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摘 要 从香蕉基因组数据库和NCBI数据库中检索香蕉GAPDH基因家族的所有成员，并采用生物信息学方法对其进行亚细胞定位、进化树分析和保守结构域预测。克隆测序发现，巴西蕉内的GAPDH基因家族成员序列与小果野蕉基因组数据库中提供的序列基本一致，同源性超过98%。转录表达分析表明，GAPDH基因家族成员在巴西蕉不同器官的表达模式多样：MaGAPCP1，MaGAPC6/8/10/11成组成型表达，其余的基因则在各组织器官间成差异型表达，且差异型表达的基因在不同组织器官中表达模式也不相同，组成型表达的基因在不同组织器官中表达模式虽相同，但表达量有差异。GAPDH基因家族成员在表达模式上的多样化，可能暗示其功能的多样化，这种多样化可能是在进化过程中为适应环境而出现的功能分化或冗余。结果为进一步研究GAPDH基因家族成员在香蕉生长、发育，非生物胁迫，果实后熟等重要生物学过程中的功能奠定基础。
关键词 香蕉；GAPDH基因家族；生物信息学分析；表达分析
中图分类号 S668.1 文献标识码 A
Bioinformatics and Expression Analysis of
Banana GAPDH Gene Family
SHI Hourui1，2， FENG Renjun2 *， WANG Jingyi2， CHAI Juan1，2， REN Mengyun1，2
LU Lifang2， ZHANG Yindong1 **
1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，
Haikou， Hainan 571101， China
Abstract Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）is one of the key enzymes involved in glycolysis， gluconeogenesis and the Calvin cycle， which is widespread in higher plants playing an important role in plant growth and development. In this study， their subcellular location， phylogenetic tree and conserved domains prediction of the GAPDH gene family members from NCBI database and banana genome database were performed by the bioinformatics method. And all the members were amplified，cloned and sequenced from Musa AAA（Cavendish subgroup cv.Brazil）， showing >98% sequence identity with Musa acuminata genome. The results showed that the expression patterns of GAPDH gene family members were diversity in different tissues of Musa AAA（Cavendish subgroup cv.Brazil）. MaGAPCP1 and MaGAPC6/8/10/11 were constitutive expression genes， while the others were differentially expressed in different tissues. Although the expression patterns of constitutive expression genes were same， there were differences in expression levels. The diversity on the expression patterns of GAPDH gene family members may imply their functional diversity. Such diversification of biological function may be functions differentiation or redundant occurred in the evolution of GAPDH gene family. These results will lay the foundation for further research on the functions of GAPDH gene family in growth and development， abiotic stress， fruit ripening and other important biological processes of banana.
Key words Banana； GAPDH gene family； Bioinformatics analysis； Expression analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.013 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehyrogenase，GAPDH）广泛存在于高等植物中，是参与糖酵解、糖异生和卡尔文循环的一个关键酶，按其生化特性可分为磷酸化和非磷酸化两大类。根据磷酸化的GAPDH在细胞中的不同定位可将其分为GAPC、GAPCp（EC 1.2.1.12）和GAPA/B（EC 1.2.1.13）三类。GAPC定位于细胞质中，其糖酵解和糖异生过程中氧化和磷酸化D-甘油醛3-磷酸（D-glyceraldehyde-3-phosphate）转变成1，3-二磷酸甘油酸（1，3-diphosphoglycerate），同时将NAD+还原成NADH。GAPCp和GAPA/B都是质体型GAPDH，GAPCp主要存在于非绿色质体中，依赖于NAD+，其通过与磷酸甘油酸激酶（PGK）催化两个连续的反应，形成 3-磷酸甘油酸和 ATP[1-2]。GAPA/B由GapA和GapB亚基组成， 位于叶绿体中，依赖于NADPH，参与卡尔文碳循环光合固定CO2[3]。非磷酸化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），简称为NP-GAPDH（EC 1.2.1.9），依赖于NADP+，在细胞中催化氧化甘油醛-3-磷酸转变为3-磷酸甘油酸这一不可逆反应，同时产生NADPH。该酶是醛脱氢酶（ALDH）超家族中的一员，最新的研究将其归为ALDH11家族[4]，其与磷酸化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在核酸与蛋白水平上没有同源性。GAPDH在功能上与植物的生长发育密切相关，拟南芥GAPDH缺失突变体表现为植株矮小、根不能正常生长和花粉败育[5-6]。抗逆性研究结果表明：过量表达GAPDH基因的水稻耐盐性提高等[7]；小麦GAPDH蛋白受聚乙二醇、盐和ABA诱导上调表达，受低温诱导下调表达[8]。拟南芥幼苗在镉元素胁迫下，根中胞质磷酸甘油醛脱氢酶基因GAPC1和GAPC2产生应答，GAPC1在转录水平上比GAPC2更敏感[9]。
香蕉（Musa spp.）是世界上重要的水果之一，同时也是重要的粮食作物和经济作物。除三倍体AAA、AAB、ABB外，还有二倍体AA、BB、AB，四倍体AAAA，AABB、AAAB，这使香蕉具有特殊的生物学特性和遗传特性。二倍体小果野蕉（Musa acuminate）全基因组测序完成[10]，这为香蕉分子生物学研究的发展提供了良好的平台。香蕉GAPDH受乙烯诱导、干旱胁迫时上调表达，并在维持NAD/NADH稳态中发挥重要作用。本研究在香蕉全基因组水平上对GAPDH基因家族进行分子进化和保守结构域分析，并取栽培品种巴西蕉为试验材料，对香蕉GAPDH基因家族成员进行了转录表达分析，以期为进一步研究该家族在巴西蕉生长及形态发育，非生物胁迫，果实后熟等重要生物学过程中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为生长良好的巴西蕉植株，取自中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所实验基地。采集巴西蕉的根、叶、花、果，清洗后用液氮速冻，-80 ℃保存备用。
香蕉GAPDH基因家族的序列信息从香蕉基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/）和NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行查找。拟南芥GAPDH基因及序列信息来自拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）和NCBI数据库。
1.2 方法
1.2.1 香蕉GAPDH基因家族生物信息学分析
通过检索NCBI数据库和香蕉基因组数据库，搜索并获取香蕉GAPDH基因序列信息。根据获取的基因组信息，采用在线软件INRA和PSPORT对香蕉GAPDH基因家族成员进行亚细胞定位预测（http：//urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html和http：//psort.hgc.jp/）。将检索到香蕉GAPDH氨基酸序列与已知的GAPDH氨基酸序列进行比对分析，再对香蕉GAPDH进行分类。利用软件MEGA 5.2对香蕉GAPDH蛋白的氨基酸序列与拟南芥和其它物种的GAPDH进行多重序列对比，具体方法为：删除两端未对齐的氨基酸序列，根据Neighbor-Joining法，并进行1 000次bootstrap统计学检验，构建GAPDH基因家族进化树。利用DNAMAN软件对香蕉GAPDH的蛋白多重序列进行比对，利用NCBI的CDD数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）对香蕉GAPDH蛋白进行结构域分析。
1.2.2 香蕉总RNA的提取及反转录 取-80 ℃保存的香蕉根、叶、花、七成熟果等组织，分别在液氮中充分研磨，采用改良CTAB法提取总RNA，利用凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和完整性。DNaseⅠ酶除去总RNA中的基因组DNA，按照Fermentas公司RerertAidTM Premium Reverse Transcriptase反转录试剂盒合成cDNA第一条链，操作均按说明书进行。根据NCBI数据库中香蕉Actin基因序列，设计检测引物，见表1。通过PCR扩增香蕉的Actin基因，检测反转录是否成功。
1.2.3 香蕉GAPDH基因家族的表达分析 对香蕉基因组数据库中获取的GAPDH基因家族成员序列设计PCR引物（表1），以巴西蕉RNA反转录得到的cDNA第一链为模板，克隆到目的片段，送生物公司测序，并将测序结果与基因组预测序列进行比对。以香蕉Actin为内参基因，以反转录得到的cDNA第一链为模板，采用半定量RT-PCR方法检测GAPDH基因家族在巴西蕉不同组织器官中的表达情况，并根据内参β-actin亮度，调整cDNA模板的量，最终确定半定量RT-PCR的最优反应体系。 2 结果与分析
2.1 香蕉GAPDH基因家族的成员分布
通过在NCBI和香蕉基因组数据库上对GAPDH基因的检索、筛选，共获得18个香蕉GAPDH基因家族成员，分布在香蕉第2、5、6、7、8、9、10、11号染色体和Un-random染色体上。其中有2个为编码非磷酸化GAPDH的基因，将其命名为MaNP-GAPDH1和MaNP-GAPDH2；其余16个为编码磷酸化GAPDH的基因。磷酸化的GAPDH分为GAPA/B，GAPCp和GAPC三类，通过与其他物种GAPDH氨基酸序列比对分析和在线亚细胞定位预测，其中4个定位于叶绿体的磷酸化GAPDH的编码基因，分别命名为MaGAPA1、MaGAPA2、MaGAPB1和MaGAPB2；1个定位于非绿色质体的磷酸化GAPDH的编码基因，命名为MaGAPCp1；11个定位于细胞质的磷酸化GAPDH的编码基因，依次命名为MaGAPC1至MaGAPC11，详见表2。
2.2 香蕉GAPDH的系统进化树分析
拟南芥GAPDH和磷酸化的MaGAPDH蛋白氨基酸序列重建系统发育树结果显示（图1-A）：磷酸化的香蕉GAPGH蛋白家族清晰地分为GAPC，GAPCp和GAPA/B三个主支，且功能相似的蛋白聚为一束，MaGAPC5、MaGAPC7-11和AtGAPC1、AtGAPC2处于相同分支，MaGAPCp1和AtGAPCp1、AtGAPCp2处于相同分支，MaGAPA1、MaGAPA2和AtGAPA1、AtGAPA2处于相同分支，MaGAPB1、MaGAPB2和AtGAPB处于相同分支。由图1-A还发现，MaGAPC3/6和GAPCp类蛋白聚合在一起，说明在MaGAPC3/6的定位预测上可能不准确，其也可能定位在质体中，这有待进一步研究证明。
将非磷酸化的MaNP-GAPDH氨基酸序列和检索到的拟南芥、苜蓿、水稻、乌拉尔图小麦、节节麦中的NP-GAPDH氨基酸序列重建系统进化树（图1-B），发现MaNP-GAPDH和单子叶植物水稻、乌拉尔图小麦、节节麦的NP-GAPDH处于同一分支，和苜蓿、拟南芥的NP-GAPDH分开聚类，根据进化远近的关系推断NP-GAPDH可能已经在单、双子叶植物分化形成时进行了分化。
2.3 香蕉GAPDH的蛋白结构域分析
磷酸化MaGAPDH蛋白的多重序列比对结果显示（图2），香蕉中的GAPDH保守性主要表现在基因的下游，在上游的保守性较低。采用CDD对MaGAPDH基因家族可能含有的保守结构域进行了分析，发现磷酸化的MaGAPDH蛋白都存在着高度保守的Gp_dh_N和Gp_dh_C两个结构域，图中细线框中的区域为Gp_dh_N结构域，粗线框中的区域为Gp_dh_C结构域。非磷酸化的MaGAPDH蛋白都含有ALDH-F11结构域。香蕉GAPDH基因家族具体蛋白结构域详见表3。
2.4 总RNA和反转录的质量分析
经琼脂糖凝胶电泳检测，所提取的香蕉根、叶、花、果总RNA的28S、18S条带清晰、完整，说明RNA没有出现降解。紫外分光光度计测得OD260/OD280的比值介于1.8～2.0，表明总RNA的纯度较高，没有糖、蛋白质等污染，可以用与反转录合成cDNA第一条链。用Actin对反转录产物进行PCR验证（图3），表明合成的cDNA第一条链质量良好，可以作为半定量RT-PCR的模板。
2.5 香蕉GAPDH基因家族组织器官特异性表达
通过目的片段测序发现，巴西蕉的GAPDH基因家族成员序列与香蕉基因组数据库中提供的序列基本一致，同源性超过98%，其GAPDH基因家族成员与香蕉基因组数据库预测的GAPDH基因家族成员相对应。香蕉GAPDH基因家族不同器官特异性表达分析结果显示：MaGAPA1/2、MaGAPB1/2、MaGAPC3、MaNPGAPDH2在不同组织器官有明显的表达特异性，其中MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2、MaNP-GAPDH2主要在叶和果中表达，并在叶中表达量最高，在根和花中不表达或表达量很低；MaGAPC3主要在果中高表达，在根和叶中低表达；MaGAPC5/9在叶、花、果中表达量较高，在根中表达量较低；MaGAPC7主要在花、果中表达，在根和叶中表达量很低；MaGAPC1在根和叶中表达量最高。MaGAPCp1、MaNP-GAPDH1、MaGAPC2/6/8/10/11在各组织器官中也是均有表达，并且表达水平基本一致。MaGAPC4在根、叶、花、果中均未检测到表达。
3 讨论
国外对植物GAPDH研究主要集中于GAPDH蛋白或基因在模式植物中的功能，涉及植物激素信号、糖代谢、蛋白互作、抗氧化和抗逆性等诸多方面。在拟南芥中，GAPDH与ABA信号途径存在关联，GAPDH的功能缺失会引起拟南芥突变体植株在生长发育、气孔关闭和种子萌芽等方面对外源ABA不敏感，然而突变体中内源ABA含量正常[11]。非磷酸化的GAPDH广泛参与多种信号途径转导的SnRK（蔗糖酵解型蛋白激酶）磷酸化，并失去其活性[12]。GAPDH还可通过与磷酸核酮糖激酶、叶绿体小蛋白CP12形成多蛋白复合体的形式调节光合作用的碳同化过程[13]。研究还发现，GAPDH能通过提高抗氧化相关酶的表达抑制活性氧的过多积累，从而提高植物的抗逆性[7，14]。此外，GAPDH还广泛参与基因表达的转录后调控，它作用于核tRNA运输、DNA复制与修复等过程，也参与调控组蛋白基因的表达、调节端粒结构、核膜融合和微管蛋白的活性等生物学过程[15-17]。
国内研究者分别从小麦、三七、西伯利亚蓼等十几种植物中克隆了GAPDH基因，并对各自的基因序列做了相关分析[18-21]。结果表明，生理型雄性不育小麦发育过程中，不同发育期GAPDH表达量存在显著差异﹐西伯利亚蓼经NaHCO3胁迫处理后，叶部PsGAPDH表达量减少，茎部随胁迫时间增加表达量增加；PsGAPDH还能提高转基因酵母的耐盐性。 但是，目前国内外有关GAPDH蛋白或基因在香蕉中的研究很少。Vanhove等[22]利用蛋白质组学筛选香蕉抗旱品种时，发现干旱胁迫下GAPDH上调表达，并猜想其在维持NAD/ NADH稳态中发挥重要作用；本实验室通过蛋白质组学研究发现，香蕉果皮中GAPDH受乙烯诱导上调表达[23]。本研究在前期研究的基础上，在香蕉基因组数据库中搜索香蕉的GAPDH家族成员，共搜索到18个香蕉GAPDH蛋白。对检索到的18个香蕉GAPDH蛋白及其基因进行分析发现，MaGAPA1-2、MaGAPB1-2亚细胞定位于叶绿体中，说明MaGAPA1-2、MaGAPB1-2可能参与香蕉光合作用；MaGAPCp1，MaGAPC1-11亚细胞定位于质体或细胞质中。转录表达分析发现，GAPDH基因家族成员在香蕉不同器官的转录表达模式多样（图3），部分基因在各组织器官间成差异型表达，另一部分则成组成型表达。差异型表达的基因在不同组织器官间的表达模式都不相同，如MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2主要在香蕉的叶和果表达，在根和花非绿色部位基本不表达，这与闫洪波等对鸭梨GAPDH基因的研究结果一致[24]。MaGAPC类基因（MaGAPC1/3/5/7/9）在香蕉的根、叶、花、果都有表达，但表达量却有明显差异，这些MaGAPDH基因可能参与香蕉抗逆境胁迫、果实的淀粉积累和成熟等生物学过程。组成型表达的基因表达量虽在组织器官间没有差异，但各个基因间的表达量却不同，如MaGAPC8/10，这类GAPDH一般作为代谢的基础酶类，在维持植物物质与能量代谢稳定方面有重要的调控作用，在各器官和植物不同发育时期都平稳表达[25]，这类GAPDH基因可作为候选内参基因。GAPDH基因家族成员在表达模式上的多样化，意味着其在组织、器官甚至亚细胞水平上进行了功能的特性化或专化，进而在功能上也表现出多样性。因此笔者推断，GAPDH基因家族的多成员现象可能与其在进化过程中为适应环境而出现的功能分化或冗余有关。
参考文献
[1] Backhausen J E， Vetter S， Baalmann E， et al. NAD-dependent malate dehydrogenase and glyceraldehyde-3-phosph-ate dehydrogenase isoenzymes play an importan role in dark metabolism of various plastid types[J]. Planta， 1998， 205： 359-366.
[2] Meyer-Gauen G， Schnarrenberger C， Cerff R， et al. Molecular characterization of a novel， nuclear-encoded， NAD（+）-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in plastids of the gymnosperm Pinus sylvestrisL[J]. Plant Mol Bio， 1994， l26： 1 155-1 166.
[3] Avilan L， Maberly C S， Mekhalf M， et al. Regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the eustigmatophyte Pseudo-characiopsis ovalis is intermediate between a chlorophyte and a diatom[J]. Eur J Phycol， 2012， 47（3）： 207-215.
[4] Brocker C， Vasiliou M， Carpenter S， et al. Aldehyde dehydrogenase（ALDH）superfamily in plants ： gene nomenclature and com-paraive genomics[J]. Planta， 2013， 237： 189-210.
[5] Munoz-Bertomeu J， Cascales-Minana B， Irles-Segura A， et al. The plastidial glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase is critical for viable pollen development in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2010， 152： 1 830-1 841.
[6] Munoz-Bertomeu J， Cascales-Minana B， Mulet J M， et al. Plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase de ciency leads to altered root development and affects the sugar and amino acid balance in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2009， 151： 541-558.
[7] Zhang X H， Rao X L， Shi H T， et al. Overexpression of a cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene OsGAPC3confers salt tolerance in rice[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2011， 107： 1-11. [8] 崔丽荣. 抗旱小麦长武134 GAPDH基因的表达及克隆[D]. 陕西杨凌： 西北农林科技大学， 2010.
[9] Vescovi M， Zaffagnini M， Festa M， et al. Nuclear accumulation of cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in cadmium-stressed Arabidopsis roots[J]. Plant Physiol， 2013， 162（1）： 333-46.
[10] D'Hont A， Denoeud F， Aury J M， et al. The banana（Musa acuminata）genome and the evolution of monocotyledonous plants[J]. Nature， 2012， 488： 213-217.
[11] Munoz-Bertomeu J， Bermudez M A， Segura J， et al.Arabidopsis plants deficient in plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase show alterations in Abscisic Acid（ABA）signal transduction： interaction between ABA and primary metabolism[J]. J Exp Bot， 2011， 62： 1 229-1 239.
[12] Piattoni C V， Bustos D M， Guerrero S A， et al. Nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is phosphorylated in wheat endosperm at serine-404 by an SNF1-related protein kinase allosterically inhibited by ribose-5-phosphate[J]. Plant Physiol， 2011， 156： 1 337-1 350.
[13] Howard T P， Lloyd J C， Raines C A. Inter-species variation in the oligomeric states of the higher plant Calvin cycle enzymes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoribulokinase[J]. J Exp Bot， 2011， 62： 3 799-3 805.
[14] Baek D， Jin Y， Jeong J C. Suppression of reactive oxygen species by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J]. Phytochemistry， 2008， 69： 333-338.
[15] SiroverM A. Role of the glycolytic protein， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， in normal cell function and in cell pathology[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 1998， 66（2）： 133-140.
[16] Shieh J C， Wilkinson M G， Buck V， et al. The Mcs4 response regulator coordinately controls the stress-activated Wak1-Wis1-Sty1 MAP kinase pathway and fission yeast cell cycle[J]. Genes Dev， 1997， 11： 1 008-1 022.
[17] Sirover M A. New nuclear functions of the glycolytic protein， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， in mammalian cells[J]. J Cell Biochem， 2005， 95： 45-52.
[18] 岳彩凤， 康国章， 刘 超， 等. 小麦GAPDH基因克隆基序列分析[J]. 中国农学通报， 2008（4）： 94-98.
[19] 朱 华， 李 坤， 赵瑞强， 等. 三七植物GAPDH基因克隆基序列分析[J]. 西北植物学报， 2006（7）： 1 316-1 319.
[20] 李晓泽. 西伯利亚蓼3-磷酸甘油醛脱氢酶的cDNA克隆及耐盐性分析[D]. 泰安： 东北林业大学， 2008.
[21] 位明明， 王俊生， 张改生， 等. GAPDH基因表达与小麦生理型雄花不育花药败育的关系[J]. 分子植物育种， 2009（4）： 679-684.
[22] Vanhove A C， Vermaelen W， Panis B， et al. Screening the banana biodiversity for drought tolerance： can an in vitro growth model and proteomics be used as a tool to discover tolerant varieties and understand homeostasis[J]. Front Plant Sci， 2012， 3： 176.
[23] Zhang L L， Feng R J， Zhang Y D. Evaluation of different methods of protein extraction and identification of differentially expressed proteins upon ethylene-induced early-ripening in banana peels[OL]. J Sci Food Agric， Article first published online： 2012 -10-25. DOI： 10.1002/jsfa.5591.
[24] 闫洪波， 葛文雅， 程玉豆， 等. 鸭梨GAPDH基因家族的克隆及其表达特征[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2012（9）： 181-186
[25] Sirover M A. On the function diversity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase： Biochemical mechanisms and regulatory control[J]. Biochim Biophys Acta， 2011， 1 810（8）： 741-751.
责任编辑：赵军明
关键词 香蕉；GAPDH基因家族；生物信息学分析；表达分析
中图分类号 S668.1 文献标识码 A
Bioinformatics and Expression Analysis of
Banana GAPDH Gene Family
SHI Hourui1，2， FENG Renjun2 *， WANG Jingyi2， CHAI Juan1，2， REN Mengyun1，2
LU Lifang2， ZHANG Yindong1 **
1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，
Haikou， Hainan 571101， China
Abstract Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）is one of the key enzymes involved in glycolysis， gluconeogenesis and the Calvin cycle， which is widespread in higher plants playing an important role in plant growth and development. In this study， their subcellular location， phylogenetic tree and conserved domains prediction of the GAPDH gene family members from NCBI database and banana genome database were performed by the bioinformatics method. And all the members were amplified，cloned and sequenced from Musa AAA（Cavendish subgroup cv.Brazil）， showing >98% sequence identity with Musa acuminata genome. The results showed that the expression patterns of GAPDH gene family members were diversity in different tissues of Musa AAA（Cavendish subgroup cv.Brazil）. MaGAPCP1 and MaGAPC6/8/10/11 were constitutive expression genes， while the others were differentially expressed in different tissues. Although the expression patterns of constitutive expression genes were same， there were differences in expression levels. The diversity on the expression patterns of GAPDH gene family members may imply their functional diversity. Such diversification of biological function may be functions differentiation or redundant occurred in the evolution of GAPDH gene family. These results will lay the foundation for further research on the functions of GAPDH gene family in growth and development， abiotic stress， fruit ripening and other important biological processes of banana.
Key words Banana； GAPDH gene family； Bioinformatics analysis； Expression analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.013 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehyrogenase，GAPDH）广泛存在于高等植物中，是参与糖酵解、糖异生和卡尔文循环的一个关键酶，按其生化特性可分为磷酸化和非磷酸化两大类。根据磷酸化的GAPDH在细胞中的不同定位可将其分为GAPC、GAPCp（EC 1.2.1.12）和GAPA/B（EC 1.2.1.13）三类。GAPC定位于细胞质中，其糖酵解和糖异生过程中氧化和磷酸化D-甘油醛3-磷酸（D-glyceraldehyde-3-phosphate）转变成1，3-二磷酸甘油酸（1，3-diphosphoglycerate），同时将NAD+还原成NADH。GAPCp和GAPA/B都是质体型GAPDH，GAPCp主要存在于非绿色质体中，依赖于NAD+，其通过与磷酸甘油酸激酶（PGK）催化两个连续的反应，形成 3-磷酸甘油酸和 ATP[1-2]。GAPA/B由GapA和GapB亚基组成， 位于叶绿体中，依赖于NADPH，参与卡尔文碳循环光合固定CO2[3]。非磷酸化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），简称为NP-GAPDH（EC 1.2.1.9），依赖于NADP+，在细胞中催化氧化甘油醛-3-磷酸转变为3-磷酸甘油酸这一不可逆反应，同时产生NADPH。该酶是醛脱氢酶（ALDH）超家族中的一员，最新的研究将其归为ALDH11家族[4]，其与磷酸化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在核酸与蛋白水平上没有同源性。GAPDH在功能上与植物的生长发育密切相关，拟南芥GAPDH缺失突变体表现为植株矮小、根不能正常生长和花粉败育[5-6]。抗逆性研究结果表明：过量表达GAPDH基因的水稻耐盐性提高等[7]；小麦GAPDH蛋白受聚乙二醇、盐和ABA诱导上调表达，受低温诱导下调表达[8]。拟南芥幼苗在镉元素胁迫下，根中胞质磷酸甘油醛脱氢酶基因GAPC1和GAPC2产生应答，GAPC1在转录水平上比GAPC2更敏感[9]。
香蕉（Musa spp.）是世界上重要的水果之一，同时也是重要的粮食作物和经济作物。除三倍体AAA、AAB、ABB外，还有二倍体AA、BB、AB，四倍体AAAA，AABB、AAAB，这使香蕉具有特殊的生物学特性和遗传特性。二倍体小果野蕉（Musa acuminate）全基因组测序完成[10]，这为香蕉分子生物学研究的发展提供了良好的平台。香蕉GAPDH受乙烯诱导、干旱胁迫时上调表达，并在维持NAD/NADH稳态中发挥重要作用。本研究在香蕉全基因组水平上对GAPDH基因家族进行分子进化和保守结构域分析，并取栽培品种巴西蕉为试验材料，对香蕉GAPDH基因家族成员进行了转录表达分析，以期为进一步研究该家族在巴西蕉生长及形态发育，非生物胁迫，果实后熟等重要生物学过程中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为生长良好的巴西蕉植株，取自中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所实验基地。采集巴西蕉的根、叶、花、果，清洗后用液氮速冻，-80 ℃保存备用。
香蕉GAPDH基因家族的序列信息从香蕉基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/）和NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行查找。拟南芥GAPDH基因及序列信息来自拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）和NCBI数据库。
1.2 方法
1.2.1 香蕉GAPDH基因家族生物信息学分析
通过检索NCBI数据库和香蕉基因组数据库，搜索并获取香蕉GAPDH基因序列信息。根据获取的基因组信息，采用在线软件INRA和PSPORT对香蕉GAPDH基因家族成员进行亚细胞定位预测（http：//urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html和http：//psort.hgc.jp/）。将检索到香蕉GAPDH氨基酸序列与已知的GAPDH氨基酸序列进行比对分析，再对香蕉GAPDH进行分类。利用软件MEGA 5.2对香蕉GAPDH蛋白的氨基酸序列与拟南芥和其它物种的GAPDH进行多重序列对比，具体方法为：删除两端未对齐的氨基酸序列，根据Neighbor-Joining法，并进行1 000次bootstrap统计学检验，构建GAPDH基因家族进化树。利用DNAMAN软件对香蕉GAPDH的蛋白多重序列进行比对，利用NCBI的CDD数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）对香蕉GAPDH蛋白进行结构域分析。
1.2.2 香蕉总RNA的提取及反转录 取-80 ℃保存的香蕉根、叶、花、七成熟果等组织，分别在液氮中充分研磨，采用改良CTAB法提取总RNA，利用凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和完整性。DNaseⅠ酶除去总RNA中的基因组DNA，按照Fermentas公司RerertAidTM Premium Reverse Transcriptase反转录试剂盒合成cDNA第一条链，操作均按说明书进行。根据NCBI数据库中香蕉Actin基因序列，设计检测引物，见表1。通过PCR扩增香蕉的Actin基因，检测反转录是否成功。
1.2.3 香蕉GAPDH基因家族的表达分析 对香蕉基因组数据库中获取的GAPDH基因家族成员序列设计PCR引物（表1），以巴西蕉RNA反转录得到的cDNA第一链为模板，克隆到目的片段，送生物公司测序，并将测序结果与基因组预测序列进行比对。以香蕉Actin为内参基因，以反转录得到的cDNA第一链为模板，采用半定量RT-PCR方法检测GAPDH基因家族在巴西蕉不同组织器官中的表达情况，并根据内参β-actin亮度，调整cDNA模板的量，最终确定半定量RT-PCR的最优反应体系。 2 结果与分析
2.1 香蕉GAPDH基因家族的成员分布
通过在NCBI和香蕉基因组数据库上对GAPDH基因的检索、筛选，共获得18个香蕉GAPDH基因家族成员，分布在香蕉第2、5、6、7、8、9、10、11号染色体和Un-random染色体上。其中有2个为编码非磷酸化GAPDH的基因，将其命名为MaNP-GAPDH1和MaNP-GAPDH2；其余16个为编码磷酸化GAPDH的基因。磷酸化的GAPDH分为GAPA/B，GAPCp和GAPC三类，通过与其他物种GAPDH氨基酸序列比对分析和在线亚细胞定位预测，其中4个定位于叶绿体的磷酸化GAPDH的编码基因，分别命名为MaGAPA1、MaGAPA2、MaGAPB1和MaGAPB2；1个定位于非绿色质体的磷酸化GAPDH的编码基因，命名为MaGAPCp1；11个定位于细胞质的磷酸化GAPDH的编码基因，依次命名为MaGAPC1至MaGAPC11，详见表2。
2.2 香蕉GAPDH的系统进化树分析
拟南芥GAPDH和磷酸化的MaGAPDH蛋白氨基酸序列重建系统发育树结果显示（图1-A）：磷酸化的香蕉GAPGH蛋白家族清晰地分为GAPC，GAPCp和GAPA/B三个主支，且功能相似的蛋白聚为一束，MaGAPC5、MaGAPC7-11和AtGAPC1、AtGAPC2处于相同分支，MaGAPCp1和AtGAPCp1、AtGAPCp2处于相同分支，MaGAPA1、MaGAPA2和AtGAPA1、AtGAPA2处于相同分支，MaGAPB1、MaGAPB2和AtGAPB处于相同分支。由图1-A还发现，MaGAPC3/6和GAPCp类蛋白聚合在一起，说明在MaGAPC3/6的定位预测上可能不准确，其也可能定位在质体中，这有待进一步研究证明。
将非磷酸化的MaNP-GAPDH氨基酸序列和检索到的拟南芥、苜蓿、水稻、乌拉尔图小麦、节节麦中的NP-GAPDH氨基酸序列重建系统进化树（图1-B），发现MaNP-GAPDH和单子叶植物水稻、乌拉尔图小麦、节节麦的NP-GAPDH处于同一分支，和苜蓿、拟南芥的NP-GAPDH分开聚类，根据进化远近的关系推断NP-GAPDH可能已经在单、双子叶植物分化形成时进行了分化。
2.3 香蕉GAPDH的蛋白结构域分析
磷酸化MaGAPDH蛋白的多重序列比对结果显示（图2），香蕉中的GAPDH保守性主要表现在基因的下游，在上游的保守性较低。采用CDD对MaGAPDH基因家族可能含有的保守结构域进行了分析，发现磷酸化的MaGAPDH蛋白都存在着高度保守的Gp_dh_N和Gp_dh_C两个结构域，图中细线框中的区域为Gp_dh_N结构域，粗线框中的区域为Gp_dh_C结构域。非磷酸化的MaGAPDH蛋白都含有ALDH-F11结构域。香蕉GAPDH基因家族具体蛋白结构域详见表3。
2.4 总RNA和反转录的质量分析
经琼脂糖凝胶电泳检测，所提取的香蕉根、叶、花、果总RNA的28S、18S条带清晰、完整，说明RNA没有出现降解。紫外分光光度计测得OD260/OD280的比值介于1.8～2.0，表明总RNA的纯度较高，没有糖、蛋白质等污染，可以用与反转录合成cDNA第一条链。用Actin对反转录产物进行PCR验证（图3），表明合成的cDNA第一条链质量良好，可以作为半定量RT-PCR的模板。
2.5 香蕉GAPDH基因家族组织器官特异性表达
通过目的片段测序发现，巴西蕉的GAPDH基因家族成员序列与香蕉基因组数据库中提供的序列基本一致，同源性超过98%，其GAPDH基因家族成员与香蕉基因组数据库预测的GAPDH基因家族成员相对应。香蕉GAPDH基因家族不同器官特异性表达分析结果显示：MaGAPA1/2、MaGAPB1/2、MaGAPC3、MaNPGAPDH2在不同组织器官有明显的表达特异性，其中MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2、MaNP-GAPDH2主要在叶和果中表达，并在叶中表达量最高，在根和花中不表达或表达量很低；MaGAPC3主要在果中高表达，在根和叶中低表达；MaGAPC5/9在叶、花、果中表达量较高，在根中表达量较低；MaGAPC7主要在花、果中表达，在根和叶中表达量很低；MaGAPC1在根和叶中表达量最高。MaGAPCp1、MaNP-GAPDH1、MaGAPC2/6/8/10/11在各组织器官中也是均有表达，并且表达水平基本一致。MaGAPC4在根、叶、花、果中均未检测到表达。
3 讨论
国外对植物GAPDH研究主要集中于GAPDH蛋白或基因在模式植物中的功能，涉及植物激素信号、糖代谢、蛋白互作、抗氧化和抗逆性等诸多方面。在拟南芥中，GAPDH与ABA信号途径存在关联，GAPDH的功能缺失会引起拟南芥突变体植株在生长发育、气孔关闭和种子萌芽等方面对外源ABA不敏感，然而突变体中内源ABA含量正常[11]。非磷酸化的GAPDH广泛参与多种信号途径转导的SnRK（蔗糖酵解型蛋白激酶）磷酸化，并失去其活性[12]。GAPDH还可通过与磷酸核酮糖激酶、叶绿体小蛋白CP12形成多蛋白复合体的形式调节光合作用的碳同化过程[13]。研究还发现，GAPDH能通过提高抗氧化相关酶的表达抑制活性氧的过多积累，从而提高植物的抗逆性[7，14]。此外，GAPDH还广泛参与基因表达的转录后调控，它作用于核tRNA运输、DNA复制与修复等过程，也参与调控组蛋白基因的表达、调节端粒结构、核膜融合和微管蛋白的活性等生物学过程[15-17]。
国内研究者分别从小麦、三七、西伯利亚蓼等十几种植物中克隆了GAPDH基因，并对各自的基因序列做了相关分析[18-21]。结果表明，生理型雄性不育小麦发育过程中，不同发育期GAPDH表达量存在显著差异﹐西伯利亚蓼经NaHCO3胁迫处理后，叶部PsGAPDH表达量减少，茎部随胁迫时间增加表达量增加；PsGAPDH还能提高转基因酵母的耐盐性。 但是，目前国内外有关GAPDH蛋白或基因在香蕉中的研究很少。Vanhove等[22]利用蛋白质组学筛选香蕉抗旱品种时，发现干旱胁迫下GAPDH上调表达，并猜想其在维持NAD/ NADH稳态中发挥重要作用；本实验室通过蛋白质组学研究发现，香蕉果皮中GAPDH受乙烯诱导上调表达[23]。本研究在前期研究的基础上，在香蕉基因组数据库中搜索香蕉的GAPDH家族成员，共搜索到18个香蕉GAPDH蛋白。对检索到的18个香蕉GAPDH蛋白及其基因进行分析发现，MaGAPA1-2、MaGAPB1-2亚细胞定位于叶绿体中，说明MaGAPA1-2、MaGAPB1-2可能参与香蕉光合作用；MaGAPCp1，MaGAPC1-11亚细胞定位于质体或细胞质中。转录表达分析发现，GAPDH基因家族成员在香蕉不同器官的转录表达模式多样（图3），部分基因在各组织器官间成差异型表达，另一部分则成组成型表达。差异型表达的基因在不同组织器官间的表达模式都不相同，如MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2主要在香蕉的叶和果表达，在根和花非绿色部位基本不表达，这与闫洪波等对鸭梨GAPDH基因的研究结果一致[24]。MaGAPC类基因（MaGAPC1/3/5/7/9）在香蕉的根、叶、花、果都有表达，但表达量却有明显差异，这些MaGAPDH基因可能参与香蕉抗逆境胁迫、果实的淀粉积累和成熟等生物学过程。组成型表达的基因表达量虽在组织器官间没有差异，但各个基因间的表达量却不同，如MaGAPC8/10，这类GAPDH一般作为代谢的基础酶类，在维持植物物质与能量代谢稳定方面有重要的调控作用，在各器官和植物不同发育时期都平稳表达[25]，这类GAPDH基因可作为候选内参基因。GAPDH基因家族成员在表达模式上的多样化，意味着其在组织、器官甚至亚细胞水平上进行了功能的特性化或专化，进而在功能上也表现出多样性。因此笔者推断，GAPDH基因家族的多成员现象可能与其在进化过程中为适应环境而出现的功能分化或冗余有关。
参考文献
[1] Backhausen J E， Vetter S， Baalmann E， et al. NAD-dependent malate dehydrogenase and glyceraldehyde-3-phosph-ate dehydrogenase isoenzymes play an importan role in dark metabolism of various plastid types[J]. Planta， 1998， 205： 359-366.
[2] Meyer-Gauen G， Schnarrenberger C， Cerff R， et al. Molecular characterization of a novel， nuclear-encoded， NAD（+）-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in plastids of the gymnosperm Pinus sylvestrisL[J]. Plant Mol Bio， 1994， l26： 1 155-1 166.
[3] Avilan L， Maberly C S， Mekhalf M， et al. Regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the eustigmatophyte Pseudo-characiopsis ovalis is intermediate between a chlorophyte and a diatom[J]. Eur J Phycol， 2012， 47（3）： 207-215.
[4] Brocker C， Vasiliou M， Carpenter S， et al. Aldehyde dehydrogenase（ALDH）superfamily in plants ： gene nomenclature and com-paraive genomics[J]. Planta， 2013， 237： 189-210.
[5] Munoz-Bertomeu J， Cascales-Minana B， Irles-Segura A， et al. The plastidial glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase is critical for viable pollen development in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2010， 152： 1 830-1 841.
[6] Munoz-Bertomeu J， Cascales-Minana B， Mulet J M， et al. Plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase de ciency leads to altered root development and affects the sugar and amino acid balance in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2009， 151： 541-558.
[7] Zhang X H， Rao X L， Shi H T， et al. Overexpression of a cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene OsGAPC3confers salt tolerance in rice[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2011， 107： 1-11. [8] 崔丽荣. 抗旱小麦长武134 GAPDH基因的表达及克隆[D]. 陕西杨凌： 西北农林科技大学， 2010.
[9] Vescovi M， Zaffagnini M， Festa M， et al. Nuclear accumulation of cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in cadmium-stressed Arabidopsis roots[J]. Plant Physiol， 2013， 162（1）： 333-46.
[10] D'Hont A， Denoeud F， Aury J M， et al. The banana（Musa acuminata）genome and the evolution of monocotyledonous plants[J]. Nature， 2012， 488： 213-217.
[11] Munoz-Bertomeu J， Bermudez M A， Segura J， et al.Arabidopsis plants deficient in plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase show alterations in Abscisic Acid（ABA）signal transduction： interaction between ABA and primary metabolism[J]. J Exp Bot， 2011， 62： 1 229-1 239.
[12] Piattoni C V， Bustos D M， Guerrero S A， et al. Nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is phosphorylated in wheat endosperm at serine-404 by an SNF1-related protein kinase allosterically inhibited by ribose-5-phosphate[J]. Plant Physiol， 2011， 156： 1 337-1 350.
[13] Howard T P， Lloyd J C， Raines C A. Inter-species variation in the oligomeric states of the higher plant Calvin cycle enzymes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoribulokinase[J]. J Exp Bot， 2011， 62： 3 799-3 805.
[14] Baek D， Jin Y， Jeong J C. Suppression of reactive oxygen species by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J]. Phytochemistry， 2008， 69： 333-338.
[15] SiroverM A. Role of the glycolytic protein， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， in normal cell function and in cell pathology[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 1998， 66（2）： 133-140.
[16] Shieh J C， Wilkinson M G， Buck V， et al. The Mcs4 response regulator coordinately controls the stress-activated Wak1-Wis1-Sty1 MAP kinase pathway and fission yeast cell cycle[J]. Genes Dev， 1997， 11： 1 008-1 022.
[17] Sirover M A. New nuclear functions of the glycolytic protein， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， in mammalian cells[J]. J Cell Biochem， 2005， 95： 45-52.
[18] 岳彩凤， 康国章， 刘 超， 等. 小麦GAPDH基因克隆基序列分析[J]. 中国农学通报， 2008（4）： 94-98.
[19] 朱 华， 李 坤， 赵瑞强， 等. 三七植物GAPDH基因克隆基序列分析[J]. 西北植物学报， 2006（7）： 1 316-1 319.
[20] 李晓泽. 西伯利亚蓼3-磷酸甘油醛脱氢酶的cDNA克隆及耐盐性分析[D]. 泰安： 东北林业大学， 2008.
[21] 位明明， 王俊生， 张改生， 等. GAPDH基因表达与小麦生理型雄花不育花药败育的关系[J]. 分子植物育种， 2009（4）： 679-684.
[22] Vanhove A C， Vermaelen W， Panis B， et al. Screening the banana biodiversity for drought tolerance： can an in vitro growth model and proteomics be used as a tool to discover tolerant varieties and understand homeostasis[J]. Front Plant Sci， 2012， 3： 176.
[23] Zhang L L， Feng R J， Zhang Y D. Evaluation of different methods of protein extraction and identification of differentially expressed proteins upon ethylene-induced early-ripening in banana peels[OL]. J Sci Food Agric， Article first published online： 2012 -10-25. DOI： 10.1002/jsfa.5591.
[24] 闫洪波， 葛文雅， 程玉豆， 等. 鸭梨GAPDH基因家族的克隆及其表达特征[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2012（9）： 181-186
[25] Sirover M A. On the function diversity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase： Biochemical mechanisms and regulatory control[J]. Biochim Biophys Acta， 2011， 1 810（8）： 741-751.
责任编辑：赵军明