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摘要：目的：建立用于小家鼠X染色体性发育相关候选基因筛选的一种基于荧光通用引物竞争性聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）定量技术。方法：在小家鼠X染色体上与性发育启动相关的数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）区段内选择10个候选基因，应用竞争性PCR技术，建立基于荧光通用引物竞争性PCR方案。结果10个候选基因在近交系品系C57BL/6J（B6）和C3H/HeJ（C3）的下丘脑中无表达量差异。结论：本研究，通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-PCR）技术验证竞争性PCR方案的检测结果准确、可靠。明确10个候选基因与近交系品系B6和C3的性发育启动差异无关。
关键词：通用荧光引物；竞争性PCR；QTL；性发育
中图分类号：Q3-3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-06-0042-3
M.Becker-Andre和K.Hahlbrock[1]首次提出PCR辅助转录本滴定分析的一种mRNA定量方法。随后，Gilliand [2]等建立一种竞争性PCR方案，使用合适的内参照模板与待测核酸一起竞争参与 PCR 反应，最终实现mRNA的定量。因竞争性PCR技术是利用待测cDNA模板与内参照模板共用同一对引物，实现竞争性扩增，因此，竞争性PCR技术是一种较为可靠的mRNA定量方法。
目前具有多种mRNA定量检测技术，常见为RT-PCR和cDNA芯片技术：RT-PCR稳定性好、灵敏度高，具有 Northern blot等技术所不具有的定量分析能力[3]，其缺点为检测通量小，样本费用高；虽然cDNA芯片技术拥有较高的通量[4]，但其准确度低，成本较高。[5]因此，本研究应用稳定、低廉、准确的竞争性PCR技术检测候选基因的表达量差异。
本研究，使用已知浓度的质粒作为竞争性模板，针对已知近交系品系B6和C3性发育启动时间差异相关QTL区段[6]中10个候选基因，建立基于荧光通用引物的竞争性PCR方案。进一步利用此竞争性PCR方案，特异性检测18日龄B6和C3两近交系小鼠下丘脑组织中的mRNA表达水平，旨在探寻影响性发育启动时间的可能机制。
1 材料和方法
1.1 小鼠饲养和样本采集
B6和C3两个近交系实验小鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司[SYXK（沪）2007-0005]。动物实验遵守中国1988年实验动物管理条例。实验在东华大学生物科学与技术研究所屏障动物实验设施进行[SYXK（沪）2008-0059]。两品系雌鼠均为18日龄，每组3窝，每窝收集3只。取样前，禁食4h，上午十点颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出下丘脑样本，液氮速冻后-80℃保存备用。
1.2 RNA抽提和反转录
采用RNAiso Plus（Takara）法抽提18日龄B6和C3雌鼠丘脑总RNA。[7]用DNaseI（Invitrogen）去除基因组DNA污染。用Nanodrop 2000仪器（Thermal）测定每个RNA样本浓度与纯度，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定提取RNA的完整性，RNA再按照天根反转录说明书反转录为cDNA。
1.3 引物设计
10个候选基因的mRNA序列信息来源于NCBI。所有引物用 Primer3在线软件（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3）设计，并由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.4 竞争性模板的制备
1.5 PCR
1.6 Real-Time PCR验证
2 结果与分析
2.1 实验样本检测结果分析
3 讨论
基因表达的多重定量检测方法很多，从原理上可分为基于多重 PCR 的、基于杂交的、基于液态分析的和基于测序技术的，每种方法都各有利弊，使用途径不同，侧重点也不同，难以一言以概之。[9]在本研究中，我们结合通用荧光引物，多重竞争性PCR反应创建一个中通量基因表达分析技术。在同一管PCR反应中，由带有通用荧光引物接头的嵌合特异引物完成整个PCR反应，CDNA模板及多3bp质粒竞争性模板在同一管PCR中具有相同的引物扩增效率。[10，11]PCR产物通过3730测序仪进行测序分离，从而准确的检测出两种样本的峰高。[11]
该技术的核心是竞争性PCR。在竞争性PCR体系中，待测模板和内对照在同一反应管中扩增，有效的消除了“管间差异”带来的偏差。因为该技术是基于PCR的定量技术，所以具有很高的灵敏度，可以精确定量1ng总mRNA中1pg的特异靶序列，可定量10个细胞内的特异mRNA。本实验还引入了通用荧光引物，很大程度上降低了实验成本。通过调节退火温度，PCR被有效的分为两个阶段。在第二个阶段，PCR反应在通用引物的引导下，可以实现所有位点的同步扩增，利于多重PCR的进行。[12-14]本实验建立一套制备内对照的方案。该方案主要优点是实验操作简单、一次性制备、引入突变可控、成本低等。但第一次制备时步骤较为繁琐，要经 PCR、TA克隆、测序、酶切、纯化等步骤。在本检测技术中，是一个较大的工作量。竞争性PCR是本技术的核心，而引物设计又是PCR的核心。因此要实现基因表达检测快速、准确的检测，引物设计是至关重要的一环。嵌合特异引物要求特异高、无严重的二级结构、确保一定的退火温度。由于本技术方法引入通用荧光引物，所以要嚴格避免PCR产物的污染，否则导致实验结果不准确。本文还引入看家基因HPRT[15]，研究显示，该看家基因是细胞结构维持和基本代谢所需的基因，在细胞与组织中呈组成型表达，其表达水平在各种环境下均恒定。[16、17] 本研究以18日龄C57BL/6J和C3H/HeJ小鼠的下丘脑组织为样本，利用本技术检测了10个基因的表达情况。结果发现这10个基因表达量在两品系老鼠间并无表达量的差异。
参考文献
[1] Becket-Andre M.Hahlbrock K.Absolute mRNA quantification using the polymerase chain reaction（PCR）.A novel approach by PCR aided transcript titration assay（PATTY）.Nucleic Acids Res.1989，17：9437-9446.
[2] Gilliand G，Perrin S，Blanchard K.Analysis of cytokine mRNA and DNA：detection and quantification by competitive polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：2729～2729.
[3] Golub TR，Slonim DK，Tamayo P，et al.Molecular classification of cancer：class discovery and class prediction by gene expression monitoring.Science，1999，286（5439）：531-537.
[4] Schulze A，Downward J. Navigating gene expression using microarrays-a technology review.Nat Cell Biol，2001，3（1）：190-195.
[5] Wong ML，Medrano JF.Real-time PCR for mRNA quantitation.BioTech，2005，39（1）：75-85.
[6] Zhu W，Xiao J，et al.A dominant X-linked QTL regulating pubertal timing in mice found by whole genome scanning and modified interval-specific congenic strain analysis.PLos ONE，2008，3（8）：e3021.
[7] Simms D，Cizdziel PE，Chomczynski P.TRIzol：A new reagent for optimal single-step isolation of RNA. Focus，1993，15（4）：99-102.
[8] Dong Jin.Changes of WBC and Cytokine Expression After Long-term Exercise.Lab eled Immunoassays& Clin Med，Oct.2010，Vol 17，No.5.
[9] Bonetta L.Gene expression：one size does not fit all.Nat Methods， 2006，3（5）：401-408.
[10]Zentilin L，Giacca M （2007） Competitive PCR for precise nucleic acid quantification.Nat Protoc 2（9）：2092–2104.
[11]Chen YL，Chang YS，Chang JG，Wu SM （2009） Genotyping of single nucleotide polymorphism in MDM2 genes by universal fluorescence primer PCR and capillary electrophoresis.Anal Bioanal Chem 394（5）：1291–1297.
[12] McCulloch K，Choong CS，Hurley DM. An evaluation of competitor type and size for use in the determination of mRNA by competitive PCR.PCR Methods Appl，1995，4（4）：219-226.
[13] Kobayashi H，Takemura Y， Kawai Y，et al. Quantitative analysis of human multidrug resistance 1 （MDR1） gene expression by nonisotopic competitive reverse transcriptase polymerase chain reaction assay.J Lab Clin Med， 1998，11（5）：258-266.
[14] Sestini R，Orlando C，Zentilin L，et al.Gene amplification for c-erbB-2， c-myc，epidermal growth factor receptor， int-2，and N-myc measured by quantitative PCR with a multiple competitor template.Clin Chem，1995，41（6）：826-832.
[15] De Kok JB，Roelofs RW，Giesendorf BA，et a1. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues：comparison of 13 endogenous control genes [J].Lab Invest，2005，85（1）：154-159.
[16] Olsvik PA，Lie KK，Jordal AE，et a1.Evaluation of potential reference genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon[J].BMC Mol Biol，2005，6：21.
[17] Schmittgen TD，Zakrajsek BA.Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression：validation by real-time，quantitative RT-PCR [J].J Biochem Biophys Methods，2000，46（1-2）：69-81.
作者簡介：王丹（1988-），女，汉族，江苏泰州人，东华大学研究生，研究方向：小鼠性发育。
关键词：通用荧光引物；竞争性PCR；QTL；性发育
中图分类号：Q3-3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-06-0042-3
M.Becker-Andre和K.Hahlbrock[1]首次提出PCR辅助转录本滴定分析的一种mRNA定量方法。随后，Gilliand [2]等建立一种竞争性PCR方案，使用合适的内参照模板与待测核酸一起竞争参与 PCR 反应，最终实现mRNA的定量。因竞争性PCR技术是利用待测cDNA模板与内参照模板共用同一对引物，实现竞争性扩增，因此，竞争性PCR技术是一种较为可靠的mRNA定量方法。
目前具有多种mRNA定量检测技术，常见为RT-PCR和cDNA芯片技术：RT-PCR稳定性好、灵敏度高，具有 Northern blot等技术所不具有的定量分析能力[3]，其缺点为检测通量小，样本费用高；虽然cDNA芯片技术拥有较高的通量[4]，但其准确度低，成本较高。[5]因此，本研究应用稳定、低廉、准确的竞争性PCR技术检测候选基因的表达量差异。
本研究，使用已知浓度的质粒作为竞争性模板，针对已知近交系品系B6和C3性发育启动时间差异相关QTL区段[6]中10个候选基因，建立基于荧光通用引物的竞争性PCR方案。进一步利用此竞争性PCR方案，特异性检测18日龄B6和C3两近交系小鼠下丘脑组织中的mRNA表达水平，旨在探寻影响性发育启动时间的可能机制。
1 材料和方法
1.1 小鼠饲养和样本采集
B6和C3两个近交系实验小鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司[SYXK（沪）2007-0005]。动物实验遵守中国1988年实验动物管理条例。实验在东华大学生物科学与技术研究所屏障动物实验设施进行[SYXK（沪）2008-0059]。两品系雌鼠均为18日龄，每组3窝，每窝收集3只。取样前，禁食4h，上午十点颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出下丘脑样本，液氮速冻后-80℃保存备用。
1.2 RNA抽提和反转录
采用RNAiso Plus（Takara）法抽提18日龄B6和C3雌鼠丘脑总RNA。[7]用DNaseI（Invitrogen）去除基因组DNA污染。用Nanodrop 2000仪器（Thermal）测定每个RNA样本浓度与纯度，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定提取RNA的完整性，RNA再按照天根反转录说明书反转录为cDNA。
1.3 引物设计
10个候选基因的mRNA序列信息来源于NCBI。所有引物用 Primer3在线软件（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3）设计，并由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.4 竞争性模板的制备
1.5 PCR
1.6 Real-Time PCR验证
2 结果与分析
2.1 实验样本检测结果分析
3 讨论
基因表达的多重定量检测方法很多，从原理上可分为基于多重 PCR 的、基于杂交的、基于液态分析的和基于测序技术的，每种方法都各有利弊，使用途径不同，侧重点也不同，难以一言以概之。[9]在本研究中，我们结合通用荧光引物，多重竞争性PCR反应创建一个中通量基因表达分析技术。在同一管PCR反应中，由带有通用荧光引物接头的嵌合特异引物完成整个PCR反应，CDNA模板及多3bp质粒竞争性模板在同一管PCR中具有相同的引物扩增效率。[10，11]PCR产物通过3730测序仪进行测序分离，从而准确的检测出两种样本的峰高。[11]
该技术的核心是竞争性PCR。在竞争性PCR体系中，待测模板和内对照在同一反应管中扩增，有效的消除了“管间差异”带来的偏差。因为该技术是基于PCR的定量技术，所以具有很高的灵敏度，可以精确定量1ng总mRNA中1pg的特异靶序列，可定量10个细胞内的特异mRNA。本实验还引入了通用荧光引物，很大程度上降低了实验成本。通过调节退火温度，PCR被有效的分为两个阶段。在第二个阶段，PCR反应在通用引物的引导下，可以实现所有位点的同步扩增，利于多重PCR的进行。[12-14]本实验建立一套制备内对照的方案。该方案主要优点是实验操作简单、一次性制备、引入突变可控、成本低等。但第一次制备时步骤较为繁琐，要经 PCR、TA克隆、测序、酶切、纯化等步骤。在本检测技术中，是一个较大的工作量。竞争性PCR是本技术的核心，而引物设计又是PCR的核心。因此要实现基因表达检测快速、准确的检测，引物设计是至关重要的一环。嵌合特异引物要求特异高、无严重的二级结构、确保一定的退火温度。由于本技术方法引入通用荧光引物，所以要嚴格避免PCR产物的污染，否则导致实验结果不准确。本文还引入看家基因HPRT[15]，研究显示，该看家基因是细胞结构维持和基本代谢所需的基因，在细胞与组织中呈组成型表达，其表达水平在各种环境下均恒定。[16、17] 本研究以18日龄C57BL/6J和C3H/HeJ小鼠的下丘脑组织为样本，利用本技术检测了10个基因的表达情况。结果发现这10个基因表达量在两品系老鼠间并无表达量的差异。
参考文献
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[12] McCulloch K，Choong CS，Hurley DM. An evaluation of competitor type and size for use in the determination of mRNA by competitive PCR.PCR Methods Appl，1995，4（4）：219-226.
[13] Kobayashi H，Takemura Y， Kawai Y，et al. Quantitative analysis of human multidrug resistance 1 （MDR1） gene expression by nonisotopic competitive reverse transcriptase polymerase chain reaction assay.J Lab Clin Med， 1998，11（5）：258-266.
[14] Sestini R，Orlando C，Zentilin L，et al.Gene amplification for c-erbB-2， c-myc，epidermal growth factor receptor， int-2，and N-myc measured by quantitative PCR with a multiple competitor template.Clin Chem，1995，41（6）：826-832.
[15] De Kok JB，Roelofs RW，Giesendorf BA，et a1. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues：comparison of 13 endogenous control genes [J].Lab Invest，2005，85（1）：154-159.
[16] Olsvik PA，Lie KK，Jordal AE，et a1.Evaluation of potential reference genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon[J].BMC Mol Biol，2005，6：21.
[17] Schmittgen TD，Zakrajsek BA.Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression：validation by real-time，quantitative RT-PCR [J].J Biochem Biophys Methods，2000，46（1-2）：69-81.
作者簡介：王丹（1988-），女，汉族，江苏泰州人，东华大学研究生，研究方向：小鼠性发育。