论文部分内容阅读
目的 克隆、表达伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(Pb QSOX)基因,纯化重组PbQSOX蛋白(rPbQSOX),并对其生物信息学特点和酶活性进行分析. 方法 分别采用BLAST、SMART、ClustalW对PbQSOX蛋白的信号肽、蛋白结构域、活性位点、同源性进行分析;通过BLAST和MAGA5构建PbQSOX的系统进化树;应用SWISS-MODEL对PbQSOX蛋白的三级结构进行预测.BALB/c雌性小鼠经腹腔感染伯氏疟原虫(1×107/鼠),于感染后第4天提取疟原虫基因组DNA.PCR扩增PbQSOX基因,经测序正确后,将目的片段连接至原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET30a(+)-PbQSOX.将鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,取菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析;应用镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化可溶性的rPbQSOX,并以三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)为酶反应底物分析rPbQSOX的酶活性. 结果 BLAST分析结果鉴定出了PbQSOX大部分其他物种的同源基因.多序列蛋白比对与蛋白结构域分析结果显示,PbQSOX蛋白含1个信号肽,存在Trx1、ψErv和Erv/ALR结构域,但完全缺失了TⅨ2结构域.PbQSOX蛋白含3个关键的CXXC活化基序(C为半胱氨酸Cys,X为任意氨基酸),即CPAC、CRNC和CNYC;采用MAGA5邻接法构建的系统进化树显示,PbQSOX与约氏疟原虫QSOX(PyQSOX)的亲缘关系最近;SWISS-MODEL同源建模法分析结果显示,用已知的布氏锥虫QSOX(TbQSOX)可预测PbQSOX蛋白的三级结构.PCR扩增PbQSOX基因,获得1 486 bp目的条带,经测序为PbQSOX基因序列;pET30a (+)-PbQSOX质粒经N如Ⅰ、HindⅢ双酶切与测序鉴定正确.SDS-PAGE和Western bloting分析结果显示,rPbQSOX重组蛋白主要以可溶形式表达,相对分子质量约59 000.纯化后的rPbQSOX对TCEP的催化活性为0.84±0.18,DTT的催化活性为0.78±0.14 (P＜ 0.01). 结论 PbQSOX蛋白为单Trx1结构域的伯氏疟原虫静息巯基氧化酶,构建、表达的rPbQSOX蛋白为可溶性蛋白,具有一定的静息巯基氧化酶催化活性.