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【摘要】 目的：探讨miR-195对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法：应用脂质体转染的方法，将miR-195 mimics转染入HT-29细胞，qRT-PCR检测转染后miR-195的表达，分别采用CCK-8法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况，qRT-PCR和Western blot检测转染后VEGFA mRNA和蛋白表达变化。结果：与NC组比较，miR-195 mimics转染组明显上调HT-29细胞miR-195的表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，下调VEGFA mRNA及蛋白表达，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：上调HT-29细胞的miR-195表达，可明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，其机制可能与抑制其靶基因VEGFA表达相关。
【关键词】 微小RNA； 大肠癌； 血管内皮生长因子A； 增殖； 凋亡
【Abstract】 Objective： To investigate the effect of miR-195 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cell line HT-29 and its mechanism.Method： MiR-195 mimics was transfected into HT-29 cells by lipofectamine 2000. The miR-195 expression was measured by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （qRT-PCR），cell proliferation and apoptosis were respectively evaluated by CCK-8 assay and flow cytometry.VEGFA mRNA and protein were assessed by qRT-PCR and Western blot. Result：miR-195 mimics group was significantly increased miR-195 expression in HT-29 cells， inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis and downregulation of mRNA VEGFA and protein expression， compared with the NC group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of miR-195 in HT-29 cells may significantly suppress cells proliferation and induce cells apoptosis， probably via downregulating its target gene VEGFA expression.
【Key words】 MicroRNA； Colorectal cancer； VEGFA； Proliferation； Apoptosis
First-author’s address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.008
大肠癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，发病率逐渐增高，并呈现出年轻化的趋势，严重威胁人类健康。癌基因和抑癌基因及信号通路的调控、表达失常，导致肿瘤的发生。近年来，越来越多的研究者开始关注微小RNA（microRNA，miR）在大肠癌发生发展中的作用。miRNAs是一类具有调控功能的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的特定位点部分和完全结合，导致mRNA的降解和/或阻碍其翻译[1]。研究发现，多种肿瘤存在异常的miRNAs表达谱[2-4]。其中，与正常大肠组织相比，miR-195在CRC组织中表达降低，但miR-195在CRC中的作用及其机制尚未完全明确[5-6]。本实验通过上调HT-29细胞的miR-195表达，初步探讨miR-195在CRC中的作用及机制，现将其具体报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 HT-29细胞株（中科院上海细胞库）于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。人miR-195 模拟物（miR-195 mimics）、miR-195 mimics阴性对照（miR-195 mimics NC）购于广州锐博生物公司。转染前将HT-29细胞接种至6孔或12孔培养板，待细胞密度达60%～70%时进行转染。按miRNA mimics转染操作说明书混合Opti-MEM I培养基、miR-195 mimics或NC和lipofectamine 2000，将混合物加入铺好的6孔板中，放入37 ℃，5% CO2 的培养箱中培养6 h后，换为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养至所需时间，收集细胞进行后续各项相关检测。实验分为两组，miR-195 mimics转染组：转染miR-195 mimics（终浓度100 nmol/L）；NC组：转染miR-195 mimics NC（终浓度100 nmol/L）。
1.2 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测miR-195和VEGFA mRNA的表达 各组细胞转染后48 h，用TRIzol提取总RNA。按RT-PCR试剂盒（Takara）说明书进行miR-195和VEGFA的逆转录及PCR反应。分别以U6 snRNA和β-actin作为内参。应用罗氏LightCycler 480型PCR仪进行定量PCR分析。miR-195上游引物：5’-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；VEGFA上游引物：5’-GAGCAGCGAAAGCGACAG-3’，VEGFA下游引物：5’-CTCCGAAGCGAGAACAGC-3’；β-actin上游引物：5’-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3’，β-actin下游引物：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’。反应结束后得到各样本miR-195和U6的循环数（Ct值），根据2-△Ct法计算miR-195的相对表达量，实验重复3次。 1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 HT-29细胞接种于96孔培养板，培养液体积200 μL，按上述分组转染，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8（Dojindo公司），37 ℃继续培养2 h后于酶标仪上450 nm测定各孔吸光度（A450）。每个时间点设3个复孔，实验重复3次，根据时间和吸光度值绘制增殖曲线。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 HT-29细胞接种于12孔培养板，分别转染miR-195 mimics和NC，培养48 h后收集细胞，PBS洗涤后依次分别加入Annexin V-FITC（碧云天公司）室温避光孵育10 min和碘化丙啶（PI）（碧云天公司）冰浴避光孵育30 min，上机检测，实验重复3次。
1.5 Western blot检测VEGFA蛋白的表达 转染72 h后，用Western及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，每个泳道上样40 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离，电转到PVDF膜上，5%牛奶封闭非特异位点，抗VEGFA抗体（Santa Cruz，1∶500）4 ℃孵育过夜。相应的二抗（1∶1000）室温孵育1 h，暗室显影，以Tubulin作为内参，以VEGFA蛋白与Tubulin蛋白条带的光密度比值计算VEGFA蛋白的相对含量，实验重复3次。
1.6 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组细胞miR-195表达比较 miR-195 mimics转染组的miR-195表达水平明显高于NC组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图1。
2.2 两组细胞增殖情况比较 CCK-8检测两组转染后细胞增殖情况，miR-195 mimics转染组于48、72 h增殖率较相应时间点的NC组明显下降，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图2。
2.3 两组细胞凋亡情况比较 转染miR-195 mimics至HT-29细胞，培养48 h后行流式细胞仪检测，miR-195 mimics转染组凋亡细胞较NC组明显增加，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图3～4。
2.4 两组细胞的VEGFA表达 qRT-PCR和Western blot检测显示，miR-195 mimics转染组细胞VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均较NC组明显降低，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图5。
3 讨论
目前已有研究证实miRNAs在大肠癌的诊断、预后判断及治疗效果预测中均发挥作用[7-9]。另外，miRNAs在癌前病变发展，对大肠癌细胞生物学行为的影响，新生血管生成中的作用等基础领域研究亦不断有新的进展[10-12]。研究发现，miR-195在多种肿瘤的发生发展有关。Guo等[13]报道与正常组织比较，miR-195在非小细胞肺癌组织和细胞株的表达明显下调，过表达miR-195能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。miR-195通过作用于其靶基因脂肪酸合酶（FASN），抑制骨肉瘤细胞的转移和侵袭[14]。Yang等[15]亦报道，miR-195在乳腺癌细胞株和多药耐药的乳腺癌组织中均表达下降，上调miR-195的表达可以抑制乳腺癌细胞的活力，促进其凋亡，增加其对阿霉素治疗的敏感性。miR-195在肾上腺皮质癌患者的癌组织和血清中表达水平均降低，其血清低表达与较短的无复发生存和较短的总体生存有关，对于肾上腺皮质癌患者的预后预测有一定的价值[16]。多个研究显示，与正常组织比较，miR-195在CRC组织表达降低[5-6]。在本研究中，笔者转染miR-195 mimics使大肠癌细胞HT-29过表达miR-195，显示细胞增殖减少、凋亡增多，提示miR-195在CRC中发挥促凋亡的作用，与前面研究一致。
VEGFA是肿瘤血管生成的主要刺激因子之一，通过与其受体VEGFR-2作用，促进内皮细胞的增殖、侵袭、转移。VEGFA在CRC组织中表达上调，高表达的VEGFA与肿瘤进展及侵袭相关，是生存的一个重要预测因素[17]。使用VEGFA shRNA抑制RKO大肠癌细胞的VEGFA表达后，可使细胞周期停滞，减弱细胞增殖和侵袭能力，裸鼠种植瘤生长延缓[18]。Tai等[19]用siRNA抑制大肠癌Volo细胞的VEGFA表达后，亦可以抑制细胞增殖和转移，促进凋亡。于多种大肠癌细胞株，如SW620、HCT-116上使用RNAi技术干扰VEGFA表达也可得到类似的结果[20-21]。上述研究表明，VEGFA与大肠癌细胞的生物学特性相关。笔者通过电子信息学网站预测发现VEGFA是miR-195潜在靶基因之一。转染miR-195 mimics后，与阴性对照组相比，VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均明显下调，说明在CRC中miR-195可能通过抑制VEGFA的表达，影响细胞的增殖和凋亡，可能是其参与肿瘤发生发展的机制之一。
综上所述，miR-195在CRC中发挥着类似抑癌基因的作用，随着研究的不断深入，阐明miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用机制，以miRNA作为诊断和治疗的靶点，具有巨大的潜在价值。
参考文献
[1] Liu R，Yang M，Meng Y，et al.Tumor-suppressive function of mir-139-5p in esophageal squamous cell carcinoma[J].PLoS One，2013，8（10）：e77 068.
[2] Collins A L，Wojcik S，Liu J，et al.A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma[J].Ann Surg Oncol，2014，21（1）：133-138. [3] Yang O，Huang J，Lin S.Regulatory effects of miRNA on gastric cancer cells[J].Oncol Lett，2014，8（2）：651-656.
[4] Li X，Shi Y，Yin Z，et al.An eight-miRNA signature as a potential biomarker for predicting survival in lung adenocarcinoma[J].J Transl Med，2014，12（4）：159.
[5] Corté H，Manceau G，Blons H，et al.MicroRNA and colorectal cancer[J].Dig Liver Dis，2012，44（3）：195-200.
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[7] Komatsu S，Ichikawa D，Takeshita H，et al.Circulating miR-18a： a sensitive cancer screening biomarker in human cancer[J].In Vivo，2014，28（3）：293-297.
[8] Chu D，Zheng J，Li J，et al.MicroRNA-630 is a prognostic marker for patients with colorectal cancer[J].Tumour Biol，2014，35（10）：9787-9792.
[9] Schou J V，Rossi S，Jensen B V，et al.miR-345 in metastatic colorectal cancer： a non-invasive biomarker for clinical outcome in non-kras mutant patients treated with 3rd line cetuximab and irinotecan[J].PLoS One，2014，9（6）：e99 886.
[10] Ueda Y，Ando T，Nanjo S，et al.DNA methylation of microrna-124a is a potential risk marker of colitis-associated cancer in patients with ulcerative colitis[J].Dig Dis Sci，2014，59（10）：2444-2451.
[11] Wang L，Qian L，Li X，et al.MicroRNA-195 inhibits colorectal cancer cell proliferation，colony-formation and invasion through targeting CARMA3[J].Mol Med Rep，2014，10（1）：473-478.
[12] Zhang Y，Wang X，Xu B，et al.Epigenetic silencing of miR-126 contributes to tumor invasion and angiogenesis in colorectal cancer[J].Oncol Rep，2013，30（4）：1976-1984.
[13] Guo H，Li W，Zheng T，et al.miR-195 Targets HDGF to inhibit proliferation and invasion of NSCLC cells[J].Tumour Biol，2014，35（9）：8861-8866.
[14] Mao J H，Zhou R P，Peng A F，et al.microRNA-195 suppresses osteosarcoma cell invasion and migration in vitro by targeting FASN[J].Oncol Lett，2012，4（5）：1125-1129.
[15] Yang G，Wu D，Zhu J，et al.Upregulation of miR-195 increases the sensitivity of breast cancer cells to Adriamycin treatment through inhibition of Raf-1[J].Oncol Rep，2013，30（2）：877-889.
[16] Chabre O，Libé R，Assie G，et al.Serum miR-483-5p and miR-195 are predictive of recurrence risk in adrenocortical cancer patients[J].Endocr Relat Cancer，2013，20（4）：579-594.
[17] Ishigami S I，Arii S，Furutani M，et al.Predictive value of vascular endothelial growth factor （VEGF） in metastasis and prognosis of human colorectal cancer[J].Br J Cancer，1998，78（10）：1379-1384.
[18] Qiu J F，Zhang Z Q，Wang Y，et al.Lentivirus-mediated RNAi knockdown of VEGFA in RKO colorectal cancer cells decreases tumor formation and growth in vitro and in vivo[J].Int J Clin Exp Pathol，2012，5（4）：290-298.
[19] Tai J，Wang G，Liu T，et al.Effects of siRNA targeting c-myc and vegf on human colorectal cancer volo cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2012，26（12）：499-505.
[20] Wang S，Liu H，Ren L，et al.Inhibiting colorectal carcinoma growth and metastasis by blocking the expression of VEGF using RNA interference[J].Neoplasia，2008，10（4）：399-407.
[21] Yin Y，Cao L Y，Wu W Q，et al.locking effects of siRNA on VEGF expression in human colorectal cancer cells[J].World J Gastroenterol，2010，16（9）：1086-1092.
（收稿日期：2015-08-20） （本文编辑：周亚杰）
【关键词】 微小RNA； 大肠癌； 血管内皮生长因子A； 增殖； 凋亡
【Abstract】 Objective： To investigate the effect of miR-195 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cell line HT-29 and its mechanism.Method： MiR-195 mimics was transfected into HT-29 cells by lipofectamine 2000. The miR-195 expression was measured by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （qRT-PCR），cell proliferation and apoptosis were respectively evaluated by CCK-8 assay and flow cytometry.VEGFA mRNA and protein were assessed by qRT-PCR and Western blot. Result：miR-195 mimics group was significantly increased miR-195 expression in HT-29 cells， inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis and downregulation of mRNA VEGFA and protein expression， compared with the NC group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of miR-195 in HT-29 cells may significantly suppress cells proliferation and induce cells apoptosis， probably via downregulating its target gene VEGFA expression.
【Key words】 MicroRNA； Colorectal cancer； VEGFA； Proliferation； Apoptosis
First-author’s address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.008
大肠癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，发病率逐渐增高，并呈现出年轻化的趋势，严重威胁人类健康。癌基因和抑癌基因及信号通路的调控、表达失常，导致肿瘤的发生。近年来，越来越多的研究者开始关注微小RNA（microRNA，miR）在大肠癌发生发展中的作用。miRNAs是一类具有调控功能的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的特定位点部分和完全结合，导致mRNA的降解和/或阻碍其翻译[1]。研究发现，多种肿瘤存在异常的miRNAs表达谱[2-4]。其中，与正常大肠组织相比，miR-195在CRC组织中表达降低，但miR-195在CRC中的作用及其机制尚未完全明确[5-6]。本实验通过上调HT-29细胞的miR-195表达，初步探讨miR-195在CRC中的作用及机制，现将其具体报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 HT-29细胞株（中科院上海细胞库）于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。人miR-195 模拟物（miR-195 mimics）、miR-195 mimics阴性对照（miR-195 mimics NC）购于广州锐博生物公司。转染前将HT-29细胞接种至6孔或12孔培养板，待细胞密度达60%～70%时进行转染。按miRNA mimics转染操作说明书混合Opti-MEM I培养基、miR-195 mimics或NC和lipofectamine 2000，将混合物加入铺好的6孔板中，放入37 ℃，5% CO2 的培养箱中培养6 h后，换为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养至所需时间，收集细胞进行后续各项相关检测。实验分为两组，miR-195 mimics转染组：转染miR-195 mimics（终浓度100 nmol/L）；NC组：转染miR-195 mimics NC（终浓度100 nmol/L）。
1.2 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测miR-195和VEGFA mRNA的表达 各组细胞转染后48 h，用TRIzol提取总RNA。按RT-PCR试剂盒（Takara）说明书进行miR-195和VEGFA的逆转录及PCR反应。分别以U6 snRNA和β-actin作为内参。应用罗氏LightCycler 480型PCR仪进行定量PCR分析。miR-195上游引物：5’-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；VEGFA上游引物：5’-GAGCAGCGAAAGCGACAG-3’，VEGFA下游引物：5’-CTCCGAAGCGAGAACAGC-3’；β-actin上游引物：5’-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3’，β-actin下游引物：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’。反应结束后得到各样本miR-195和U6的循环数（Ct值），根据2-△Ct法计算miR-195的相对表达量，实验重复3次。 1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况 HT-29细胞接种于96孔培养板，培养液体积200 μL，按上述分组转染，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8（Dojindo公司），37 ℃继续培养2 h后于酶标仪上450 nm测定各孔吸光度（A450）。每个时间点设3个复孔，实验重复3次，根据时间和吸光度值绘制增殖曲线。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 HT-29细胞接种于12孔培养板，分别转染miR-195 mimics和NC，培养48 h后收集细胞，PBS洗涤后依次分别加入Annexin V-FITC（碧云天公司）室温避光孵育10 min和碘化丙啶（PI）（碧云天公司）冰浴避光孵育30 min，上机检测，实验重复3次。
1.5 Western blot检测VEGFA蛋白的表达 转染72 h后，用Western及IP细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，每个泳道上样40 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离，电转到PVDF膜上，5%牛奶封闭非特异位点，抗VEGFA抗体（Santa Cruz，1∶500）4 ℃孵育过夜。相应的二抗（1∶1000）室温孵育1 h，暗室显影，以Tubulin作为内参，以VEGFA蛋白与Tubulin蛋白条带的光密度比值计算VEGFA蛋白的相对含量，实验重复3次。
1.6 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组细胞miR-195表达比较 miR-195 mimics转染组的miR-195表达水平明显高于NC组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图1。
2.2 两组细胞增殖情况比较 CCK-8检测两组转染后细胞增殖情况，miR-195 mimics转染组于48、72 h增殖率较相应时间点的NC组明显下降，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图2。
2.3 两组细胞凋亡情况比较 转染miR-195 mimics至HT-29细胞，培养48 h后行流式细胞仪检测，miR-195 mimics转染组凋亡细胞较NC组明显增加，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图3～4。
2.4 两组细胞的VEGFA表达 qRT-PCR和Western blot检测显示，miR-195 mimics转染组细胞VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均较NC组明显降低，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图5。
3 讨论
目前已有研究证实miRNAs在大肠癌的诊断、预后判断及治疗效果预测中均发挥作用[7-9]。另外，miRNAs在癌前病变发展，对大肠癌细胞生物学行为的影响，新生血管生成中的作用等基础领域研究亦不断有新的进展[10-12]。研究发现，miR-195在多种肿瘤的发生发展有关。Guo等[13]报道与正常组织比较，miR-195在非小细胞肺癌组织和细胞株的表达明显下调，过表达miR-195能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。miR-195通过作用于其靶基因脂肪酸合酶（FASN），抑制骨肉瘤细胞的转移和侵袭[14]。Yang等[15]亦报道，miR-195在乳腺癌细胞株和多药耐药的乳腺癌组织中均表达下降，上调miR-195的表达可以抑制乳腺癌细胞的活力，促进其凋亡，增加其对阿霉素治疗的敏感性。miR-195在肾上腺皮质癌患者的癌组织和血清中表达水平均降低，其血清低表达与较短的无复发生存和较短的总体生存有关，对于肾上腺皮质癌患者的预后预测有一定的价值[16]。多个研究显示，与正常组织比较，miR-195在CRC组织表达降低[5-6]。在本研究中，笔者转染miR-195 mimics使大肠癌细胞HT-29过表达miR-195，显示细胞增殖减少、凋亡增多，提示miR-195在CRC中发挥促凋亡的作用，与前面研究一致。
VEGFA是肿瘤血管生成的主要刺激因子之一，通过与其受体VEGFR-2作用，促进内皮细胞的增殖、侵袭、转移。VEGFA在CRC组织中表达上调，高表达的VEGFA与肿瘤进展及侵袭相关，是生存的一个重要预测因素[17]。使用VEGFA shRNA抑制RKO大肠癌细胞的VEGFA表达后，可使细胞周期停滞，减弱细胞增殖和侵袭能力，裸鼠种植瘤生长延缓[18]。Tai等[19]用siRNA抑制大肠癌Volo细胞的VEGFA表达后，亦可以抑制细胞增殖和转移，促进凋亡。于多种大肠癌细胞株，如SW620、HCT-116上使用RNAi技术干扰VEGFA表达也可得到类似的结果[20-21]。上述研究表明，VEGFA与大肠癌细胞的生物学特性相关。笔者通过电子信息学网站预测发现VEGFA是miR-195潜在靶基因之一。转染miR-195 mimics后，与阴性对照组相比，VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均明显下调，说明在CRC中miR-195可能通过抑制VEGFA的表达，影响细胞的增殖和凋亡，可能是其参与肿瘤发生发展的机制之一。
综上所述，miR-195在CRC中发挥着类似抑癌基因的作用，随着研究的不断深入，阐明miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用机制，以miRNA作为诊断和治疗的靶点，具有巨大的潜在价值。
参考文献
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[8] Chu D，Zheng J，Li J，et al.MicroRNA-630 is a prognostic marker for patients with colorectal cancer[J].Tumour Biol，2014，35（10）：9787-9792.
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[12] Zhang Y，Wang X，Xu B，et al.Epigenetic silencing of miR-126 contributes to tumor invasion and angiogenesis in colorectal cancer[J].Oncol Rep，2013，30（4）：1976-1984.
[13] Guo H，Li W，Zheng T，et al.miR-195 Targets HDGF to inhibit proliferation and invasion of NSCLC cells[J].Tumour Biol，2014，35（9）：8861-8866.
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[15] Yang G，Wu D，Zhu J，et al.Upregulation of miR-195 increases the sensitivity of breast cancer cells to Adriamycin treatment through inhibition of Raf-1[J].Oncol Rep，2013，30（2）：877-889.
[16] Chabre O，Libé R，Assie G，et al.Serum miR-483-5p and miR-195 are predictive of recurrence risk in adrenocortical cancer patients[J].Endocr Relat Cancer，2013，20（4）：579-594.
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（收稿日期：2015-08-20） （本文编辑：周亚杰）