【摘 要】
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γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是生物体内谷氨酰循环的关键酶,可广泛应用于多种γ-谷氨酰基化合物的生物合成。但其在体外催化环境下(p H>9.0)极易发生不可逆失活,限制其生物催化领域
【基金项目】
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国家自然科学基金(21206072);江苏省自然科学基金(BK2012825);江苏省农业支撑计划项目(BE2012399)
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γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是生物体内谷氨酰循环的关键酶,可广泛应用于多种γ-谷氨酰基化合物的生物合成。但其在体外催化环境下(p H>9.0)极易发生不可逆失活,限制其生物催化领域的实际应用。本实验以枯草芽孢杆菌B.subtilis NX-2 GGT(wt_GGT)为对象,采用同源建模获得wt_GGT的3D结构预测模型;分析wt_GGT大、小亚基表面氨基酸残基的性质、空间位置和保守性,最终选取Asp46、Thr201、Tyr280、Gln322、Glu502和His543为候选位点;通过定点突变将候选位点分别替换为缬氨酸,以期通过提高wt_GGT大小亚基间的疏水作用,改善其p H耐受性。研究成功实现了6种突变酶(D46V、T201V、Y280V、E502V、Q322V和H543V)的异源表达,并分别研究了其催化活性和稳定性。结果表明:D46V、Y280V、E502V、H543V的Km略小于wt_GGT,且Y280V的kcat较wt_GGT有明显提高;D46V、Y280V和E502V的p H稳定性均较wt_GGT有所改善,其中Y280V的p H稳定性最高;模型分析显示,在<10?范围内,Y280V可与附近4个氨基酸残基(Y-283、W-277、I-501和I-497)产生疏水相互作用,这可能是其p H耐受性较强的主要原因。
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