5∶12.5时，各组分出峰时间较为合适，峰型较好，符合检测要求。
2.2 提取溶剂的选择
氟喹诺酮类药物具有酸碱两性，对于酸性或者碱性溶液具有较好的溶解性。当使用纯溶剂乙腈提取，容易造成水产品中蛋白质沉淀，影响提取效率。
如果使用磷酸盐提取，提取液较为浑浊，杂质较多，离心后无法澄清，净化比较困难，影响回收率，降低了检测效率。该试验采用1%甲酸酸化的乙腈溶液对水产品进行提取，使得水产品中肌肉水解，增加氟喹诺酮类药物在酸化乙腈中的溶解度，提取液含水量少，容易被水浴旋转蒸干，提高了检测效率与回收率。
2.3 样品定容溶剂的选择
氟喹诺酮类药物在色谱柱中的分离度及峰型与初始溶剂有关，当样品定容溶液中有机相（乙腈）比例高于色谱系统初始流动相比例的3倍时，较早出峰的氟喹诺酮类药物容易造成前拖尾，故该试验采用初始流动相来溶解旋蒸完之后的残渣，消除溶剂的干扰。
2.4 线性关系、检出限、回收率和精密度
分别配制3种氟喹诺酮类药物浓度为0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL溶液，在“1.2.2”色谱条件下进行测定，标准溶液色谱图见图3。以峰面积为y值，标准溶液各浓度为x值绘制曲线。线性方程、相关系数和检出限（S/N=3）见表1。
选取不含有氟喹诺酮类药物的水产品（对虾），分别添加混合标准溶液，每个样品做6次平行，按照“1.2.1”和“1.2.2”进行样品前处理和色谱测定，计算回收率与精密度，结果见表1，空白样品加标色谱图和空白样品色谱图见图4。由表1可见，对虾中添加混合标准溶液浓度为10.0 μg/kg时，平均回收率为82.0%～103.2%，RSD为3.1%～8.0%；添加浓度为25.0 μg/kg时，平均回收率为87.5%～106.0%，RSD为2.4%～6.2%。
3 结论与讨论
水产品中含有各种蛋白质与脂肪，成分复杂，在进行氟喹诺酮类药物检测时容易被干扰。该试验通过对提取溶剂、流动相及定容溶剂的选取与优化，成功建立了超高效液相色谱法测定水产品中氟喹诺酮类药物残留，该方法样品的前处理操作简便、溶剂用量少、仪器分析时间短，极大地提高了工作效率，且灵敏度和精密度可以满足实际样品检测需要，尤其适合大批量样品操作，适用于水产品中氟喹诺酮类残留含量的测定，可进一步推广应用。
参考文献
[1]动物性食品中兽药最高残留限量：农业部235号公告[A].北京：中华人民共和国农业部，2002.
[2]李振华，魏东，张乃生.氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展[J].动物医学进展，2007，28（3）：98-101.
[3]王蕊，廖晓萍，刘雅红.氟喹诺酮类兽药残留检测方法研究进展[J].广东农业科学，2010（10）：41-43.
[4]李星如，毕凤兰.浅析氟喹诺酮类药物的安全性现状[J].中国药物警戒，2013，10（1）：44-46.
[5]陈辉华，戴军，王洪新，等.HPLC法对鱼肉中3种四环素类和5种氟喹诺酮类兽药残留的同时测定[J].分析测试学报，2008，27（9）：951-955.
[6]刘媛，谢孟峡，丁岚，等.高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留[J].分析化学，2004，32（3）：352-355.
[7]郑艳明，郭新东，冼燕萍，等.化妆品中7种氟喹诺酮类药物的反相高效液相色谱法测定[J].分析测试学报，2009，28（2）：235-238.
[8]马丽丽，郭昌胜，胡伟，等.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮、四环素和磺胺类抗生素[J].分析化学，2010，38（1）：21-26.
[9]刘芃岩，申杰，刘磊.复合模板印迹聚合物净化液相色谱-质谱联用法测定鱼肉中氟喹诺酮类残留[J].分析化学，2012，40（5）：693-698.
[10]高馥蝶，赵妍，邵兵，等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查牛奶中的农药和兽药残留[J].色谱，2012，30（6）：560-567.
[11]李丽莉，罗轶，何颂华，等.高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中8种喹诺酮类药物的残留量[J].中国食品卫生杂志，2012，24（1）：37-40.
[12]孙良娟，李红权，刘益锋，等.高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中14种喹诺酮类与磺胺类药物残留[J].化学试剂，2012，34（7）：633-636.
关键词 超高效液相色谱；水产品；氟喹诺酮类
中图分类号 S912 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）28-0092-02
Abstract[Objective]An ultra performance liquid chromatography method was developed for the simultaneous determination of 3 quinolone antibiotics in norfloxacin， ciproxacin， enrofloxacin. [Method]The method with 0.10% formic acid and acetonitrile as extraction solvent， the extract was concentrated and degreased by hexane， 3 kinds of quinolones antibiotics were detected by ultraliquid chromatographic with fluorescence detector， and were quantified using external standard method. [Result]The relative standard deviations（RSD） were 1.4%-8.1%； recoveries were 82%-106%； a variety of quinolone antibiotics showed good linearity in the concentration range of 0.01-1.00 μg/mL， correlation coefficients were greater than 0.995； detection limits were 5.00 μg/kg. [Conclusion]The detection method is accurate， fast and efficient， and can be widely used in the daily detection of quinolone antibiotics in aquatic products.
Key words Ultra performance liquid chromatography； Aquatic products； Quinolone antibiotics
氟喹诺酮类药物属于合成抗生素类物质。我国农业部颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部2002年235号公告）[1]中规定了水产品中氟喹诺酮类药物的最高残留限量。水产品养殖户可能会通过添加氟喹诺酮类药物来提高水产品的存活率，这易导致水产品对抗生素产生耐药性，从而影响后续治疗效果；如果含有抗生素类的食品在市场上销售流通，消费者长期食用后，会对抗生素产生一定的耐药性。从相关文献报道来看，有关氟喹诺酮类药物的检测方法主要集中在环境和食品方面 [2-4]，检测使用的仪器方法主要为液相色谱法[5-7]和液相色谱-质谱联用法[8-12]。液相色谱能检测的氟喹诺酮类药物种类有限，而且分析时间长，普遍都需要30 min以上，检测效率低下，试剂流动相消耗较多，不符合高通量、绿色化学检测要求；而液相色谱-质谱联用法因为仪器成本较高，难以推广使用，并且准确定量能力较弱，这些因素在一定程度上制约了液相色谱-质谱联用法在分析测定氟喹诺酮类药物的应用。
笔者建立了一种超高效液相法测定水产品中3种氟喹诺酮类药物的检测方法，研究并优化了水产品中3种氟喹诺酮类药物的前处理方法和仪器分离条件，以期为市售水产品中氟喹诺酮类药物的准确、快捷、高效检测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 供试水产品：鲫鱼、鲤鱼、大黄鱼、鲳鱼、对虾，市售。
主要仪器：超高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；高速离心机，德国Hettich公司；旋涡振荡器，德国IKA公司；0.22 μm滤膜，上海安谱；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。
主要试剂：诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星，国家标准物质中心；甲酸（纯度99%）；乙腈（色谱纯），德国Merck公司；娃哈哈超纯水。
1.2 方法
1.2.1 样品提取与净化 。
称取5.00 g（精确到 0.01 g）去鳞、腮、内脏后绞碎的水产品样品，置于50 mL 离心管中，加入15.0 g无水硫酸钠，用15 mL 酸化乙腈（1%甲酸）旋涡充分混合振荡2 min，6 000 r/min 离心5 min，倒出上清液。残渣重复提取 1 次，合并上清液，混匀，备用。提取液经40 ℃以下水浴旋转蒸发至近干，准确加入初始流动相2 mL，超声振荡溶解残渣，加入5 mL正己烷旋涡充分振荡，6 000 r/min离心 5 min，吸取下层液，过0.22 μm微孔滤膜，备用。
1.2.2 仪器条件。
色谱柱为ACQUITY UPLCTMBEH C18 柱（2.1 μm×150.0 mm×1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈（87.5∶12.5，V/V），等度洗脱，流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，样品室温度4 ℃，进样量10 μL，激发波长280 nm，发射波长450 nm。 2 结果与分析
2.1 流动相条件
氟喹诺酮类药物属于酸碱两性化合物，因其化学结构中含有羧基和哌嗪基，酸性的流动相对氟喹诺酮类药物的响应和峰型都具有较为明显的影响。该试验在流动相的水相中加入甲酸来控制pH，达到了较为理想的分离度和响应值。0.1%、0.5%、1.0%甲酸水溶液对氟喹诺酮类药物在色谱柱上响应值的影响结果见图1。通过图1得出，0.1%甲酸水溶液作为水相时各组分峰型和响应值都较好，符合检测要求。
由于各类氟喹诺酮类药物的化学结构较为相近，在色谱柱上的保留时间较为接近或者重叠，故对其色谱分离带来了一定的影响。该试验通过优化0.1%甲酸水溶液和乙腈的不同比例来达到较好的分离度，比较了0.1%甲酸水溶液和乙腈在80.0∶20.0、90.0∶10.0和87.5∶12.5（V/V）几种不同比例条件下的色谱图，见图2。当流动相甲酸水溶液-乙腈比例为87.5∶12.5时，各组分出峰时间较为合适，峰型较好，符合检测要求。
2.2 提取溶剂的选择
氟喹诺酮类药物具有酸碱两性，对于酸性或者碱性溶液具有较好的溶解性。当使用纯溶剂乙腈提取，容易造成水产品中蛋白质沉淀，影响提取效率。
如果使用磷酸盐提取，提取液较为浑浊，杂质较多，离心后无法澄清，净化比较困难，影响回收率，降低了检测效率。该试验采用1%甲酸酸化的乙腈溶液对水产品进行提取，使得水产品中肌肉水解，增加氟喹诺酮类药物在酸化乙腈中的溶解度，提取液含水量少，容易被水浴旋转蒸干，提高了检测效率与回收率。
2.3 样品定容溶剂的选择
氟喹诺酮类药物在色谱柱中的分离度及峰型与初始溶剂有关，当样品定容溶液中有机相（乙腈）比例高于色谱系统初始流动相比例的3倍时，较早出峰的氟喹诺酮类药物容易造成前拖尾，故该试验采用初始流动相来溶解旋蒸完之后的残渣，消除溶剂的干扰。
2.4 线性关系、检出限、回收率和精密度
分别配制3种氟喹诺酮类药物浓度为0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL溶液，在“1.2.2”色谱条件下进行测定，标准溶液色谱图见图3。以峰面积为y值，标准溶液各浓度为x值绘制曲线。线性方程、相关系数和检出限（S/N=3）见表1。
选取不含有氟喹诺酮类药物的水产品（对虾），分别添加混合标准溶液，每个样品做6次平行，按照“1.2.1”和“1.2.2”进行样品前处理和色谱测定，计算回收率与精密度，结果见表1，空白样品加标色谱图和空白样品色谱图见图4。由表1可见，对虾中添加混合标准溶液浓度为10.0 μg/kg时，平均回收率为82.0%～103.2%，RSD为3.1%～8.0%；添加浓度为25.0 μg/kg时，平均回收率为87.5%～106.0%，RSD为2.4%～6.2%。
3 结论与讨论
水产品中含有各种蛋白质与脂肪，成分复杂，在进行氟喹诺酮类药物检测时容易被干扰。该试验通过对提取溶剂、流动相及定容溶剂的选取与优化，成功建立了超高效液相色谱法测定水产品中氟喹诺酮类药物残留，该方法样品的前处理操作简便、溶剂用量少、仪器分析时间短，极大地提高了工作效率，且灵敏度和精密度可以满足实际样品检测需要，尤其适合大批量样品操作，适用于水产品中氟喹诺酮类残留含量的测定，可进一步推广应用。
参考文献
[1]动物性食品中兽药最高残留限量：农业部235号公告[A].北京：中华人民共和国农业部，2002.
[2]李振华，魏东，张乃生.氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展[J].动物医学进展，2007，28（3）：98-101.
[3]王蕊，廖晓萍，刘雅红.氟喹诺酮类兽药残留检测方法研究进展[J].广东农业科学，2010（10）：41-43.
[4]李星如，毕凤兰.浅析氟喹诺酮类药物的安全性现状[J].中国药物警戒，2013，10（1）：44-46.
[5]陈辉华，戴军，王洪新，等.HPLC法对鱼肉中3种四环素类和5种氟喹诺酮类兽药残留的同时测定[J].分析测试学报，2008，27（9）：951-955.
[6]刘媛，谢孟峡，丁岚，等.高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留[J].分析化学，2004，32（3）：352-355.
[7]郑艳明，郭新东，冼燕萍，等.化妆品中7种氟喹诺酮类药物的反相高效液相色谱法测定[J].分析测试学报，2009，28（2）：235-238.
[8]马丽丽，郭昌胜，胡伟，等.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮、四环素和磺胺类抗生素[J].分析化学，2010，38（1）：21-26.
[9]刘芃岩，申杰，刘磊.复合模板印迹聚合物净化液相色谱-质谱联用法测定鱼肉中氟喹诺酮类残留[J].分析化学，2012，40（5）：693-698.
[10]高馥蝶，赵妍，邵兵，等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查牛奶中的农药和兽药残留[J].色谱，2012，30（6）：560-567.
[11]李丽莉，罗轶，何颂华，等.高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中8种喹诺酮类药物的残留量[J].中国食品卫生杂志，2012，24（1）：37-40.
[12]孙良娟，李红权，刘益锋，等.高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中14种喹诺酮类与磺胺类药物残留[J].化学试剂，2012，34（7）：633-636.