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摘要：为优化癞葡萄中总黄酮的超声波辅助提取工艺，通过单因素试验确定乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取温度、超声功率5个提取工艺参数的最适水平范围，并通过响应面分析法（RSM）对乙醇体积分数、提取温度、提取时间进行优化。结果表明，超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数72%、提取温度68 ℃、提取时间34 min，此条件下黄酮提取率为2.53%；验证试验表明，黄酮提取率为2.54%，与理论值相符合。
关键词：癞葡萄；黄酮；超声波辅助提取；响应面分析
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0340-03
收稿日期：2015-01-08
基金项目：河南省科技攻关计划（编号：142102110177）。
作者简介：袁晓晴（1977—），女，江苏泰州人，博士，副教授，主要从事农产品深加工研究。E-mail：yxq_yrd@163.com。癞葡萄（Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.）别称名金铃子，是葫芦科苦瓜属（Momordica）的栽培种之一，其果实呈纺锤状，果面呈不规则尖刺状，长约4 cm、宽约3 cm、单果质量25～30 g，未成熟果实呈浅绿色，成熟后呈金黄色。目前关于癞葡萄中活性肽、皂苷的研究较多[1-2]，而对癞葡萄中黄酮的研究较少。癞葡萄的果实、叶中均富含黄酮，黄酮是一种强抗氧化剂，具有清除自由基、抗衰老、抗炎抑菌、降低胆固醇含量等多种生理功效[3-5]。
提取植物中总黄酮的传统方法是热回流提取法。近年来，随着提取技术的不断发展，许多学者使用超声波辅助法分别从黄花菜[6]、马齿苋[7]、苦荞[8]等植物中提取总黄酮。超声波提取是利用超声波破碎细胞（空化）和强化传质（机械）作用，使溶剂分子渗透到组织细胞中与溶质分子充分接触，从而使细胞中的可溶成分更快释放出来，该方法具有提取速度快、得率高、对热不稳定物质破坏少等特点[9]。本研究通过单因素试验、响应面分析法优化超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的工艺，以期为癞葡萄黄酮的开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
癞葡萄采自南京市郊区，于70 ℃下烘干，冷却后粉碎过40目筛，置于干燥器中保存备用。芸香苷购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；无水乙醇（AR）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。
XA-1型高速万能粉碎机（江苏省姜堰市银河实验仪器厂产品），WFJ7200型可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司产品），KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司产品），SHZ-D型循环水式真空泵（郑州市长城科工贸有限公司产品）。
1.2试验方法
1.2.1标准曲线的制作精确称取芸香苷标准品0.01 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。分别准确吸取芸香苷标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀并静置6 min，加入0.5 mL质量分数为10%的Al（NO3）3溶液，摇匀并静置6 min，再加入 4.0 mL 质量分数为4%的NaOH溶液，最后添加70%乙醇至刻度，摇匀并静置15 min，于波长510 nm处测定吸光度，到得芸香苷浓度C（mg/mL）与吸光度D之间的回归方程：
C=0.085 3D 0.002 5，r2 =0.998 8。
1.2.2癞葡萄总黄酮的提取及测定精确称取脱脂后的癞葡萄粉1.0 g，加入一定体积分数的乙醇溶液，按相应条件进行超声波辅助提取，减压抽滤并将滤液移至烧杯中待测。吸取1.0 mL待测液于10 mL容量瓶中，按照“1.2.1”节的方法测定黄酮质量，黄酮提取率的计算公式为：
黄酮提取率=C×10×Vm×100%。
式中：C为总黄酮浓度（mg/mL）；m为癞葡萄粉质量（mg）；V为癞葡萄提取液体积（mL）。
1.2.3单因素试验分别考察乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时间、超声功率对癞葡萄黄酮提取率的影响。试验中各考察因素的设定水平分别为：乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%；液固比（mL ∶g）10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1；提取温度40、50、60、70、80、90 ℃；提取时间10、20、30、40、50 min；超声功率120、140、160、180、200 W。除考察因素外，其他因素的条件为：乙醇体积分数70%、液固比30 mL ∶1 g、超声功率180 W、提取温度70 ℃、提取时间30 min。
1.2.4响应面优化试验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、提取温度、提取时间为因素，采用Design-Expert软件的中心组合试验Box-Behnken设计3因素3水平（表1）的中心旋转组合试验。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1乙醇体积分数的影响当乙醇体积分数低于70%
时，癞葡萄黄酮提取率随乙醇体积分数的提高逐渐增大；当乙醇体积分数高于70%时，黄酮提取率反而下降（图1）。可见，乙醇体积分数为70%左右时，溶剂与溶质极性最相似；乙醇体积分数过高则叶绿素等脂溶性物质的溶出量增多，不利于黄酮的提纯[10]，因此确定乙醇体积分数为70%。
2.1.2液固比的影响当液固比小于30 mL ∶1 g时，癞葡萄黄酮提取率随液固比的增加显著提高；当液固比大于 30 mL ∶1 g 时，黄酮提取率的增幅降低（图2）。液固比过高将增加溶剂成本，并加重后续的浓缩和干燥工作，因此确定液固比为30 mL ∶1 g。 2.1.3提取时间的影响在提取的前30 min内，癞葡萄黄酮提取率随提取时间的延长显著提高；当提取时间继续延长时，黄酮提取率的增幅降低（图3）。为提高工作效率，确定提取时间为30 min。
2.1.4提取温度的影响当温度低于70 ℃时，癞葡萄黄酮提取率随温度的升高显著增大；当温度高于70 ℃时，黄酮提取率反而降低（图4）。温度升高会加剧溶剂和溶质分子运动，有利于黄酮浸出；而温度过高会增加其他物质的溶出，并可能破坏黄酮活性成分，因此确定提取温度为70 ℃。
2.1.5超声功率的影响当超声功率低于180 W时，癞葡萄黄酮提取率随超声功率的增加而增大；当超声功率高于180 W时，黄酮提取率反而下降（图5）。超声功率增大则空化作用大，总黄酮传质速率高；超声功率过高会使分子运动加剧、溶剂温度升高，从而破坏黄酮组分并增加其他杂质的溶出[11]，使癞葡萄黄酮提取率降低，因此确定超声功率为180 W。
2.2响应面优化提取工艺条件
2.2.1响应面试验设计与结果确定超声功率、液固比后，以乙醇体积分数（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）为变量，开展3因素3水平的响应面试验。本次提取工艺优化试验采取中心旋转组合设计，试验设计和结果见表2。
2.2.2回归模型的建立及方差分析以黄酮提取率为响应值，经回归拟合，各试验因子对响应值的影响可用回归方程表示：
Y=2.450 0.024X1 0.055X2 0.056X3-0.15X12-0.20X22-0.18X32 0.095X1X2-0.083X1X3-0.005X2X3。
对该回归方程进行方差分析及显著性评价（表3），此模型的P<0.000 1，表明响应面回归模型达到极显著水平；失拟项P值大于0.05，呈不显著，表明该方程拟合3个参数与黄酮提取率之间的关系是可行的；较高的R2值（0.998 6）进一步表明，试验方程式与实际数据之间具有非常好的拟合性。
回归方程系数的显著性分析表明，乙醇体积分数、提取温度、提取时间均对黄酮提取率具有显著性影响（P<0.001），影响效果大小依次为：提取时间>提取温度>乙醇体积分数。这3个因素的二次项X12、X22、X33对黄酮提取率也有显著性
影响（P<0.001）。
显著（P<0.001），表明乙醇体积分数与提取温度、乙醇体积分数与提取时间的交互作用对黄酮提取率的影响极显著；X2X3项的回归系数不显著（P= 0.197 3），表明提取温度与提取时间的交互作用对黄酮提取率的影响不显著。
提取条件对癞葡萄黄酮提取率影响的响应面见图6，其作用均为上凸曲面，表明本试验所选择的区域范围合理。随着乙醇体积分数、提取温度、提取时间的增大，黄酮提取率均呈先升高、后下降的变化趋势，表明乙醇体积分数、提取温度、提取时间对黄酮提取率的影响效果明显。通过分析计算得到最佳提取条件： 乙醇体积分数72%、 提取温度68 ℃、 提取时间34 min，此条件下黄酮提取率的理论值为2.53%。
为检验响应面分析法的可靠性，采用上述优化参数进行提取试验，实际测得癞葡萄黄酮提取率为2.54%，与理论预测值的相对误差为0.4%，表明采用响应面分析法优化得到的提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。
3结论
为探讨超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的工艺条件，首先通过单因素试验确定乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取表3回归模型方差分析及显著性检验
温度、超声功率的最适水平范围，再通过响应面分析法对乙醇体积分数、提取温度、提取时间进行优化。结果表明，超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数72%、提取温度 68 ℃、提取时间34 min，此条件下的黄酮提取率为253%。验证试验表明，黄酮提取率为2.54%，与理论值相符合。
参考文献：
[1]Yuan X Q，Gu X H，Tang J. Purification and characterrization of a hypoglycemic peptide from Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.[J]. Food Chemistry，2008，111：415-420.
[2]赵海雯，汤坚. 癞葡萄皂甙的降糖功效探索[J]. 食品科技，2007（12）：224-227.
[3]延玺，刘会青，邹永青，等. 黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J]. 有机化学，2008，28（9）：1534-1544.
[4]Zhou P，Li L P，Luo S Q，et al. Intestinal absorption of luteolin from peanut hull extract is more efficient than that from individual pure luteolin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（1）：296-300.
[5]Sousa F，Guebitz G M，Kokol V. Antimicrobial and antioxidant properties of chitosan enzymatically functionalized with flavonoids[J]. Process Biochemistry，2009，44（7）：749-756.
[6]高中松. 超声波提取黄花菜中总黄酮的工艺研究[J]. 中国林副特产，2006，82（3）：15-16.
[7]秦学会，阮美娟，赵龙，等. 响应面法优化超声波水提马齿苋黄酮的工艺[J]. 天津科技大学学报，2009，24（1）：19-21，25.
[8]罗仓学，张冬梅，胡兵，等. 响应曲面法优化超声波辅助提取苦荞总黄酮研究[J]. 粮食与油脂，2011（8）：17-21.
[9]Zhang Q A，Zhang Z Q，Yue X F，et al. Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction from autoclaved almond powder[J]. Food Chemistry，2009，116（2）：513-518.
[10]华景清，蔡健. 苦瓜总黄酮提取工艺[J]. 食品与发酵工业，2004，30（6）：131-134.
[11]董发明，白喜婷. 响应面法优化超声提取杜仲雄花中黄酮类化合物的工艺参数[J]. 食品科学，2008，29（8）：227-231.董玉兰，李书生，张丽萍，等. 生物型保鲜纸对中华寿桃的保鲜效果[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：343-345.
关键词：癞葡萄；黄酮；超声波辅助提取；响应面分析
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0340-03
收稿日期：2015-01-08
基金项目：河南省科技攻关计划（编号：142102110177）。
作者简介：袁晓晴（1977—），女，江苏泰州人，博士，副教授，主要从事农产品深加工研究。E-mail：yxq_yrd@163.com。癞葡萄（Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.）别称名金铃子，是葫芦科苦瓜属（Momordica）的栽培种之一，其果实呈纺锤状，果面呈不规则尖刺状，长约4 cm、宽约3 cm、单果质量25～30 g，未成熟果实呈浅绿色，成熟后呈金黄色。目前关于癞葡萄中活性肽、皂苷的研究较多[1-2]，而对癞葡萄中黄酮的研究较少。癞葡萄的果实、叶中均富含黄酮，黄酮是一种强抗氧化剂，具有清除自由基、抗衰老、抗炎抑菌、降低胆固醇含量等多种生理功效[3-5]。
提取植物中总黄酮的传统方法是热回流提取法。近年来，随着提取技术的不断发展，许多学者使用超声波辅助法分别从黄花菜[6]、马齿苋[7]、苦荞[8]等植物中提取总黄酮。超声波提取是利用超声波破碎细胞（空化）和强化传质（机械）作用，使溶剂分子渗透到组织细胞中与溶质分子充分接触，从而使细胞中的可溶成分更快释放出来，该方法具有提取速度快、得率高、对热不稳定物质破坏少等特点[9]。本研究通过单因素试验、响应面分析法优化超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的工艺，以期为癞葡萄黄酮的开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
癞葡萄采自南京市郊区，于70 ℃下烘干，冷却后粉碎过40目筛，置于干燥器中保存备用。芸香苷购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；无水乙醇（AR）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。
XA-1型高速万能粉碎机（江苏省姜堰市银河实验仪器厂产品），WFJ7200型可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司产品），KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司产品），SHZ-D型循环水式真空泵（郑州市长城科工贸有限公司产品）。
1.2试验方法
1.2.1标准曲线的制作精确称取芸香苷标准品0.01 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。分别准确吸取芸香苷标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀并静置6 min，加入0.5 mL质量分数为10%的Al（NO3）3溶液，摇匀并静置6 min，再加入 4.0 mL 质量分数为4%的NaOH溶液，最后添加70%乙醇至刻度，摇匀并静置15 min，于波长510 nm处测定吸光度，到得芸香苷浓度C（mg/mL）与吸光度D之间的回归方程：
C=0.085 3D 0.002 5，r2 =0.998 8。
1.2.2癞葡萄总黄酮的提取及测定精确称取脱脂后的癞葡萄粉1.0 g，加入一定体积分数的乙醇溶液，按相应条件进行超声波辅助提取，减压抽滤并将滤液移至烧杯中待测。吸取1.0 mL待测液于10 mL容量瓶中，按照“1.2.1”节的方法测定黄酮质量，黄酮提取率的计算公式为：
黄酮提取率=C×10×Vm×100%。
式中：C为总黄酮浓度（mg/mL）；m为癞葡萄粉质量（mg）；V为癞葡萄提取液体积（mL）。
1.2.3单因素试验分别考察乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时间、超声功率对癞葡萄黄酮提取率的影响。试验中各考察因素的设定水平分别为：乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%；液固比（mL ∶g）10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1；提取温度40、50、60、70、80、90 ℃；提取时间10、20、30、40、50 min；超声功率120、140、160、180、200 W。除考察因素外，其他因素的条件为：乙醇体积分数70%、液固比30 mL ∶1 g、超声功率180 W、提取温度70 ℃、提取时间30 min。
1.2.4响应面优化试验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、提取温度、提取时间为因素，采用Design-Expert软件的中心组合试验Box-Behnken设计3因素3水平（表1）的中心旋转组合试验。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1乙醇体积分数的影响当乙醇体积分数低于70%
时，癞葡萄黄酮提取率随乙醇体积分数的提高逐渐增大；当乙醇体积分数高于70%时，黄酮提取率反而下降（图1）。可见，乙醇体积分数为70%左右时，溶剂与溶质极性最相似；乙醇体积分数过高则叶绿素等脂溶性物质的溶出量增多，不利于黄酮的提纯[10]，因此确定乙醇体积分数为70%。
2.1.2液固比的影响当液固比小于30 mL ∶1 g时，癞葡萄黄酮提取率随液固比的增加显著提高；当液固比大于 30 mL ∶1 g 时，黄酮提取率的增幅降低（图2）。液固比过高将增加溶剂成本，并加重后续的浓缩和干燥工作，因此确定液固比为30 mL ∶1 g。 2.1.3提取时间的影响在提取的前30 min内，癞葡萄黄酮提取率随提取时间的延长显著提高；当提取时间继续延长时，黄酮提取率的增幅降低（图3）。为提高工作效率，确定提取时间为30 min。
2.1.4提取温度的影响当温度低于70 ℃时，癞葡萄黄酮提取率随温度的升高显著增大；当温度高于70 ℃时，黄酮提取率反而降低（图4）。温度升高会加剧溶剂和溶质分子运动，有利于黄酮浸出；而温度过高会增加其他物质的溶出，并可能破坏黄酮活性成分，因此确定提取温度为70 ℃。
2.1.5超声功率的影响当超声功率低于180 W时，癞葡萄黄酮提取率随超声功率的增加而增大；当超声功率高于180 W时，黄酮提取率反而下降（图5）。超声功率增大则空化作用大，总黄酮传质速率高；超声功率过高会使分子运动加剧、溶剂温度升高，从而破坏黄酮组分并增加其他杂质的溶出[11]，使癞葡萄黄酮提取率降低，因此确定超声功率为180 W。
2.2响应面优化提取工艺条件
2.2.1响应面试验设计与结果确定超声功率、液固比后，以乙醇体积分数（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）为变量，开展3因素3水平的响应面试验。本次提取工艺优化试验采取中心旋转组合设计，试验设计和结果见表2。
2.2.2回归模型的建立及方差分析以黄酮提取率为响应值，经回归拟合，各试验因子对响应值的影响可用回归方程表示：
Y=2.450 0.024X1 0.055X2 0.056X3-0.15X12-0.20X22-0.18X32 0.095X1X2-0.083X1X3-0.005X2X3。
对该回归方程进行方差分析及显著性评价（表3），此模型的P<0.000 1，表明响应面回归模型达到极显著水平；失拟项P值大于0.05，呈不显著，表明该方程拟合3个参数与黄酮提取率之间的关系是可行的；较高的R2值（0.998 6）进一步表明，试验方程式与实际数据之间具有非常好的拟合性。
回归方程系数的显著性分析表明，乙醇体积分数、提取温度、提取时间均对黄酮提取率具有显著性影响（P<0.001），影响效果大小依次为：提取时间>提取温度>乙醇体积分数。这3个因素的二次项X12、X22、X33对黄酮提取率也有显著性
影响（P<0.001）。
显著（P<0.001），表明乙醇体积分数与提取温度、乙醇体积分数与提取时间的交互作用对黄酮提取率的影响极显著；X2X3项的回归系数不显著（P= 0.197 3），表明提取温度与提取时间的交互作用对黄酮提取率的影响不显著。
提取条件对癞葡萄黄酮提取率影响的响应面见图6，其作用均为上凸曲面，表明本试验所选择的区域范围合理。随着乙醇体积分数、提取温度、提取时间的增大，黄酮提取率均呈先升高、后下降的变化趋势，表明乙醇体积分数、提取温度、提取时间对黄酮提取率的影响效果明显。通过分析计算得到最佳提取条件： 乙醇体积分数72%、 提取温度68 ℃、 提取时间34 min，此条件下黄酮提取率的理论值为2.53%。
为检验响应面分析法的可靠性，采用上述优化参数进行提取试验，实际测得癞葡萄黄酮提取率为2.54%，与理论预测值的相对误差为0.4%，表明采用响应面分析法优化得到的提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。
3结论
为探讨超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的工艺条件，首先通过单因素试验确定乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取表3回归模型方差分析及显著性检验
温度、超声功率的最适水平范围，再通过响应面分析法对乙醇体积分数、提取温度、提取时间进行优化。结果表明，超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数72%、提取温度 68 ℃、提取时间34 min，此条件下的黄酮提取率为253%。验证试验表明，黄酮提取率为2.54%，与理论值相符合。
参考文献：
[1]Yuan X Q，Gu X H，Tang J. Purification and characterrization of a hypoglycemic peptide from Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.[J]. Food Chemistry，2008，111：415-420.
[2]赵海雯，汤坚. 癞葡萄皂甙的降糖功效探索[J]. 食品科技，2007（12）：224-227.
[3]延玺，刘会青，邹永青，等. 黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J]. 有机化学，2008，28（9）：1534-1544.
[4]Zhou P，Li L P，Luo S Q，et al. Intestinal absorption of luteolin from peanut hull extract is more efficient than that from individual pure luteolin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（1）：296-300.
[5]Sousa F，Guebitz G M，Kokol V. Antimicrobial and antioxidant properties of chitosan enzymatically functionalized with flavonoids[J]. Process Biochemistry，2009，44（7）：749-756.
[6]高中松. 超声波提取黄花菜中总黄酮的工艺研究[J]. 中国林副特产，2006，82（3）：15-16.
[7]秦学会，阮美娟，赵龙，等. 响应面法优化超声波水提马齿苋黄酮的工艺[J]. 天津科技大学学报，2009，24（1）：19-21，25.
[8]罗仓学，张冬梅，胡兵，等. 响应曲面法优化超声波辅助提取苦荞总黄酮研究[J]. 粮食与油脂，2011（8）：17-21.
[9]Zhang Q A，Zhang Z Q，Yue X F，et al. Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction from autoclaved almond powder[J]. Food Chemistry，2009，116（2）：513-518.
[10]华景清，蔡健. 苦瓜总黄酮提取工艺[J]. 食品与发酵工业，2004，30（6）：131-134.
[11]董发明，白喜婷. 响应面法优化超声提取杜仲雄花中黄酮类化合物的工艺参数[J]. 食品科学，2008，29（8）：227-231.董玉兰，李书生，张丽萍，等. 生物型保鲜纸对中华寿桃的保鲜效果[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：343-345.