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摘 要：牙周牙髓疾病严重影响人们正常工作和生活。常规治疗方法是牙周洁治、刮治、根面平整和根管治疗。由于其在恢复正常牙体组织方面存在一定的局限性，因此基于组织工程的牙再生技术应运而生。牙再生是通过干细胞的分离、培养、诱导分化，并最终形成部分或完整牙齿结构的过程，在实际临床应用中意义非凡。近年来，3D生物打印技术受到国内外研究学者的青睐，其可跳過细胞接种程序，直接将细胞和生物材料精确放置在三维结构内的预定位置，在组织工程领域应用广泛。目前，越来越多的学者将3D生物打印用于牙再生领域的研究中。基于此，文章归纳总结了3D生物打印在牙再生领域中的应用，希望对今后的相关研究提供一些理论指导。
关键词：生物打印;牙再生;组织工程
中图分类号：R78 文献标识码：A 文章编号：1001-5922（2021）10-0081-05
The Research Progress of 3D Bioprinting in Tooth Regeneration
Song Chunyan， Ma Sijia， Meng Yupeng， Sun Gengtian， Qian Ming
（Department of Prosthodontics， Stomatological Hospital of Jilin University， Changchun 130021， China ）
Abstract：Periodontal pulp disease seriously affects people’s normal work and life. The conventional treatment methods are periodontal cleansing， curettage， root planing and root canal treatment. Due to its limitations in restoring normal tooth tissues， tooth regeneration techniques based on tissue engineering have emerged. Tooth regeneration is the process of separating， culturing， and inducing differentiation of stem cells， and finally forming a partial or complete tooth structure， which is of great significance in practical clinical applications. In recent years， 3D bioprinting technology has been favored by research scholars at home and abroad. It can skip the cell seeding procedure and directly place cells and biological materials at predetermined positions within the three-dimensional structure. It is widely used in the field of tissue engineering. At present， more and more scholars are using 3D bioprinting for research in the field of tooth regeneration. Based on this， this paper summarizes the application of 3D bioprinting in the field of tooth regeneration， hoping to provide some theoretical guidance for related research in the future.
Key words：bioprinting;tooth regeneration;tissue engineering
牙齿在人的一生中承担着重要功能，不仅可以维持美观，还参与咀嚼、消化、营养吸收等活动。而感染、外伤、先天疾病常常导致牙周牙髓疾病，前者可引起牙龈出血、牙槽骨吸收，甚至牙齿松动、脱落，而后者可造成牙齿变色、疼痛。有研究表明，牙周疾病还与多种全身疾病相关，包括糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病、癌症等[1-2]。传统治疗方法存在一定的不足：常规牙周治疗只能阻止疾病的发生发展，不能再生牙周组织;而根管治疗会导致牙齿失去营养支持，脆性增加，进而造成牙折的发生率大大上升。近年来出现了牙髓血运重建（Pulp revascularization）、引导组织再生（Guide tissue regeneration，GTR）、引导骨再生（Guided bone regeneration，GBR）等[3]新方法，但其适应症严格且效果有限。因此，如何恢复正常的牙体组织成为近年来的研究热点。研究显示，基于组织工程的牙再生是解决这一问题的有效手段。而3D生物打印作为一项新技术，在组织工程领域应用广泛，如皮肤、神经、肝脏、心血管、骨或软骨系统等[4-8]。近年来，通过3D生物打印进行牙再生受到越来越多国内外学者的关注。本文就3D生物打印在牙再生领域的研究现状做一综述。
1 3D生物打印的概述
3D生物打印是由计算机科学、组织工程、再生医学等多学科交叉所组成的一种新兴技术。与传统3D打印相比，其优势在于可加载细胞，并控制不同种类的细胞在打印体的密度和分布，更好地模拟体内过程[4]。其中，生物墨水是3D生物打印的“原始材料”，主要由细胞和水凝胶组成。理想的生物墨水应具有以下特征[9]：一定的机械性能，良好的生物相容性，适宜的流变特性以及可生物降解性等。 3D生物打印的基本原理主要包括：生物自组装、微型组织单元、仿生学。生物自组装是指分子在没有外部因素指导的情况下通过非共价相互作用缔合来形成高度有序的三维结构的能力;微型组织单元是3D生物打印的最小复合组织单位，可以是球形的组织球或圆柱形的组织束[10];仿生学是指3D生物打印体是通过模拟体内生物体的结构和功能来完成的，通常是通过打印载有细胞的水凝胶来实现的[11-12]。基本过程如下：首先通过用户界面进行设计或计算机断层扫面/核磁共振成像/超声成像技术获取目标组织的结构特征，然后利用计算机辅助设计/计算机辅助制造技术生成复杂的3D图像，最后通过在基板上自动沉积载有细胞的生物墨水来形成复杂的3D仿生组织结构[13-14]。
2 3D生物打印的分类
2.1 喷墨生物打印
喷墨生物打印是第一个生物打印技术，与传统的二维喷墨打印十分相似，通过喷射细胞和水凝胶的小液滴来构建组织[15]。其优势在于低打印成本，高打印速度以及高细胞存活率。但是其在粘度和细胞密度方面存在一定的局限性。此外，该技术中的液体沉降效应可能会堵塞喷头[15]。
2.2 激光辅助生物打印
激光辅助生物打印源自激光直接写入和激光诱导的转印技术，使用激光蒸发供体层中的区域形成气泡，推动悬浮的生物墨水掉落到基材上[15]。其可避免分配器与生物墨水的直接接触[2]，获得高细胞活力和分辨率[16-17]。此外，其可打印高粘度和多种类型的生物墨水。但是，其价格高昂且控制系统复杂，在一定程度上限制了该技术的使用。
2.3 挤压式生物打印
挤压式生物打印是喷墨式打印的一种改进，通过使用气动或手动力连续挤压细胞-水凝胶溶液，形成不间断的圆柱线[15]。其打印范围广泛，几乎各种粘度和细胞密度的生物墨水均可打印。但是，其在细胞活力、分辨率以及打印速率方面不甚理想[17]。
2.4 其他
以上3种是组织工程领域生物打印最常用的类型，除此之外，立体光刻技术、微流体技术、数字光处理技术、多喷头系统、核壳针系统等被用于多种材料的生物打印当中来制造多材料异质仿生组织[15-18]。
3 3D生物打印在牙再生中的应用
3.1 牙髓-牙本质的再生
牙髓是一种富含神经、血管的软组织，具有营养、感觉和防御各种病原体的功能。此外，它还可以产生牙本质并保持牙本质的生物学和生理活力。牙髓炎是与牙髓有关的最常见疾病之一，通常由龋病和外伤引起。传统的根管治疗无法再生牙髓组织。研究显示，已经有学者通过3D生物打印进行牙髓-牙本质的再生。牙髓干细胞（Dental pulp stem cells，DPSC）、来自根尖乳头的干细胞（Apical papilla stem cells，SCAP）、来自人类脱落乳牙的干细胞（Human exfoliated deciduous teeth，SHED）等干细胞都已经用于牙髓-牙本质的再生。但目前为止，仅DPSC和SCAP用于3D生物打印的牙髓-牙本质的再生中。
生物墨水作为3D生物打印的关键，需要具备适宜的物理、化学以及生物学性能。国内外学者在探索适合牙再生的生物墨水方面进行了一些研究，并取得了部分成果，主要包括纤维蛋白、胶原蛋白、海藻酸钠/明胶水凝胶、甲基丙烯酸明胶（Gelatin methacrylate，GelMA）以及一些新型生物墨水。薛世华等[19]和Yu等[20]都对DPSC/海藻酸钠/明胶混合物的生物打印进行初步探索。前者发现DPSC在三维结构体内生长状态较好，具有87%左右的细胞活力，为3D生物打印在牙再生的应用奠定基础。而后者发现，与单纯水凝胶装载细胞相比，通过3D生物打印方式装载细胞更能促进DPSC在水凝胶的生长、粘附、增殖和分化，证明了3D生物打印在构造三维结构体方面的优越性。
为促进细胞向牙源性分化，有学者开发了新型生物墨水，包括骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）模拟肽生物墨水、牙本质衍生的生物墨水以及基于核苷酸脂质的生物墨水。BMP是整形外科领域常用的生长因子，已获得美国FDA的批准。于是，Park等[21]将硫醇化的BMP模拟肽偶联到基于GelMA的生物墨水进行3D生物打印，检测细胞活力和分化情况。结果显示，DPSC的活力超过90%，且与对照组相比，BMP模拟肽组钙化程度更高，牙本质唾液磷蛋白和骨钙素表达更稳定。有研究显示，牙本质基质蛋白保留了天然细胞粘附精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸和基质金属蛋白酶结合位点，对于细胞的生存、增殖、分化都至关重要。基于此，Athirasala等[22]开发了牙本质衍生的水凝胶生物墨水用于牙再生的生物打印，用小鼠成牙本质细胞系进行初始细胞相容性研究，SCAP用于细胞活力和分化的检测。结果显示，该新型生物墨水在各种浓度下均可以显示出高的细胞活力，且当海藻酸钠和牙本质基质为1∶1时，至少5d内的活细胞百分比高于90%，且可以增强细胞的牙源性分化。Dessane等[23]还报道了一种基于核苷酸脂质的生物墨水，通过挤压式生物打印，可获得适宜的机械性能和生物学特性，其装载的牙龈成纤维细胞和SCAP活力和增殖均较理想。
除了生物墨水的探索之外，也有学者利用3D生物打印促进了真正的牙髓-牙本质的再生。Khayat等[24]用GelMA水凝胶封装DPSC/人脐静脉内皮细胞，植入牙齿根管内并在动物体内进行培养，结果显示，细胞附着在牙根内牙本质的表面，并向牙本质小管延伸，最终形成了牙髓样组织和修复性牙本质基质。Han等[25]通過3D生物打印，基于含DPSC的不同浓度的纤维蛋白生物墨水分别模拟牙髓和牙本质，以可生物降解的聚己内酯重现牙齿三维整体形状，最终得到了具有特定形状和大小的牙髓-牙本质复合体。而Campos等[26]还开发了手持式生物打印技术，使用具有适当生物学特性的胶原蛋白生物墨水进行生物打印，最终实现了体外根管内的血管生成。由于该技术操作简单又方便，在实际临床工作中实用性强。 综上所述，选择合适的干细胞和水凝胶组成生物墨水，通过3D生物打印技術可以促进牙髓-牙本质的再生，在今后的临床应用中具有巨大潜力。
3.2 牙周组织再生
牙周组织也叫牙齿支持组织，包括牙龈、牙周膜、牙骨质、固有牙槽骨，对于支持、稳定、营养牙齿具有重要作用。牙周炎是牙周组织发生的慢性感染性疾病，是成年人牙齿脱落的主要原因。传统的洁治、刮治不能再生牙周组织，3D生物打印或许可以成为牙周组织再生的一种策略。研究显示，DPSC、SHED、SCAP、牙周膜干细胞（Periodontal Ligament Stem Cells，PDLSC）、牙囊干细胞（Dental follicle stem cells，DFSC）等均可以进行牙周组织的再生[3]。但据目前的文献发现，仅DPSC、PDLSC已经用于3D生物打印牙周组织的再生。
优化生物打印系统是利用三维构建体治疗牙周疾病的第一步。于是，Raveendran等[27]探讨了PDLSC在3D生物打印中的优化，该研究基于微挤压式生物打印系统，研究了明胶/GelMA水凝胶前体的可印刷性，并评估了不同打印参数如压力、打印针头直径、GelMA及光引发剂浓度、紫外线暴露时间等对PDLSC活力的影响。结果表明，使用25号针头以135kPa的压力挤出具有0.05%光引发剂的12.5%GelMA溶液，并进行20s的紫外交联可获得最佳打印效果，且PDLSC可维持至少14d的细胞活力。通过选择最佳打印条件，实现PDLSC在3D生物打印的高分辨率、尺寸稳定性和细胞活力，在今后3D生物打印在牙周病的应用具有很大潜力。徐娟等[28]探讨了PDLSC作为种子细胞，聚己内酯作为支架材料，进行3D生物打印的可行性。其将聚己内酯支架和种子细胞分期打印，并与海藻酸钠-明胶水凝胶进行对比，结果显示，聚己内酯组PDLSC活性更好，且得到的特定形状和大小的3D打印体与缺损尺寸完全匹配。Ma等[29]基于3D生物打印，通过控制GelMA和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的体积比来生成具有ECM梯度的并装载细胞的3D水凝胶阵列，并研究阵列中PDLSC的变化，发现体积比为4/1的水凝胶对于维持细胞活力最佳，且在体内可促进骨缺损修复。Xin等[30]利用包括PDLSC在内的6种细胞悬液作为生物墨水，并通过电喷雾技术进行生物打印，结果显示，该技术未对细胞活力和增殖产生明显负面影响，为其在牙再生的应用提供了希望。
骨再生是牙周组织再生的难点之一。有学者通过3D生物打印促进牙周组织的骨再生。Dubey等[31]建立了一种新型的生物墨水配方，将细胞外基质基水凝胶与非晶态磷酸镁（AMP）颗粒结合，并分析其中DPSC的细胞状态和成骨分化水平。结果显示，与对照组相比，含有AMP的生物墨水中细胞生长状态更佳，细胞活力在90%左右，且成骨基因的表达和矿化水平更为显著。Dubey等[32]开发了一种纤维增强的水凝胶，通过将聚（ε-己内酯）纤维网融合到具有生物活性的AMP的明胶中，制备了机械性能和治疗功能均可调的GelMA水凝胶。其中，AMP和聚（ε-己内酯）的多孔结构可调节机械性能并改善成骨效果，有利于GBR。体内和体外结果表明，通过生物打印制备的聚（ε-己内酯）网络可以延迟水凝胶的降解，防止软组织的侵入，并提供机械屏障，使迁移较慢的具有成骨分化能的细胞参与骨骼再生。
综上，通过优化生物墨水以及打印条件，并利用3D生物打印进行牙周组织的再生是行之有效的策略，为牙周炎的患者带来了新希望。
4 结语
综上所述，3D生物打印技术为牙髓-牙本质以及牙周组织的再生开辟了一条崭新的道路，在实际临床工作中具有重要意义。目前，传统的3D打印在牙再生领域应用较为广泛[33]，并取得了较为理想的成果。而更先进的3D生物打印由于可以控制细胞的分布和密度，在牙再生领域拥有更多优势和更广阔的应用前景，为牙再生提供了新思路。但该技术仍处于初期的探索阶段，在微环境的构造和干细胞的来源方面仍存在局限性，未来的发展可集中于这两个方面进行。总而言之，通过3D生物打印进行牙再生兼具希望与挑战。
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关键词：生物打印;牙再生;组织工程
中图分类号：R78 文献标识码：A 文章编号：1001-5922（2021）10-0081-05
The Research Progress of 3D Bioprinting in Tooth Regeneration
Song Chunyan， Ma Sijia， Meng Yupeng， Sun Gengtian， Qian Ming
（Department of Prosthodontics， Stomatological Hospital of Jilin University， Changchun 130021， China ）
Abstract：Periodontal pulp disease seriously affects people’s normal work and life. The conventional treatment methods are periodontal cleansing， curettage， root planing and root canal treatment. Due to its limitations in restoring normal tooth tissues， tooth regeneration techniques based on tissue engineering have emerged. Tooth regeneration is the process of separating， culturing， and inducing differentiation of stem cells， and finally forming a partial or complete tooth structure， which is of great significance in practical clinical applications. In recent years， 3D bioprinting technology has been favored by research scholars at home and abroad. It can skip the cell seeding procedure and directly place cells and biological materials at predetermined positions within the three-dimensional structure. It is widely used in the field of tissue engineering. At present， more and more scholars are using 3D bioprinting for research in the field of tooth regeneration. Based on this， this paper summarizes the application of 3D bioprinting in the field of tooth regeneration， hoping to provide some theoretical guidance for related research in the future.
Key words：bioprinting;tooth regeneration;tissue engineering
牙齿在人的一生中承担着重要功能，不仅可以维持美观，还参与咀嚼、消化、营养吸收等活动。而感染、外伤、先天疾病常常导致牙周牙髓疾病，前者可引起牙龈出血、牙槽骨吸收，甚至牙齿松动、脱落，而后者可造成牙齿变色、疼痛。有研究表明，牙周疾病还与多种全身疾病相关，包括糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病、癌症等[1-2]。传统治疗方法存在一定的不足：常规牙周治疗只能阻止疾病的发生发展，不能再生牙周组织;而根管治疗会导致牙齿失去营养支持，脆性增加，进而造成牙折的发生率大大上升。近年来出现了牙髓血运重建（Pulp revascularization）、引导组织再生（Guide tissue regeneration，GTR）、引导骨再生（Guided bone regeneration，GBR）等[3]新方法，但其适应症严格且效果有限。因此，如何恢复正常的牙体组织成为近年来的研究热点。研究显示，基于组织工程的牙再生是解决这一问题的有效手段。而3D生物打印作为一项新技术，在组织工程领域应用广泛，如皮肤、神经、肝脏、心血管、骨或软骨系统等[4-8]。近年来，通过3D生物打印进行牙再生受到越来越多国内外学者的关注。本文就3D生物打印在牙再生领域的研究现状做一综述。
1 3D生物打印的概述
3D生物打印是由计算机科学、组织工程、再生医学等多学科交叉所组成的一种新兴技术。与传统3D打印相比，其优势在于可加载细胞，并控制不同种类的细胞在打印体的密度和分布，更好地模拟体内过程[4]。其中，生物墨水是3D生物打印的“原始材料”，主要由细胞和水凝胶组成。理想的生物墨水应具有以下特征[9]：一定的机械性能，良好的生物相容性，适宜的流变特性以及可生物降解性等。 3D生物打印的基本原理主要包括：生物自组装、微型组织单元、仿生学。生物自组装是指分子在没有外部因素指导的情况下通过非共价相互作用缔合来形成高度有序的三维结构的能力;微型组织单元是3D生物打印的最小复合组织单位，可以是球形的组织球或圆柱形的组织束[10];仿生学是指3D生物打印体是通过模拟体内生物体的结构和功能来完成的，通常是通过打印载有细胞的水凝胶来实现的[11-12]。基本过程如下：首先通过用户界面进行设计或计算机断层扫面/核磁共振成像/超声成像技术获取目标组织的结构特征，然后利用计算机辅助设计/计算机辅助制造技术生成复杂的3D图像，最后通过在基板上自动沉积载有细胞的生物墨水来形成复杂的3D仿生组织结构[13-14]。
2 3D生物打印的分类
2.1 喷墨生物打印
喷墨生物打印是第一个生物打印技术，与传统的二维喷墨打印十分相似，通过喷射细胞和水凝胶的小液滴来构建组织[15]。其优势在于低打印成本，高打印速度以及高细胞存活率。但是其在粘度和细胞密度方面存在一定的局限性。此外，该技术中的液体沉降效应可能会堵塞喷头[15]。
2.2 激光辅助生物打印
激光辅助生物打印源自激光直接写入和激光诱导的转印技术，使用激光蒸发供体层中的区域形成气泡，推动悬浮的生物墨水掉落到基材上[15]。其可避免分配器与生物墨水的直接接触[2]，获得高细胞活力和分辨率[16-17]。此外，其可打印高粘度和多种类型的生物墨水。但是，其价格高昂且控制系统复杂，在一定程度上限制了该技术的使用。
2.3 挤压式生物打印
挤压式生物打印是喷墨式打印的一种改进，通过使用气动或手动力连续挤压细胞-水凝胶溶液，形成不间断的圆柱线[15]。其打印范围广泛，几乎各种粘度和细胞密度的生物墨水均可打印。但是，其在细胞活力、分辨率以及打印速率方面不甚理想[17]。
2.4 其他
以上3种是组织工程领域生物打印最常用的类型，除此之外，立体光刻技术、微流体技术、数字光处理技术、多喷头系统、核壳针系统等被用于多种材料的生物打印当中来制造多材料异质仿生组织[15-18]。
3 3D生物打印在牙再生中的应用
3.1 牙髓-牙本质的再生
牙髓是一种富含神经、血管的软组织，具有营养、感觉和防御各种病原体的功能。此外，它还可以产生牙本质并保持牙本质的生物学和生理活力。牙髓炎是与牙髓有关的最常见疾病之一，通常由龋病和外伤引起。传统的根管治疗无法再生牙髓组织。研究显示，已经有学者通过3D生物打印进行牙髓-牙本质的再生。牙髓干细胞（Dental pulp stem cells，DPSC）、来自根尖乳头的干细胞（Apical papilla stem cells，SCAP）、来自人类脱落乳牙的干细胞（Human exfoliated deciduous teeth，SHED）等干细胞都已经用于牙髓-牙本质的再生。但目前为止，仅DPSC和SCAP用于3D生物打印的牙髓-牙本质的再生中。
生物墨水作为3D生物打印的关键，需要具备适宜的物理、化学以及生物学性能。国内外学者在探索适合牙再生的生物墨水方面进行了一些研究，并取得了部分成果，主要包括纤维蛋白、胶原蛋白、海藻酸钠/明胶水凝胶、甲基丙烯酸明胶（Gelatin methacrylate，GelMA）以及一些新型生物墨水。薛世华等[19]和Yu等[20]都对DPSC/海藻酸钠/明胶混合物的生物打印进行初步探索。前者发现DPSC在三维结构体内生长状态较好，具有87%左右的细胞活力，为3D生物打印在牙再生的应用奠定基础。而后者发现，与单纯水凝胶装载细胞相比，通过3D生物打印方式装载细胞更能促进DPSC在水凝胶的生长、粘附、增殖和分化，证明了3D生物打印在构造三维结构体方面的优越性。
为促进细胞向牙源性分化，有学者开发了新型生物墨水，包括骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）模拟肽生物墨水、牙本质衍生的生物墨水以及基于核苷酸脂质的生物墨水。BMP是整形外科领域常用的生长因子，已获得美国FDA的批准。于是，Park等[21]将硫醇化的BMP模拟肽偶联到基于GelMA的生物墨水进行3D生物打印，检测细胞活力和分化情况。结果显示，DPSC的活力超过90%，且与对照组相比，BMP模拟肽组钙化程度更高，牙本质唾液磷蛋白和骨钙素表达更稳定。有研究显示，牙本质基质蛋白保留了天然细胞粘附精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸和基质金属蛋白酶结合位点，对于细胞的生存、增殖、分化都至关重要。基于此，Athirasala等[22]开发了牙本质衍生的水凝胶生物墨水用于牙再生的生物打印，用小鼠成牙本质细胞系进行初始细胞相容性研究，SCAP用于细胞活力和分化的检测。结果显示，该新型生物墨水在各种浓度下均可以显示出高的细胞活力，且当海藻酸钠和牙本质基质为1∶1时，至少5d内的活细胞百分比高于90%，且可以增强细胞的牙源性分化。Dessane等[23]还报道了一种基于核苷酸脂质的生物墨水，通过挤压式生物打印，可获得适宜的机械性能和生物学特性，其装载的牙龈成纤维细胞和SCAP活力和增殖均较理想。
除了生物墨水的探索之外，也有学者利用3D生物打印促进了真正的牙髓-牙本质的再生。Khayat等[24]用GelMA水凝胶封装DPSC/人脐静脉内皮细胞，植入牙齿根管内并在动物体内进行培养，结果显示，细胞附着在牙根内牙本质的表面，并向牙本质小管延伸，最终形成了牙髓样组织和修复性牙本质基质。Han等[25]通過3D生物打印，基于含DPSC的不同浓度的纤维蛋白生物墨水分别模拟牙髓和牙本质，以可生物降解的聚己内酯重现牙齿三维整体形状，最终得到了具有特定形状和大小的牙髓-牙本质复合体。而Campos等[26]还开发了手持式生物打印技术，使用具有适当生物学特性的胶原蛋白生物墨水进行生物打印，最终实现了体外根管内的血管生成。由于该技术操作简单又方便，在实际临床工作中实用性强。 综上所述，选择合适的干细胞和水凝胶组成生物墨水，通过3D生物打印技術可以促进牙髓-牙本质的再生，在今后的临床应用中具有巨大潜力。
3.2 牙周组织再生
牙周组织也叫牙齿支持组织，包括牙龈、牙周膜、牙骨质、固有牙槽骨，对于支持、稳定、营养牙齿具有重要作用。牙周炎是牙周组织发生的慢性感染性疾病，是成年人牙齿脱落的主要原因。传统的洁治、刮治不能再生牙周组织，3D生物打印或许可以成为牙周组织再生的一种策略。研究显示，DPSC、SHED、SCAP、牙周膜干细胞（Periodontal Ligament Stem Cells，PDLSC）、牙囊干细胞（Dental follicle stem cells，DFSC）等均可以进行牙周组织的再生[3]。但据目前的文献发现，仅DPSC、PDLSC已经用于3D生物打印牙周组织的再生。
优化生物打印系统是利用三维构建体治疗牙周疾病的第一步。于是，Raveendran等[27]探讨了PDLSC在3D生物打印中的优化，该研究基于微挤压式生物打印系统，研究了明胶/GelMA水凝胶前体的可印刷性，并评估了不同打印参数如压力、打印针头直径、GelMA及光引发剂浓度、紫外线暴露时间等对PDLSC活力的影响。结果表明，使用25号针头以135kPa的压力挤出具有0.05%光引发剂的12.5%GelMA溶液，并进行20s的紫外交联可获得最佳打印效果，且PDLSC可维持至少14d的细胞活力。通过选择最佳打印条件，实现PDLSC在3D生物打印的高分辨率、尺寸稳定性和细胞活力，在今后3D生物打印在牙周病的应用具有很大潜力。徐娟等[28]探讨了PDLSC作为种子细胞，聚己内酯作为支架材料，进行3D生物打印的可行性。其将聚己内酯支架和种子细胞分期打印，并与海藻酸钠-明胶水凝胶进行对比，结果显示，聚己内酯组PDLSC活性更好，且得到的特定形状和大小的3D打印体与缺损尺寸完全匹配。Ma等[29]基于3D生物打印，通过控制GelMA和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的体积比来生成具有ECM梯度的并装载细胞的3D水凝胶阵列，并研究阵列中PDLSC的变化，发现体积比为4/1的水凝胶对于维持细胞活力最佳，且在体内可促进骨缺损修复。Xin等[30]利用包括PDLSC在内的6种细胞悬液作为生物墨水，并通过电喷雾技术进行生物打印，结果显示，该技术未对细胞活力和增殖产生明显负面影响，为其在牙再生的应用提供了希望。
骨再生是牙周组织再生的难点之一。有学者通过3D生物打印促进牙周组织的骨再生。Dubey等[31]建立了一种新型的生物墨水配方，将细胞外基质基水凝胶与非晶态磷酸镁（AMP）颗粒结合，并分析其中DPSC的细胞状态和成骨分化水平。结果显示，与对照组相比，含有AMP的生物墨水中细胞生长状态更佳，细胞活力在90%左右，且成骨基因的表达和矿化水平更为显著。Dubey等[32]开发了一种纤维增强的水凝胶，通过将聚（ε-己内酯）纤维网融合到具有生物活性的AMP的明胶中，制备了机械性能和治疗功能均可调的GelMA水凝胶。其中，AMP和聚（ε-己内酯）的多孔结构可调节机械性能并改善成骨效果，有利于GBR。体内和体外结果表明，通过生物打印制备的聚（ε-己内酯）网络可以延迟水凝胶的降解，防止软组织的侵入，并提供机械屏障，使迁移较慢的具有成骨分化能的细胞参与骨骼再生。
综上，通过优化生物墨水以及打印条件，并利用3D生物打印进行牙周组织的再生是行之有效的策略，为牙周炎的患者带来了新希望。
4 结语
综上所述，3D生物打印技术为牙髓-牙本质以及牙周组织的再生开辟了一条崭新的道路，在实际临床工作中具有重要意义。目前，传统的3D打印在牙再生领域应用较为广泛[33]，并取得了较为理想的成果。而更先进的3D生物打印由于可以控制细胞的分布和密度，在牙再生领域拥有更多优势和更广阔的应用前景，为牙再生提供了新思路。但该技术仍处于初期的探索阶段，在微环境的构造和干细胞的来源方面仍存在局限性，未来的发展可集中于这两个方面进行。总而言之，通过3D生物打印进行牙再生兼具希望与挑战。
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