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摘 要：采用抑菌圈法测定海洋溶菌酶、茶多酚及山梨酸钾对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株的最小抑菌浓度（MIC）并对其抑菌能力进行比较。实验结果表明，海洋溶菌酶可有效抑制多数水产腐败菌的生长，作为复配剂山梨酸钾、茶多酚也有各自的抑菌范围，三者最小抑菌浓度均在允许添加范围内。所以，海洋溶菌酶可以作为保鲜剂用于水产品保鲜。
关键词：海洋溶菌酶；茶多酚；山梨酸钾；抑菌圈
溶菌酶，又称细胞壁水解酶，通过水解细菌细胞壁肽聚糖β-1.4糖苷键导致细菌自溶死亡[1-2]。溶菌酶多由蛋清中提取，安全性能高，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，在医药、生物领域得到了广泛应用，但因其成本过高很难在食品保鲜领域推广使用。
海洋溶菌酶是一种新型酶制剂，由嗜低温海洋细菌经过发酵、纯化所得[3]。与蛋清溶菌酶相比，海洋溶菌酶不仅具有嗜低温、抗氧化、抑菌谱广等优点而且生产工艺简单、成本低廉。本文采用抑菌圈实验方法分别测定了海洋溶菌酶、茶多酚及山梨酸钾对水产品中主要腐败微生物的抑菌效果，为推广海洋溶菌酶作为生物保鲜剂奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 保鲜剂 海洋溶菌酶：黄海水产研究所产物资源室保存菌株S-12-86发酵所得，酶活力25 000 U/mg；茶多酚：安徽石台茶多酚厂生产 纯度>95% （食品级）；山梨酸钾：南宁赫斯特食品添加剂有限公司 （食品级）。
1.1.2 供试菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、腐败假单胞菌、腐败希瓦氏菌、嗜水气单胞菌、乳酸菌、副溶血弧菌。
1.1.3 培养基 细菌、弧菌等营养琼脂培养基或营养肉汤培养基按常规方法配制。
1.1.4 主要仪器 SW-GJ-IB标准超净工作台、恒温水浴锅、LDZX-40B型立式自控电热压力蒸汽灭菌器、内径90.0 mm平板。
1.2 实验方法
1.2.1 保鲜剂的制备 采用灭菌蒸馏水将海洋溶菌酶、山梨酸钾、茶多酚配置成不同浓度备用，具体见表1。
1.2.2 抑菌实验方法
1.2.2.1 制备菌悬液 将各供试菌种在培养基活化后，无菌操作下挑取菌落2个加入9 mL无菌生理盐水，使含菌数在106～107cfu/mL之间。
1.2.2.2 制备含菌平板 将已灭菌的培养基倾注于培养皿中制成平板，用移液管吸取0.2 mL各种菌悬液加入各自平板内，再用无菌玻璃涂布棒涂布均匀。
1.2.2.3 测定方法[4] 将直径为5 mm的滤纸圆片灭菌后在不同浓度保鲜液中浸泡5 min后，取6片滤纸（同一保鲜剂5个浓度梯度和空白对照）贴于含菌平板内，每种保鲜液重复三次，然后将平皿倒置于恒温箱中，培养24 h后用直尺测量各抑菌圈大小（直径mm）。
1.2.3 保鲜剂抑菌性能的测定
1.2.3.1 最小抑菌浓度（MIC） 抑菌圈直径大于6 mm的各保鲜液最低浓度为最小抑菌浓度。
1.2.3.2 抑菌性能的比较 将抑菌圈直径在10 mm以上的定为抑菌能力强（+++），8～10 mm定为抑菌能力较强（++），6～8 mm定为抑菌能力弱（+），5 mm为无抑菌能力（-）。
2 结果与分析
2.1 海洋溶菌酶的抑菌效果
海洋溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等供试菌种的抑制作用见表2。
从表3可以看出，山梨酸钾对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等菌株无抑制作用，而对枯草芽孢杆菌、乳酸菌有较强的抑制效果，对副溶血弧菌有微弱抑制作用。作为一种酸性防腐剂，山梨酸钾的防腐能力主要由食品pH值决定。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的适宜pH值偏中性，山梨酸钾在此环境中未解离的酸性分子较少，因此抑菌效果受到限制。
水产品的正常pH值在6.50 左右， 且随着贮藏时间的延长呈上升趋势。有文献报道[7]，在pH值3.15时有40%的山梨酸进入细胞内部， 而在pH值7.0时解离的山梨酸只有6.0%，由此可知山梨酸钾在水产品保鲜中抑菌能力随着贮藏时间的延长而减弱。
2.3 茶多酚的抑菌效果
茶多酚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等供试菌种的抑制作用见表4。
从表4可以看出，茶多酚对金黄色葡萄球菌、腐败假单胞菌和大肠杆菌有较强的抑制作用，浓度越高其抑菌效果越强。茶多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和腐败假单胞菌的最小抑菌浓度分别为800 mg/kg、800 mg/kg和1 500 mg/kg，均在水产品中允许最高添加量3 000 mg/kg以下，这与董金甫[8]和杨联松报道的茶多酚的最小抑菌浓度低于3 000 mg/kg相符合的。
2.4 抑菌能力比较
海洋溶菌酶及复配剂对腐败菌抑菌能力比较和最小抑菌浓度见表5、表6。
表5表明，海洋溶菌酶对多数水产腐败菌有较强的抑制效果，山梨酸钾、茶多酚作为复配剂可有效弥补海洋溶菌酶的不足。将其复配使用，不仅可以增强抑菌、抗氧化效果，而且可以减少对食品感官品质的影响[9]。表6实验结果表明，海洋溶菌酶、山梨酸钾和茶多酚对水产腐败菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为4 000、400、1 500 mg/L，均在各自允许添加范围内；海洋溶菌酶、茶多酚均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有很强的抑制效果，但海洋溶菌酶价格低廉，实际应用中可降低复合保鲜剂中茶多酚的用量。
3 结论
实验结果表明，海洋溶菌酶对除腐败希瓦氏菌、嗜水气单胞菌以外的微生物均有非常明显的抑菌作用，山梨酸钾通过
破坏细菌的重要酶系来抑制需氧性和pH值偏低的微生物，而茶多酚更是兼具有良好的抗氧化效果。海洋溶菌酶作为一种蛋白质与山梨酸钾、茶多酚具有良好的相容性，所以复合保鲜剂可安全地用于水产品保鲜。 海洋溶菌酶作为一种新型酶制剂已工业化生产且价格低廉，本文尝试将其用于水产保鲜取得一定效果，希望有更多的学者将其开发用于肉制品、果蔬保鲜中，使其成为一种新型生物保鲜剂。
参考文献：
[1] Sun DAO-PIN，DER-ING LIAO，STEPHEN J.REMINGTON. Electrostatic field in the active sites of lysozymes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：5361-5365
[2] Hisham R I，Tetsuji M，Takayoshi A. Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Letts，2001，506：27-32
[3] 张琇，王跃军，孙谧，等.海洋细菌S-12-86的产溶菌酶条件.中国水产科学，2007，14（3）： 425-429
[4] 马丽珍.冷却猪肉的生物和物理综合保鲜技术及保鲜机理研究[D].北京：中国农业大学博士学位论文，2003.6
[5] 杨向科，邹艳丽，孙谧，等.海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌机理初步研究.海洋水产研究，2005，26（5）：62-68
[6] Pelligrini，A.，Thomas，U.，Wild，P.et al.1992.Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character.J.Applied Bacteriology，72（3）：180-187
[7] 张嫚. 冷却牛肉保鲜技术研究[M].南京：南京农业大学硕士学位论文，2003.6
[8] 董金甫，李瑶卿，洪绍梅.茶多酚对8种致病菌最低抑制浓度的研究[J].食品科学，1995，16（1）：6-12
[9] 于开亮，李开雄，卢士玲. Nisin、茶多酚、壳聚糖复合保鲜冷却羊肉的配比优化研究.肉类工业，2007（12）：27-30
关键词：海洋溶菌酶；茶多酚；山梨酸钾；抑菌圈
溶菌酶，又称细胞壁水解酶，通过水解细菌细胞壁肽聚糖β-1.4糖苷键导致细菌自溶死亡[1-2]。溶菌酶多由蛋清中提取，安全性能高，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，在医药、生物领域得到了广泛应用，但因其成本过高很难在食品保鲜领域推广使用。
海洋溶菌酶是一种新型酶制剂，由嗜低温海洋细菌经过发酵、纯化所得[3]。与蛋清溶菌酶相比，海洋溶菌酶不仅具有嗜低温、抗氧化、抑菌谱广等优点而且生产工艺简单、成本低廉。本文采用抑菌圈实验方法分别测定了海洋溶菌酶、茶多酚及山梨酸钾对水产品中主要腐败微生物的抑菌效果，为推广海洋溶菌酶作为生物保鲜剂奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 保鲜剂 海洋溶菌酶：黄海水产研究所产物资源室保存菌株S-12-86发酵所得，酶活力25 000 U/mg；茶多酚：安徽石台茶多酚厂生产 纯度>95% （食品级）；山梨酸钾：南宁赫斯特食品添加剂有限公司 （食品级）。
1.1.2 供试菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、腐败假单胞菌、腐败希瓦氏菌、嗜水气单胞菌、乳酸菌、副溶血弧菌。
1.1.3 培养基 细菌、弧菌等营养琼脂培养基或营养肉汤培养基按常规方法配制。
1.1.4 主要仪器 SW-GJ-IB标准超净工作台、恒温水浴锅、LDZX-40B型立式自控电热压力蒸汽灭菌器、内径90.0 mm平板。
1.2 实验方法
1.2.1 保鲜剂的制备 采用灭菌蒸馏水将海洋溶菌酶、山梨酸钾、茶多酚配置成不同浓度备用，具体见表1。
1.2.2 抑菌实验方法
1.2.2.1 制备菌悬液 将各供试菌种在培养基活化后，无菌操作下挑取菌落2个加入9 mL无菌生理盐水，使含菌数在106～107cfu/mL之间。
1.2.2.2 制备含菌平板 将已灭菌的培养基倾注于培养皿中制成平板，用移液管吸取0.2 mL各种菌悬液加入各自平板内，再用无菌玻璃涂布棒涂布均匀。
1.2.2.3 测定方法[4] 将直径为5 mm的滤纸圆片灭菌后在不同浓度保鲜液中浸泡5 min后，取6片滤纸（同一保鲜剂5个浓度梯度和空白对照）贴于含菌平板内，每种保鲜液重复三次，然后将平皿倒置于恒温箱中，培养24 h后用直尺测量各抑菌圈大小（直径mm）。
1.2.3 保鲜剂抑菌性能的测定
1.2.3.1 最小抑菌浓度（MIC） 抑菌圈直径大于6 mm的各保鲜液最低浓度为最小抑菌浓度。
1.2.3.2 抑菌性能的比较 将抑菌圈直径在10 mm以上的定为抑菌能力强（+++），8～10 mm定为抑菌能力较强（++），6～8 mm定为抑菌能力弱（+），5 mm为无抑菌能力（-）。
2 结果与分析
2.1 海洋溶菌酶的抑菌效果
海洋溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等供试菌种的抑制作用见表2。
从表3可以看出，山梨酸钾对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等菌株无抑制作用，而对枯草芽孢杆菌、乳酸菌有较强的抑制效果，对副溶血弧菌有微弱抑制作用。作为一种酸性防腐剂，山梨酸钾的防腐能力主要由食品pH值决定。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的适宜pH值偏中性，山梨酸钾在此环境中未解离的酸性分子较少，因此抑菌效果受到限制。
水产品的正常pH值在6.50 左右， 且随着贮藏时间的延长呈上升趋势。有文献报道[7]，在pH值3.15时有40%的山梨酸进入细胞内部， 而在pH值7.0时解离的山梨酸只有6.0%，由此可知山梨酸钾在水产品保鲜中抑菌能力随着贮藏时间的延长而减弱。
2.3 茶多酚的抑菌效果
茶多酚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等供试菌种的抑制作用见表4。
从表4可以看出，茶多酚对金黄色葡萄球菌、腐败假单胞菌和大肠杆菌有较强的抑制作用，浓度越高其抑菌效果越强。茶多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和腐败假单胞菌的最小抑菌浓度分别为800 mg/kg、800 mg/kg和1 500 mg/kg，均在水产品中允许最高添加量3 000 mg/kg以下，这与董金甫[8]和杨联松报道的茶多酚的最小抑菌浓度低于3 000 mg/kg相符合的。
2.4 抑菌能力比较
海洋溶菌酶及复配剂对腐败菌抑菌能力比较和最小抑菌浓度见表5、表6。
表5表明，海洋溶菌酶对多数水产腐败菌有较强的抑制效果，山梨酸钾、茶多酚作为复配剂可有效弥补海洋溶菌酶的不足。将其复配使用，不仅可以增强抑菌、抗氧化效果，而且可以减少对食品感官品质的影响[9]。表6实验结果表明，海洋溶菌酶、山梨酸钾和茶多酚对水产腐败菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为4 000、400、1 500 mg/L，均在各自允许添加范围内；海洋溶菌酶、茶多酚均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有很强的抑制效果，但海洋溶菌酶价格低廉，实际应用中可降低复合保鲜剂中茶多酚的用量。
3 结论
实验结果表明，海洋溶菌酶对除腐败希瓦氏菌、嗜水气单胞菌以外的微生物均有非常明显的抑菌作用，山梨酸钾通过
破坏细菌的重要酶系来抑制需氧性和pH值偏低的微生物，而茶多酚更是兼具有良好的抗氧化效果。海洋溶菌酶作为一种蛋白质与山梨酸钾、茶多酚具有良好的相容性，所以复合保鲜剂可安全地用于水产品保鲜。 海洋溶菌酶作为一种新型酶制剂已工业化生产且价格低廉，本文尝试将其用于水产保鲜取得一定效果，希望有更多的学者将其开发用于肉制品、果蔬保鲜中，使其成为一种新型生物保鲜剂。
参考文献：
[1] Sun DAO-PIN，DER-ING LIAO，STEPHEN J.REMINGTON. Electrostatic field in the active sites of lysozymes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：5361-5365
[2] Hisham R I，Tetsuji M，Takayoshi A. Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Letts，2001，506：27-32
[3] 张琇，王跃军，孙谧，等.海洋细菌S-12-86的产溶菌酶条件.中国水产科学，2007，14（3）： 425-429
[4] 马丽珍.冷却猪肉的生物和物理综合保鲜技术及保鲜机理研究[D].北京：中国农业大学博士学位论文，2003.6
[5] 杨向科，邹艳丽，孙谧，等.海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌机理初步研究.海洋水产研究，2005，26（5）：62-68
[6] Pelligrini，A.，Thomas，U.，Wild，P.et al.1992.Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character.J.Applied Bacteriology，72（3）：180-187
[7] 张嫚. 冷却牛肉保鲜技术研究[M].南京：南京农业大学硕士学位论文，2003.6
[8] 董金甫，李瑶卿，洪绍梅.茶多酚对8种致病菌最低抑制浓度的研究[J].食品科学，1995，16（1）：6-12
[9] 于开亮，李开雄，卢士玲. Nisin、茶多酚、壳聚糖复合保鲜冷却羊肉的配比优化研究.肉类工业，2007（12）：27-30