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【中图分类号】R835【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2014）10
【摘要】目的：探讨Fas蛋白、Fas mRNA的表达及Fas基因的甲基化状态在非小细胞肺癌发生发展中的相互关系及临床意义。方法：经手术治疗的非小细胞肺癌患者42例（鳞癌16例，腺癌26例），收集肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织。采用免疫组化S-P染色方法、逆转录聚合酶链式反应、重亚硫酸盐修饰及甲基化特异性聚合酶链式反应分别检测非小细胞肺癌患者癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白、Fas mRNA的表达情况及Fas基因甲基化状态，并分析其在非小细胞肺癌形成过程中的相互关系。结果：非小细胞肺癌组织的Fas蛋白阳性表达率为35.71%，Fas mRNA阳性表达率为45.24%，明显低于其在癌旁组织及正常肺组织中的表达率（Fas蛋白阳性表达率分别为 69.04%和 85.71%，Fas mRNA阳性表达率分别为76.19%和 90.48%）。非小细胞肺癌组织Fas基因甲基化率64.29%明显高于其在癌旁组织及正常肺组织中的甲基化率（分別为30.95%和21.43%）。非小细胞肺癌Fas蛋白、Fas mRNA分别与Fas基因甲基化呈显著负相关（Fas蛋白：r=﹣0.471， P<0.01；Fas mRNA：r=﹣0.469， P<0.01）。结论：与癌旁组织及正常肺组织相比，非小细胞肺癌组织中存在显著的Fas基因高甲基化，Fas mRNA及Fas蛋白表达下调。非小细胞肺癌Fas表达与Fas基因甲基化显著负相关。结果提示，Fas基因高甲基化可能导致Fas基因失活，从而影响肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤细胞异常增殖及免疫逃逸。
【关键词】Fas基因甲基化；Fas蛋白；Fas mRNA；非小细胞肺癌
Fas属肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族成员。Fas/FasL介导凋亡途径是调控多种细胞凋亡的重要机制 [1]。肿瘤细胞Fas水平下调可致肿瘤细胞凋亡受到抑制，导致肿瘤细胞免疫逃逸 [2]。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基[3-4]。DNA异常甲基化能使原癌基因活化和抑癌基因失活[5]从而导致肿瘤的发生。
目前肺癌Fas基因甲基化与Fas蛋白和Fas mRNA的表达间是否存在相关性尚不明确。本研究旨在探讨非小细胞肺癌Fas蛋白、Fas mRNA的表达与Fas基因甲基化的相关性。
1 组织标本
苏州大学附属第一医院就诊手术治疗并经病理诊断的非小细胞肺癌病例42例，其中鳞癌16例，腺癌26例，均选取癌组织、癌旁组织及正常肺组织。男性患者15例，女性患者27例。患者年龄分布为47-73岁，平均年龄为60±5.37岁。
2 方法
采用免疫组化方法、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法及甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）法分别检测非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白、Fas mRNA的表达及Fas基因甲基化状态。采用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析。检验显著性水准取α=0.05，以P<0.05为具有统计学意义。
3 结果
3.1 非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白和Fas mRNA的表达
非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白和Fas mRNA的表达情况见表1。Fas蛋白及Fas mRNA阳性表达率在非小细胞肺癌组织中的表达显著低于其在癌旁组织和正常肺组织中的表达（P<0.01）。Fas蛋白及Fas mRNA阳性表达率在癌旁组织和正常肺组织中、鳞癌和腺癌组织中的表达均无显著统计学差异。
3.2 非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas基因甲基化状态
非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织Fas基因甲基化状态见表2。非小细胞肺癌组织Fas基因甲基化率显著高于癌旁组织及正常肺组织Fas基因甲基化率，P均<0.01。癌旁组织和正常肺组织及鳞癌组织与腺癌组织Fas基因甲基化率差异无统计学差异。
3.3 Fas基因甲基化状态与Fas蛋白、Fas mRNA表达的相关性
非小细胞肺癌Fas基因甲基化与Fas蛋白、Fas mRNA表达相关性分析见表3。经Spearman等级相关分析，Fas基因甲基化与Fas蛋白、Fas mRNA表达呈显著负相关。
表3. Fas基因甲基化状态与Fas蛋白、Fas mRNA表达的相关性
4. 讨论
既往研究表明，Fas系统异常表达引起正常细胞凋亡程序受阻是肿瘤组织免疫逃逸的重要机制之一[6]。本研究结果证实了非小细胞肺癌组织存在Fas mRNA及Fas蛋白表达下调的现象，提示非小细胞肺癌细胞可通过减少肿瘤细胞表面Fas表达，导致Fas/FasL介导的肿瘤细胞凋亡被抑制。
另一方面，研究发现DNA启动子区甲基化可导致转录沉默。Fas基因甲基化可能是导致Fas基因失活的重要原因之一。本实验结果显示，非小细胞肺癌组织存在显著的Fas基因高甲基化表现，Fas的甲基化水平与Fas mRNA和Fas蛋白的表达呈负相关，提示非小细胞肺癌组织中存在显著的Fas基因高甲基化导致Fas基因失活的现象，可能是导致Fas mRNA及Fas蛋白表达下调的原因之一[7-8]。
综上所述，我们的研究发现，非小细胞肺癌细胞中，Fas基因高甲基化导致该基因表达沉默可能是引起Fas表达下调或缺失的重要原因。Fas基因的甲基化水平越高， Fas mRNA及Fas蛋白表达下调程度越严重。因此，Fas基因甲基化检测可作为非小细胞肺癌早期诊断的检测指标之一，为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了潜在的新方向。 參考文献
[1]Frost P， Ng CP， Belldegrun A， et al. Immunosensitization of prostate carcinoma cell lines for lymphocytes （CTL， TIL， LAK）-mediated apoptosis via the Fas-Fas-ligand pathway of cytotoxicity. Cell Immunol 1997；180 （1）：70-83
[2]Strand S， Hofmann WJ， Hug H， et a1. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 （APO–1/Fas） ligand–expressing tumor cells-A mechanism of immune evasion. Nature Med 1996；2（12）：1361-1366
[3]Bodey B. Cancer-testis antigens： promising targets for antigen directed antineoplastic immunotherapy. Expert Opin Biol Ther 2002；2（6）：577-584
[4]Feinberg AP， Cui H， Ohlsson R. DNA methylation and genomic imprinting： insights from cancer into epigenetic mechanisms. Semin Cancer Biol 2002； 12（5）：389-398
[5]Kikuchi S， Yamada D， Fukami T. Hypermethylation of the TSLC1/IGSF4 promoter is associated with tobacco smoking and a poor prognosis in primary nonsmall cell lung carcinoma. Cancer 2006；106（8）：1751-1758
[6]Zhang B， Sun T， Xue L， et al.Functional polymorphisms in Fas and FasL contribute to increased apoptosis of tumor infiltration lym-phocytes and risk of breast cancer. Carcinogenesis 2007；28（5）：1067-1073
[7]Herman JG， Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter ypermethylation. N Engl J Med 2003；349（21）：2042-2054
[8]Weber M， Hellmann I， Stadler MB， et al. Distribution，silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet 2007；39（4）：457-466
【摘要】目的：探讨Fas蛋白、Fas mRNA的表达及Fas基因的甲基化状态在非小细胞肺癌发生发展中的相互关系及临床意义。方法：经手术治疗的非小细胞肺癌患者42例（鳞癌16例，腺癌26例），收集肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织。采用免疫组化S-P染色方法、逆转录聚合酶链式反应、重亚硫酸盐修饰及甲基化特异性聚合酶链式反应分别检测非小细胞肺癌患者癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白、Fas mRNA的表达情况及Fas基因甲基化状态，并分析其在非小细胞肺癌形成过程中的相互关系。结果：非小细胞肺癌组织的Fas蛋白阳性表达率为35.71%，Fas mRNA阳性表达率为45.24%，明显低于其在癌旁组织及正常肺组织中的表达率（Fas蛋白阳性表达率分别为 69.04%和 85.71%，Fas mRNA阳性表达率分别为76.19%和 90.48%）。非小细胞肺癌组织Fas基因甲基化率64.29%明显高于其在癌旁组织及正常肺组织中的甲基化率（分別为30.95%和21.43%）。非小细胞肺癌Fas蛋白、Fas mRNA分别与Fas基因甲基化呈显著负相关（Fas蛋白：r=﹣0.471， P<0.01；Fas mRNA：r=﹣0.469， P<0.01）。结论：与癌旁组织及正常肺组织相比，非小细胞肺癌组织中存在显著的Fas基因高甲基化，Fas mRNA及Fas蛋白表达下调。非小细胞肺癌Fas表达与Fas基因甲基化显著负相关。结果提示，Fas基因高甲基化可能导致Fas基因失活，从而影响肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤细胞异常增殖及免疫逃逸。
【关键词】Fas基因甲基化；Fas蛋白；Fas mRNA；非小细胞肺癌
Fas属肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族成员。Fas/FasL介导凋亡途径是调控多种细胞凋亡的重要机制 [1]。肿瘤细胞Fas水平下调可致肿瘤细胞凋亡受到抑制，导致肿瘤细胞免疫逃逸 [2]。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基[3-4]。DNA异常甲基化能使原癌基因活化和抑癌基因失活[5]从而导致肿瘤的发生。
目前肺癌Fas基因甲基化与Fas蛋白和Fas mRNA的表达间是否存在相关性尚不明确。本研究旨在探讨非小细胞肺癌Fas蛋白、Fas mRNA的表达与Fas基因甲基化的相关性。
1 组织标本
苏州大学附属第一医院就诊手术治疗并经病理诊断的非小细胞肺癌病例42例，其中鳞癌16例，腺癌26例，均选取癌组织、癌旁组织及正常肺组织。男性患者15例，女性患者27例。患者年龄分布为47-73岁，平均年龄为60±5.37岁。
2 方法
采用免疫组化方法、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法及甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）法分别检测非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白、Fas mRNA的表达及Fas基因甲基化状态。采用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析。检验显著性水准取α=0.05，以P<0.05为具有统计学意义。
3 结果
3.1 非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白和Fas mRNA的表达
非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas蛋白和Fas mRNA的表达情况见表1。Fas蛋白及Fas mRNA阳性表达率在非小细胞肺癌组织中的表达显著低于其在癌旁组织和正常肺组织中的表达（P<0.01）。Fas蛋白及Fas mRNA阳性表达率在癌旁组织和正常肺组织中、鳞癌和腺癌组织中的表达均无显著统计学差异。
3.2 非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Fas基因甲基化状态
非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织Fas基因甲基化状态见表2。非小细胞肺癌组织Fas基因甲基化率显著高于癌旁组织及正常肺组织Fas基因甲基化率，P均<0.01。癌旁组织和正常肺组织及鳞癌组织与腺癌组织Fas基因甲基化率差异无统计学差异。
3.3 Fas基因甲基化状态与Fas蛋白、Fas mRNA表达的相关性
非小细胞肺癌Fas基因甲基化与Fas蛋白、Fas mRNA表达相关性分析见表3。经Spearman等级相关分析，Fas基因甲基化与Fas蛋白、Fas mRNA表达呈显著负相关。
表3. Fas基因甲基化状态与Fas蛋白、Fas mRNA表达的相关性
4. 讨论
既往研究表明，Fas系统异常表达引起正常细胞凋亡程序受阻是肿瘤组织免疫逃逸的重要机制之一[6]。本研究结果证实了非小细胞肺癌组织存在Fas mRNA及Fas蛋白表达下调的现象，提示非小细胞肺癌细胞可通过减少肿瘤细胞表面Fas表达，导致Fas/FasL介导的肿瘤细胞凋亡被抑制。
另一方面，研究发现DNA启动子区甲基化可导致转录沉默。Fas基因甲基化可能是导致Fas基因失活的重要原因之一。本实验结果显示，非小细胞肺癌组织存在显著的Fas基因高甲基化表现，Fas的甲基化水平与Fas mRNA和Fas蛋白的表达呈负相关，提示非小细胞肺癌组织中存在显著的Fas基因高甲基化导致Fas基因失活的现象，可能是导致Fas mRNA及Fas蛋白表达下调的原因之一[7-8]。
综上所述，我们的研究发现，非小细胞肺癌细胞中，Fas基因高甲基化导致该基因表达沉默可能是引起Fas表达下调或缺失的重要原因。Fas基因的甲基化水平越高， Fas mRNA及Fas蛋白表达下调程度越严重。因此，Fas基因甲基化检测可作为非小细胞肺癌早期诊断的检测指标之一，为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了潜在的新方向。 參考文献
[1]Frost P， Ng CP， Belldegrun A， et al. Immunosensitization of prostate carcinoma cell lines for lymphocytes （CTL， TIL， LAK）-mediated apoptosis via the Fas-Fas-ligand pathway of cytotoxicity. Cell Immunol 1997；180 （1）：70-83
[2]Strand S， Hofmann WJ， Hug H， et a1. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 （APO–1/Fas） ligand–expressing tumor cells-A mechanism of immune evasion. Nature Med 1996；2（12）：1361-1366
[3]Bodey B. Cancer-testis antigens： promising targets for antigen directed antineoplastic immunotherapy. Expert Opin Biol Ther 2002；2（6）：577-584
[4]Feinberg AP， Cui H， Ohlsson R. DNA methylation and genomic imprinting： insights from cancer into epigenetic mechanisms. Semin Cancer Biol 2002； 12（5）：389-398
[5]Kikuchi S， Yamada D， Fukami T. Hypermethylation of the TSLC1/IGSF4 promoter is associated with tobacco smoking and a poor prognosis in primary nonsmall cell lung carcinoma. Cancer 2006；106（8）：1751-1758
[6]Zhang B， Sun T， Xue L， et al.Functional polymorphisms in Fas and FasL contribute to increased apoptosis of tumor infiltration lym-phocytes and risk of breast cancer. Carcinogenesis 2007；28（5）：1067-1073
[7]Herman JG， Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter ypermethylation. N Engl J Med 2003；349（21）：2042-2054
[8]Weber M， Hellmann I， Stadler MB， et al. Distribution，silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet 2007；39（4）：457-466