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[摘要] 目的 依据穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的稳定性机理，结合清火栀麦片的制法，以君药穿心莲主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为指标，优化HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲含量的提取条件。 方法 分析比较不同提取溶剂、提取方法、提取时间及提取温度对HPLC法测定穿心莲含量结果的影响。 结果 与其他提取溶剂相比，甲醇对穿心莲的提取效率较高，且提取液的杂质含量更低；提取中超声前是否冷浸、加冰或常温对检测结果影响不大；提取时超声1 h较超声30 min的提取效果更好；而在低温时，随着温度的上升有助于主要成分的提取，但当温度超过60℃时发生降解。 结论 以甲醇为溶媒，常温超声1 h时提取纯度和提取效率较优。
[关键词] 清火栀麦片；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；甲醇；超声
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）22-0039-04
[Abstract] Objective To optimize the extraction conditions of HPLC for the determination of andrographis paniculata in Qinghuo Zhimai tablets， based on the stability mechanism of andrographolide and dehydroandrographolide combined with the preparation method of Qinghuo Zhimai tablets， with the indicator of the main ingredient of herbs andrographis including andrographolide and dehydrated andrographolide. Methods The effects of different extraction solvents， extraction methods， extraction time and extraction temperature on the determination of andrographis paniculata by HPLC were analyzed and compared. Results Compared with other extraction solvents， the extraction efficiency of methanol to andrographis paniculata was higher， and the impurity content of the extract was lower. Whether cold dip， adding ice，room temperature or not had little effect on the detection result. The extraction effect of ultrasound for 1 h was better than that of ultrasound for 30 min. While at low temperature， the increase of temperature was helpful to the extraction of the main components， but the degradation occurred when the temperature exceeded 60℃. Conclusion The extraction purity and extraction efficiency were better when using methanol as the solvent at room temperature for 1 h.
[Key words] Qinghuo Zhimai tablets； Andrographolide； Dehydroandrographolide； Methanol； Ultrasound
清火梔麦片是由穿心莲、栀子和麦冬三味药组成，取部分穿心莲和麦冬粉碎成细粉、剩余穿心莲和栀子经水煎煮、浓缩成稠膏，最后加入细粉混匀压制而成的具有清热解毒、凉血消肿功效的中药片剂[1]。其主要成分穿心莲又名一见喜、苦草、四方草、印度草等，为爵床科植物的干燥地上部分。味苦、性寒，归心、肺、大肠、膀胱经。《泉州本草》记载其有“清热解毒、消炎退肿，治疗咽喉炎、痢疾、高热等功效”，为清热解毒类常用中草药，素有“中药抗生素”的美誉[2，3]。故现清火栀麦片常用于临床咽喉肿痛、急性扁桃体炎、发热、头痛、牙痛、目赤、心火旺盛、睡眠不佳等症状的患者。
随着清火栀麦片的临床应用，有关其分析方法的研究也日益增多。早年其有效成分的测定方法有比色法、重量法等[3]，近年多以薄层扫描法[4，5]、高效液相色谱法（HPLC）等为主[6-9]，此外随着检测技术的发展新型色谱法以及质谱法等也用于其测定[10， 11]。但因HPLC法专属性强、灵敏度高，含量测定准确且重现性好等优点，HPLC法测定清火栀麦片有效成分的方法研究较多。其检测多用紫外可见检测器、二极管阵列检测器等[3，12，13]，且随着分析方法的进一步探索可同时准确测定2～3种有效成分[14-18]。故本文主要是依据穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的稳定性机理，从提取方式、提取溶媒以及热稳定性的角度出发研究清火栀麦片中穿心莲含量测定的影响因素。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪，DAD检测器；UPT-Ⅱ-10T型制水器，成都超纯科技有限公司；Mettler XS-205型电子天平；HH-8数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；KQ5200E型超声波清洗器，工作频率40 kHz，功率200 W，昆山市超声仪器有限公司。 1.2 样品与试剂
清火栀麦片，批号：140505，广西圣特药业有限公司；批号120601，广西金海堂药业有限责任公司；批号：110208，广西圣特药业有限公司；穿心莲内酯，批号0797-200106，含量100%，经五氧化二磷减压干燥处理12 h以上，中检院提供；脱水穿心莲内酯，批号0854-200204，含量100%，经五氧化二磷减压干燥处理12 h 以上，中检院提供；除流动相用甲醇为色谱纯，其余均为分析纯。
2含量测定
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C-18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇-水（55∶45），流速：1 mL/min；检测波长：穿心莲内酯230 nm，脱水穿心莲内酯250 nm；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取穿心莲内酯19.19 mg和脱水穿心莲内酯15.86 mg制成每1 mL各含38.38 μg和31.72 μg的混合对照品溶液。
2.3含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4提取溶剂的考察
查《中国药典》（2015年版）穿心莲药材、穿心莲片和清火栀麦片含量测定的提取溶剂，再结合蔡松涛等[19]对穿心莲片中含量测定提取溶剂的考察结果，本文在其研究基础上分析比较甲醇、70%甲醇与乙醇的提取效率，结果与蔡松涛等[19]的研究一致：甲醇对穿心莲的提取效率最高，且提取液的杂质含量更低。（1.6805 mg/片>1.5085 mg/片）。
2.5 提取方法与时间的考察
设定超声提取30 min[1]、超声提取1 h；加冰超声提取30 min、45 min和1 h；先冷浸1 h再超声提取1 h及回流提取1 h[20]作为考察对象。方法：取同批清火栀麦片（140505）20片，去糖衣，称总重，研细，取细粉约0.3 g，精密称定，再精密加入甲醇50 mL，称定重量，按上述各种方式提取，放冷，用甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.3测定。见封三图5、表1。
2.6 提取温度的考察
多个文献报道[21-23]，穿心莲主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对热不稳定。特别是在高热[24]（90℃、100℃、110℃、120℃）的情况下，随着温度的升高，两者的降解速度加剧；其中穿心莲内酯随着温度的升高转化率降低，几乎以降解为主，脱水穿心莲内酯的降解速度随温度升高快于穿心莲内酯。结合文献，本人比较了加冰超声、常温超声（不设置温度，水温会随超声时间的延长而升高）、40℃、50℃、60℃和70℃恒温超声提取1 h的提取效果。方法：取同批清火栀麦片（140505）细粉约0.3 g，精密称定，再精密加入甲醇50 mL，称定重量，按上述各种方式提取，放冷，用甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.3测定。见图1、表1。
3讨论
《中国药典》（2015年版）新标准是在2010年版药典和苏建等[21]对清火栀麦胶囊HPLC特征图谱的建立和3种成分测定的基础上建立的新标准，其含量提取方法将提取溶剂更换为70%甲醇，超声功率从原来的250 W，33 kHz更改为250 W，40 kHz，物料比和超声时间30 min不变。本次实验对提取条件的考察是在2015年版《中国药典》标准的基础上进行改进，期望通过优化提取条件，进一步提高测定的准确性。
一些研究发现，清火栀麦片中穿心莲主要成分含量随着贮藏时间的延长逐渐降低。而清火栀麦片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量变化的考察结果[22]也显示，清火栀麦片在温度（40.0±2.0）℃，相对湿度为（75.0±5.0）% 条件下6个月后，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量都发生了变化。其中穿心莲内酯含量随着时间相应降低，而脱水穿心莲内酯含量则随着放置时间的延长先增加而后趋于平缓，但其增加的量与穿心莲内酯降解的量并不成正比，提示在高温下，穿心莲内酯可能一部分转换成脱水穿心莲内酯。此外，一项分析穿心莲片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯变异因素的试验[21]提出，采用新鲜的穿心莲药材，减少药典工艺中的加热时间和温度等影响因素，是提高穿心莲片质量的有效途径。而清火栀麦片中的有效成分亦为穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯，故可推测加热时间和温度可以影响其含量测定。而以上结果均提示清火栀麦片中的有效成分存在不稳定性，即提取条件可能影响其测定的准确性。但因清火栀麦片中穿心莲主成分的不稳定性，其提取条件可能影响HPLC法的测定。如颜玉贞[22]報道，穿心莲中的主成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯不稳定，随贮藏时间的延长部分穿心莲内酯会转化为脱水穿心莲内酯；曾慧芳等[20]报道，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在杂质较少的状态下相对较稳定，在高温加热状态下穿心莲内酯以降解为主，转化为辅；另有何咏梅[21]采用初均速法研究清火栀麦片中栀子苷的稳定性，发现栀子苷在25℃下降解10%的时间为1.62年；黄竹英等[18]采用加速稳定性试验法研究清火栀麦片的稳定性，发现放置6 个月之后栀子苷含量无显著差异，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量则均下降，并指出清火栀麦片不适宜存放于高温高湿环境。
故本文结合相关实验研究，通过对提取溶剂、提取方法、提取时间以及提取温度的比较，对清火栀麦片中穿心莲含量测定的提取条件进行优化。查阅文献发现，HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲含量时的提取溶剂包括乙醇、70%乙醇、50%乙醇和甲醇等[4-8]，而周国儿等[6]研究显示70%乙醇较50%乙醇提取效果好，故我们选择乙醇、70%乙醇和甲醇作为提取溶剂分别试验，结果发现甲醇对穿心莲的提取效率最高，且提取液的杂质含量更低。而后我们综合以往研究中的不同提取方法[4-8]，选择比较超声提取、先冷浸再超声提取和加热回流提取三种不同提取方法，结果发现，先冷浸再超声较直接超声的提取效率稍高，但无显著差异；而加热回流提取的效率较超声和先浸再超法显著降低，故穿心莲的提取选择直接超声法即可。但不同提取方法时（冷超和热超），超声提取1 h的效率均较30 min好，故提取1 h的时间可能更为合理。穿心莲的稳定性试验结果[19-22，24]提示，穿心莲主要成分对热不稳定，特别是在高热时会随着温度的升高加速降解。故我们比较了加冰、常温、40℃、50℃、60℃和70℃等不同温度下超声1h的提取效率，结果发现，加冰和常温超声的提取效果较好，在低温（<60℃）的情况下，随着温度的上升有助于主要成分的提取，但当温度超过60℃时提取效率降低。提示提取温度过高时清火栀麦片主要成分可能发生降解，且该结果可能提示了穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯热降解动力学的温度拐点。 综上，甲醇常温超声1 h为清火栀麦片中穿心莲含量测定的合适提取条件。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中国药典[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：1535.
[2] 贺奋义.穿心莲内酯提取方法及其药理作用研究进展[J].中兽医医药杂志，2010，29（5）： 27-29.
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[4] 徐东来，陈红军. 薄层扫描法测定清火栀麦片中脱水穿心莲内酯的含量[J]. 中国药品标准，2001，2（1）：37-39.
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[14] 郭敏，钟保恒，李可林. HPLC法同时测定清火栀麦胶囊中脱水穿心莲内酯和栀子苷的含量[J]. 药物分析杂志，2008，（11）：1921-1923.
[15] 颜军，苟小军，邬晓勇，等. HPLC法测定穿心莲中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量[J]. 安徽农业科学，2009，37（8）：3576-3577.
[16] 陈深. HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量[J]. 海峡药学，2008，20（7）：75-77.
[17] 蓝晓玉，林华. HPLC法同时测定清火栀麦片中3种有效成分的含量[J]. 藥物分析杂志，2011，（2）：228-230.
[18] 黄竹英，李淑如，覃仁安.清火栀麦片的稳定性研究[J].药学研究，2015，34（5）：285-288 .
[19] 蔡松涛，陈向红，马琳，等.影响穿心莲片中穿心莲、内酯和脱水穿心莲内酯含量测定的因素[J]. 中成药，2005， 27（3）：361-362.
[20] 曾惠芳，黄晓丹，苏子仁，等.试析穿心莲片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的变异因素[J]. 中药新药与临床药理，2006，17（4）：299-302.
[21] 何咏梅，陈燕军.清火栀麦片的稳定性研究[J].中南药学，2003，1（1）：28-29.
[22] 颜玉贞、谢培山.穿心莲质量控制的再评价[J].中药新药与临床药理，1998，9（4）：204-206.
[23] 黄晓丹，苏子仁，赖小平，等.穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和穿心莲SFE-CO2萃取物的热降解动力学[J].中药新药与临床药理，2003，14（1）：53-56.
[24] 苏建，刘永利.清火栀麦胶囊HPLC特征图谱的建立和3种成分的测定[J].中成药，2016，38（4）：810-815.
（收稿日期：2017-04-21）
[关键词] 清火栀麦片；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；甲醇；超声
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）22-0039-04
[Abstract] Objective To optimize the extraction conditions of HPLC for the determination of andrographis paniculata in Qinghuo Zhimai tablets， based on the stability mechanism of andrographolide and dehydroandrographolide combined with the preparation method of Qinghuo Zhimai tablets， with the indicator of the main ingredient of herbs andrographis including andrographolide and dehydrated andrographolide. Methods The effects of different extraction solvents， extraction methods， extraction time and extraction temperature on the determination of andrographis paniculata by HPLC were analyzed and compared. Results Compared with other extraction solvents， the extraction efficiency of methanol to andrographis paniculata was higher， and the impurity content of the extract was lower. Whether cold dip， adding ice，room temperature or not had little effect on the detection result. The extraction effect of ultrasound for 1 h was better than that of ultrasound for 30 min. While at low temperature， the increase of temperature was helpful to the extraction of the main components， but the degradation occurred when the temperature exceeded 60℃. Conclusion The extraction purity and extraction efficiency were better when using methanol as the solvent at room temperature for 1 h.
[Key words] Qinghuo Zhimai tablets； Andrographolide； Dehydroandrographolide； Methanol； Ultrasound
清火梔麦片是由穿心莲、栀子和麦冬三味药组成，取部分穿心莲和麦冬粉碎成细粉、剩余穿心莲和栀子经水煎煮、浓缩成稠膏，最后加入细粉混匀压制而成的具有清热解毒、凉血消肿功效的中药片剂[1]。其主要成分穿心莲又名一见喜、苦草、四方草、印度草等，为爵床科植物的干燥地上部分。味苦、性寒，归心、肺、大肠、膀胱经。《泉州本草》记载其有“清热解毒、消炎退肿，治疗咽喉炎、痢疾、高热等功效”，为清热解毒类常用中草药，素有“中药抗生素”的美誉[2，3]。故现清火栀麦片常用于临床咽喉肿痛、急性扁桃体炎、发热、头痛、牙痛、目赤、心火旺盛、睡眠不佳等症状的患者。
随着清火栀麦片的临床应用，有关其分析方法的研究也日益增多。早年其有效成分的测定方法有比色法、重量法等[3]，近年多以薄层扫描法[4，5]、高效液相色谱法（HPLC）等为主[6-9]，此外随着检测技术的发展新型色谱法以及质谱法等也用于其测定[10， 11]。但因HPLC法专属性强、灵敏度高，含量测定准确且重现性好等优点，HPLC法测定清火栀麦片有效成分的方法研究较多。其检测多用紫外可见检测器、二极管阵列检测器等[3，12，13]，且随着分析方法的进一步探索可同时准确测定2～3种有效成分[14-18]。故本文主要是依据穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的稳定性机理，从提取方式、提取溶媒以及热稳定性的角度出发研究清火栀麦片中穿心莲含量测定的影响因素。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪，DAD检测器；UPT-Ⅱ-10T型制水器，成都超纯科技有限公司；Mettler XS-205型电子天平；HH-8数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；KQ5200E型超声波清洗器，工作频率40 kHz，功率200 W，昆山市超声仪器有限公司。 1.2 样品与试剂
清火栀麦片，批号：140505，广西圣特药业有限公司；批号120601，广西金海堂药业有限责任公司；批号：110208，广西圣特药业有限公司；穿心莲内酯，批号0797-200106，含量100%，经五氧化二磷减压干燥处理12 h以上，中检院提供；脱水穿心莲内酯，批号0854-200204，含量100%，经五氧化二磷减压干燥处理12 h 以上，中检院提供；除流动相用甲醇为色谱纯，其余均为分析纯。
2含量测定
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C-18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇-水（55∶45），流速：1 mL/min；检测波长：穿心莲内酯230 nm，脱水穿心莲内酯250 nm；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取穿心莲内酯19.19 mg和脱水穿心莲内酯15.86 mg制成每1 mL各含38.38 μg和31.72 μg的混合对照品溶液。
2.3含量测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4提取溶剂的考察
查《中国药典》（2015年版）穿心莲药材、穿心莲片和清火栀麦片含量测定的提取溶剂，再结合蔡松涛等[19]对穿心莲片中含量测定提取溶剂的考察结果，本文在其研究基础上分析比较甲醇、70%甲醇与乙醇的提取效率，结果与蔡松涛等[19]的研究一致：甲醇对穿心莲的提取效率最高，且提取液的杂质含量更低。（1.6805 mg/片>1.5085 mg/片）。
2.5 提取方法与时间的考察
设定超声提取30 min[1]、超声提取1 h；加冰超声提取30 min、45 min和1 h；先冷浸1 h再超声提取1 h及回流提取1 h[20]作为考察对象。方法：取同批清火栀麦片（140505）20片，去糖衣，称总重，研细，取细粉约0.3 g，精密称定，再精密加入甲醇50 mL，称定重量，按上述各种方式提取，放冷，用甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.3测定。见封三图5、表1。
2.6 提取温度的考察
多个文献报道[21-23]，穿心莲主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对热不稳定。特别是在高热[24]（90℃、100℃、110℃、120℃）的情况下，随着温度的升高，两者的降解速度加剧；其中穿心莲内酯随着温度的升高转化率降低，几乎以降解为主，脱水穿心莲内酯的降解速度随温度升高快于穿心莲内酯。结合文献，本人比较了加冰超声、常温超声（不设置温度，水温会随超声时间的延长而升高）、40℃、50℃、60℃和70℃恒温超声提取1 h的提取效果。方法：取同批清火栀麦片（140505）细粉约0.3 g，精密称定，再精密加入甲醇50 mL，称定重量，按上述各种方式提取，放冷，用甲醇补足减失重量，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.3测定。见图1、表1。
3讨论
《中国药典》（2015年版）新标准是在2010年版药典和苏建等[21]对清火栀麦胶囊HPLC特征图谱的建立和3种成分测定的基础上建立的新标准，其含量提取方法将提取溶剂更换为70%甲醇，超声功率从原来的250 W，33 kHz更改为250 W，40 kHz，物料比和超声时间30 min不变。本次实验对提取条件的考察是在2015年版《中国药典》标准的基础上进行改进，期望通过优化提取条件，进一步提高测定的准确性。
一些研究发现，清火栀麦片中穿心莲主要成分含量随着贮藏时间的延长逐渐降低。而清火栀麦片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量变化的考察结果[22]也显示，清火栀麦片在温度（40.0±2.0）℃，相对湿度为（75.0±5.0）% 条件下6个月后，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量都发生了变化。其中穿心莲内酯含量随着时间相应降低，而脱水穿心莲内酯含量则随着放置时间的延长先增加而后趋于平缓，但其增加的量与穿心莲内酯降解的量并不成正比，提示在高温下，穿心莲内酯可能一部分转换成脱水穿心莲内酯。此外，一项分析穿心莲片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯变异因素的试验[21]提出，采用新鲜的穿心莲药材，减少药典工艺中的加热时间和温度等影响因素，是提高穿心莲片质量的有效途径。而清火栀麦片中的有效成分亦为穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯，故可推测加热时间和温度可以影响其含量测定。而以上结果均提示清火栀麦片中的有效成分存在不稳定性，即提取条件可能影响其测定的准确性。但因清火栀麦片中穿心莲主成分的不稳定性，其提取条件可能影响HPLC法的测定。如颜玉贞[22]報道，穿心莲中的主成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯不稳定，随贮藏时间的延长部分穿心莲内酯会转化为脱水穿心莲内酯；曾慧芳等[20]报道，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在杂质较少的状态下相对较稳定，在高温加热状态下穿心莲内酯以降解为主，转化为辅；另有何咏梅[21]采用初均速法研究清火栀麦片中栀子苷的稳定性，发现栀子苷在25℃下降解10%的时间为1.62年；黄竹英等[18]采用加速稳定性试验法研究清火栀麦片的稳定性，发现放置6 个月之后栀子苷含量无显著差异，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量则均下降，并指出清火栀麦片不适宜存放于高温高湿环境。
故本文结合相关实验研究，通过对提取溶剂、提取方法、提取时间以及提取温度的比较，对清火栀麦片中穿心莲含量测定的提取条件进行优化。查阅文献发现，HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲含量时的提取溶剂包括乙醇、70%乙醇、50%乙醇和甲醇等[4-8]，而周国儿等[6]研究显示70%乙醇较50%乙醇提取效果好，故我们选择乙醇、70%乙醇和甲醇作为提取溶剂分别试验，结果发现甲醇对穿心莲的提取效率最高，且提取液的杂质含量更低。而后我们综合以往研究中的不同提取方法[4-8]，选择比较超声提取、先冷浸再超声提取和加热回流提取三种不同提取方法，结果发现，先冷浸再超声较直接超声的提取效率稍高，但无显著差异；而加热回流提取的效率较超声和先浸再超法显著降低，故穿心莲的提取选择直接超声法即可。但不同提取方法时（冷超和热超），超声提取1 h的效率均较30 min好，故提取1 h的时间可能更为合理。穿心莲的稳定性试验结果[19-22，24]提示，穿心莲主要成分对热不稳定，特别是在高热时会随着温度的升高加速降解。故我们比较了加冰、常温、40℃、50℃、60℃和70℃等不同温度下超声1h的提取效率，结果发现，加冰和常温超声的提取效果较好，在低温（<60℃）的情况下，随着温度的上升有助于主要成分的提取，但当温度超过60℃时提取效率降低。提示提取温度过高时清火栀麦片主要成分可能发生降解，且该结果可能提示了穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯热降解动力学的温度拐点。 综上，甲醇常温超声1 h为清火栀麦片中穿心莲含量测定的合适提取条件。
[参考文献]
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（收稿日期：2017-04-21）