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摘要：为研究大恒优质肉鸡硫胺素沉积规律及大恒肉鸡不同家系间硫胺素的差异，选取大恒优质肉鸡的4个品系（S08、S07×S01、D2、D1）为试验材料，采用高效液相色谱法对硫胺素含量进行测定，并对其相关基因TPK1进行多态性分析。结果显示：10周龄时，S08品系胸肌中硫胺素含量极显著高于品系D1、D2（P<0.01），4个品系中公鸡胸肌中的硫胺素含量均高于母鸡，差异不明显；10周龄时，公鸡、母鸡中腿肌的硫胺素含量极显著高于胸肌（P<0.01），公鸡中的腿肌、胸肌硫胺素含量均分别高于母鸡的腿肌、胸肌，但都差异不明显。对大恒肉鸡5个品系（S07×S05、S07、S08、S07×01、S08×01）TPK1基因的所有外显子及部分3′非编码区进行了多态性位点的检测，在3′非编码区发现了1个G878A单碱基突变，该SNP位点对腹脂质量具有显著影响（P<0.05），该基因座上的基因型NN个体的腹脂质量显著高于基因型MN个体的腹脂质量，但与大恒优质肉鸡2个品系鸡肉中硫胺素含量差异不显著。
关键词：优质肉鸡；硫胺素；TPK1基因；基因多态性
中图分类号：S831.1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0237-03
硫胺素（Thiamine）即维生素B1，不仅是维持机体代谢的重要物质，而且是肉产品产生芳香物质的关键前体物质。热降解硫胺素可以产生许多含硫化合物，包括硫醇、硫化物、二硫化合物等芳香化合物[1-2]，其中2-甲基-3-巯基呋喃、2/3-巯基-3/2-戊酮是重要的挥发性化合物，5-羟基-3-巯基-2-戊酮不仅是硫胺素降解过程中的重要中间产物，而且是一类芳香化合物。因此，硫胺素及其衍生物的含量已经成为了肉食品品质的重要指标。本研究以4个优质肉鸡品系为样本，研究硫胺素的含量差异，同时对硫胺素合成代谢关键酶中硫胺焦磷酸激酶（TPK1）基因进行多态性分析[3]，以期为优质肉鸡的选育提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验动物
试验材料为四川大恒家禽有限公司培育的S08、S07×S01、D2、D1、S07×05、S07、S08×S01 共7个品系总，试验鸡有专人饲养，饲养条件及营养水平一致，统一在70日龄屠宰，屠宰前翅下静脉采血保存于真空采血管中，4 ℃保存用于DNA的提取。
1.2试验方法
1.2.1肌肉中硫胺素含量的测定采用高效液相色谱法（荧光检测）。准确称取4～6 g肉样，使用电动匀浆器匀质后置于250mL三角瓶中，加入50 mL的0.1 mol/L盐酸溶液混匀，于高压灭菌锅中121 ℃处理30 min，室温冷却。用2 mol/L乙酸钠溶液调节水解液使pH值为4.0～4.5，加入高峰氏淀粉酶，置于水浴锅中45～50 ℃酶解3 h，冷却后全部移至100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，混匀后用滤纸过滤，将滤液放置于4 ℃冰箱中保存。吸取5 mL试样加入到50 mL EP管中，再加入1.5 g氯化钠、3 mL氧化剂混匀，然后加入10 mL异丁醇萃取，静置分层后取上清液过0.45 μm滤膜，即可上样检测。
高效液相色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪（配有1200荧光检测器）。流动相：乙酸钠（0.05 mol/L，pH值4.5） ∶甲醇（35% ∶65%）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：激发波长365 nm；发射波长：435 nm；进样量：15 μL。
1.2.2鸡基因组的提取采用Axygen公司AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒来提取鸡血样中的基因组DNA。获得的DNA样品分为2份，1份用于试验，放置于4 ℃条件；另一份放在-70 ℃中长期保存，用以单链构象多态性（SSCP）分析。
1.3数据处理
10周龄大恒优质肉鸡肌肉中不同品系间硫胺素含量的差异显著性比较采用SPSS 17.0 软件包中广义线性模型（general linear model，GLM）进行最小显著差异（least significant difference，LSD ）分析，采用 Correlate 程序进行体质量与硫胺素含量的相关性分析。
2结果与分析
2.1硫胺素含量的变化
2.1.110周龄肉鸡不同品系肌肉中硫胺素含量10周龄大恒优质肉鸡S08、S07×S01、D2、D1等4个品系的硫胺素含量如表1所示。可以看出，在母鸡中S08品系胸肌中的硫胺素含量最高，D1品系胸肌中的硫胺素含量最低；S08、S07×S01品系间差异不显著，但与D2、D1差异极显著（P<001），D2、D1品系间差异不显著。在公鸡中S08、S07×S01品系间差异不显著，但分别与D2、D1差异极显著（P<0.01），D2、D1品系间差异不显著。在4个品系中所有公鸡胸肌中的硫胺素与
2.1.210周龄不同组织及性别的硫胺素含量在10周龄时，公鸡中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，并且达到极显著水平（P<0.01）；母鸡中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，也达到了极显著水平；公鸡中的胸肌、腿肌的硫胺素含量分别高于母鸡（表2）。
表2不同组织及性别硫胺素的含量
组织公鸡母鸡硫胺素含量
（mg/kg）数量
（羽）硫胺素含量
（mg/kg）数量
（羽）胸肌1.021±0.453B270.701±0.217B17腿肌1.483±0.267A291.231±0.346A15注：同列数据后标有不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
2.2TPK1基因多态性分析
2.2.1样品DNA的提取及引物的设计合成引物采用Primer Premier 5.0软件设计（表3），设计的结果经NCBI数据库的Primer-BLAST对引物进行在线比对验证，鉴定合格后由上海Invitrogen公司合成，所有引物均为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯度。表3TPK1基因所有外显子及部分非编码区的扩增引物 本研究总共设计了9对引物，对TPK1基因所有外显子及部分非编码区进行了扫描，以大恒肉鸡5个品系（S07×SO5、S07、S08、S07×01、S08×01）为研究材料。结果显示，所有9对引物的PCR扩增效果都很好，目的片段与所设计的片段大小一致，无非特异性扩增产生，都可以用于SSCP研究。PCR-SSCP研究结果显示，TPK13′UTR引物在大恒肉鸡5个品系内存在多态性，3′UTR引物所扩增的片段存在3种基因型，分别定义为MN、MM、NN（图1）。
2.2.2序列分析结果取MN、NN、MM 3种基因型的PCR产物进行纯化测序，结果显示MM基因型与数据库Ensembl
（登录号：ENSGALT00000020200）中的序列一致，将其定义为野生型。MM型与NN型相比存在1个G878A单碱基突变，将其定义为突变型。测序结果如图2所示。
2.2.35个品系TPK1不同基因型差异检验根据PCR-SSCP的检测结果，对TPK1各种基因型在5个品系中的分布进行χ2检验，以检验各个群体是否处于Hardy-Weinberg 平衡。由表4可知，大恒肉鸡5个品系都符合Hardy-Weinberg 平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有5个品系都以等位基因M为主。对5个品系的基因杂合度及多态信息含量分析显示，5个品系多态性均属于高度多态。
3结论与讨论
3.1硫胺素含量分析
对大恒优质肉鸡S08、S07×S01、D2、D1 4个品系的硫胺
素的含量进行检测及比较结果显示，在10周龄时S08品系公鸡、母鸡胸肌中的硫胺素含量都是最高的，D1品系中硫胺素的含量较低，4个品系中公鸡胸肌中的硫胺素含量都高于母鸡，这与陈国宏等研究的结果一致[4-6]。在相同的饲养条件及营养水平下，大恒优质肉鸡腿肌中的硫胺素含量都比胸肌高，这与陈国宏等的研究结果[4]基本一致。在大恒优质肉鸡中各个品系的胸肌、腿肌的平均硫胺素含量分别为0.816、1.357 mg/kg，比陈国宏等所研究的地方鸡在12周龄时的平均硫胺素含量0.44mg/kg还要高[4]，这可能是检测方法不一样或饲养条件、营养水平不同导致的，但也表明了大恒优质肉鸡肌肉中的硫胺素含量还是相对较高的。
3.2TPK1基因多态性分析
本研究对大恒鸡5个品系TPK1基因的所有外显子及部分3′非编码区进行了多态性位点的检测，在3′非编码区发现了1个G878A单碱基突变，对TPK1各种基因型在5个品系中的分布进行χ2检验及SNP位点基因型、基因频率研究。结果显示，大恒鸡5个品系都符合Hardy-Weinberg 平衡，表明这5个品系在该位点受到的选择作用比较微弱，或是在经过选择后又重新达到了平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有的5个品系都以等位基因M为主。在所有的5个品系中NN基因型只占总基因型的16%，这可能是由于群体数量相对来说还比较少。
综上所述可见大恒优质肉鸡不同品系肌肉中硫胺素在肌肉中的沉积规律及大恒鸡不同家系间硫胺素的差异，TPK1 3′UTR发现了1个G878A单碱基突变，但与大恒优质肉鸡鸡肉中硫胺素含量差异不显著。这些结果对于今后从育种角度开发利用地方优质鸡种资源有重要意义。
参考文献：
[1]Resconi V C，Escudero A，Campo M M. The development of aromas in ruminant meat[J]. Molecules，2013，18（6）：6748-6781.
[2]Cerny C，Guntz-Dubini R. Identification of 5-hydroxy-3-mercapto-2-pentanone in the maillard reaction of thiamine，cysteine，and xylose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（22）：10679-10682.
[3]孟春玲. 鸡肌肉硫胺素相关候选基因遗传多样性及其与硫胺素含量相关性研究[D]. 扬州：扬州大学，2008.
[4]陈国宏，罗方妮，吴信生，等. 地方鸡种肌肉硫胺素的含量比较研究[J]. 肉类工业，2001（增刊1）：50-52.
[5]王克华，窦套存，曲亮，等. 硫胺素在鸡肌肉中的沉积规律研究[J]. 中国畜牧兽医，2009，36（11）：198-200.
[6]谢恺舟，戴国俊，王金玉，等. 京海黄鸡肉用性能及肉品质的研究[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2008，29（1）：45-48.郝福星，左伟勇，刘莉. Clin ProTool结合质谱分析弓形虫急性感染小鼠血清多肽[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：240-241.
关键词：优质肉鸡；硫胺素；TPK1基因；基因多态性
中图分类号：S831.1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0237-03
硫胺素（Thiamine）即维生素B1，不仅是维持机体代谢的重要物质，而且是肉产品产生芳香物质的关键前体物质。热降解硫胺素可以产生许多含硫化合物，包括硫醇、硫化物、二硫化合物等芳香化合物[1-2]，其中2-甲基-3-巯基呋喃、2/3-巯基-3/2-戊酮是重要的挥发性化合物，5-羟基-3-巯基-2-戊酮不仅是硫胺素降解过程中的重要中间产物，而且是一类芳香化合物。因此，硫胺素及其衍生物的含量已经成为了肉食品品质的重要指标。本研究以4个优质肉鸡品系为样本，研究硫胺素的含量差异，同时对硫胺素合成代谢关键酶中硫胺焦磷酸激酶（TPK1）基因进行多态性分析[3]，以期为优质肉鸡的选育提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验动物
试验材料为四川大恒家禽有限公司培育的S08、S07×S01、D2、D1、S07×05、S07、S08×S01 共7个品系总，试验鸡有专人饲养，饲养条件及营养水平一致，统一在70日龄屠宰，屠宰前翅下静脉采血保存于真空采血管中，4 ℃保存用于DNA的提取。
1.2试验方法
1.2.1肌肉中硫胺素含量的测定采用高效液相色谱法（荧光检测）。准确称取4～6 g肉样，使用电动匀浆器匀质后置于250mL三角瓶中，加入50 mL的0.1 mol/L盐酸溶液混匀，于高压灭菌锅中121 ℃处理30 min，室温冷却。用2 mol/L乙酸钠溶液调节水解液使pH值为4.0～4.5，加入高峰氏淀粉酶，置于水浴锅中45～50 ℃酶解3 h，冷却后全部移至100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，混匀后用滤纸过滤，将滤液放置于4 ℃冰箱中保存。吸取5 mL试样加入到50 mL EP管中，再加入1.5 g氯化钠、3 mL氧化剂混匀，然后加入10 mL异丁醇萃取，静置分层后取上清液过0.45 μm滤膜，即可上样检测。
高效液相色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪（配有1200荧光检测器）。流动相：乙酸钠（0.05 mol/L，pH值4.5） ∶甲醇（35% ∶65%）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：激发波长365 nm；发射波长：435 nm；进样量：15 μL。
1.2.2鸡基因组的提取采用Axygen公司AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒来提取鸡血样中的基因组DNA。获得的DNA样品分为2份，1份用于试验，放置于4 ℃条件；另一份放在-70 ℃中长期保存，用以单链构象多态性（SSCP）分析。
1.3数据处理
10周龄大恒优质肉鸡肌肉中不同品系间硫胺素含量的差异显著性比较采用SPSS 17.0 软件包中广义线性模型（general linear model，GLM）进行最小显著差异（least significant difference，LSD ）分析，采用 Correlate 程序进行体质量与硫胺素含量的相关性分析。
2结果与分析
2.1硫胺素含量的变化
2.1.110周龄肉鸡不同品系肌肉中硫胺素含量10周龄大恒优质肉鸡S08、S07×S01、D2、D1等4个品系的硫胺素含量如表1所示。可以看出，在母鸡中S08品系胸肌中的硫胺素含量最高，D1品系胸肌中的硫胺素含量最低；S08、S07×S01品系间差异不显著，但与D2、D1差异极显著（P<001），D2、D1品系间差异不显著。在公鸡中S08、S07×S01品系间差异不显著，但分别与D2、D1差异极显著（P<0.01），D2、D1品系间差异不显著。在4个品系中所有公鸡胸肌中的硫胺素与
2.1.210周龄不同组织及性别的硫胺素含量在10周龄时，公鸡中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，并且达到极显著水平（P<0.01）；母鸡中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，也达到了极显著水平；公鸡中的胸肌、腿肌的硫胺素含量分别高于母鸡（表2）。
表2不同组织及性别硫胺素的含量
组织公鸡母鸡硫胺素含量
（mg/kg）数量
（羽）硫胺素含量
（mg/kg）数量
（羽）胸肌1.021±0.453B270.701±0.217B17腿肌1.483±0.267A291.231±0.346A15注：同列数据后标有不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
2.2TPK1基因多态性分析
2.2.1样品DNA的提取及引物的设计合成引物采用Primer Premier 5.0软件设计（表3），设计的结果经NCBI数据库的Primer-BLAST对引物进行在线比对验证，鉴定合格后由上海Invitrogen公司合成，所有引物均为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯度。表3TPK1基因所有外显子及部分非编码区的扩增引物 本研究总共设计了9对引物，对TPK1基因所有外显子及部分非编码区进行了扫描，以大恒肉鸡5个品系（S07×SO5、S07、S08、S07×01、S08×01）为研究材料。结果显示，所有9对引物的PCR扩增效果都很好，目的片段与所设计的片段大小一致，无非特异性扩增产生，都可以用于SSCP研究。PCR-SSCP研究结果显示，TPK13′UTR引物在大恒肉鸡5个品系内存在多态性，3′UTR引物所扩增的片段存在3种基因型，分别定义为MN、MM、NN（图1）。
2.2.2序列分析结果取MN、NN、MM 3种基因型的PCR产物进行纯化测序，结果显示MM基因型与数据库Ensembl
（登录号：ENSGALT00000020200）中的序列一致，将其定义为野生型。MM型与NN型相比存在1个G878A单碱基突变，将其定义为突变型。测序结果如图2所示。
2.2.35个品系TPK1不同基因型差异检验根据PCR-SSCP的检测结果，对TPK1各种基因型在5个品系中的分布进行χ2检验，以检验各个群体是否处于Hardy-Weinberg 平衡。由表4可知，大恒肉鸡5个品系都符合Hardy-Weinberg 平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有5个品系都以等位基因M为主。对5个品系的基因杂合度及多态信息含量分析显示，5个品系多态性均属于高度多态。
3结论与讨论
3.1硫胺素含量分析
对大恒优质肉鸡S08、S07×S01、D2、D1 4个品系的硫胺
素的含量进行检测及比较结果显示，在10周龄时S08品系公鸡、母鸡胸肌中的硫胺素含量都是最高的，D1品系中硫胺素的含量较低，4个品系中公鸡胸肌中的硫胺素含量都高于母鸡，这与陈国宏等研究的结果一致[4-6]。在相同的饲养条件及营养水平下，大恒优质肉鸡腿肌中的硫胺素含量都比胸肌高，这与陈国宏等的研究结果[4]基本一致。在大恒优质肉鸡中各个品系的胸肌、腿肌的平均硫胺素含量分别为0.816、1.357 mg/kg，比陈国宏等所研究的地方鸡在12周龄时的平均硫胺素含量0.44mg/kg还要高[4]，这可能是检测方法不一样或饲养条件、营养水平不同导致的，但也表明了大恒优质肉鸡肌肉中的硫胺素含量还是相对较高的。
3.2TPK1基因多态性分析
本研究对大恒鸡5个品系TPK1基因的所有外显子及部分3′非编码区进行了多态性位点的检测，在3′非编码区发现了1个G878A单碱基突变，对TPK1各种基因型在5个品系中的分布进行χ2检验及SNP位点基因型、基因频率研究。结果显示，大恒鸡5个品系都符合Hardy-Weinberg 平衡，表明这5个品系在该位点受到的选择作用比较微弱，或是在经过选择后又重新达到了平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有的5个品系都以等位基因M为主。在所有的5个品系中NN基因型只占总基因型的16%，这可能是由于群体数量相对来说还比较少。
综上所述可见大恒优质肉鸡不同品系肌肉中硫胺素在肌肉中的沉积规律及大恒鸡不同家系间硫胺素的差异，TPK1 3′UTR发现了1个G878A单碱基突变，但与大恒优质肉鸡鸡肉中硫胺素含量差异不显著。这些结果对于今后从育种角度开发利用地方优质鸡种资源有重要意义。
参考文献：
[1]Resconi V C，Escudero A，Campo M M. The development of aromas in ruminant meat[J]. Molecules，2013，18（6）：6748-6781.
[2]Cerny C，Guntz-Dubini R. Identification of 5-hydroxy-3-mercapto-2-pentanone in the maillard reaction of thiamine，cysteine，and xylose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（22）：10679-10682.
[3]孟春玲. 鸡肌肉硫胺素相关候选基因遗传多样性及其与硫胺素含量相关性研究[D]. 扬州：扬州大学，2008.
[4]陈国宏，罗方妮，吴信生，等. 地方鸡种肌肉硫胺素的含量比较研究[J]. 肉类工业，2001（增刊1）：50-52.
[5]王克华，窦套存，曲亮，等. 硫胺素在鸡肌肉中的沉积规律研究[J]. 中国畜牧兽医，2009，36（11）：198-200.
[6]谢恺舟，戴国俊，王金玉，等. 京海黄鸡肉用性能及肉品质的研究[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2008，29（1）：45-48.郝福星，左伟勇，刘莉. Clin ProTool结合质谱分析弓形虫急性感染小鼠血清多肽[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：240-241.