目的 探讨人表皮中具有未分化特性的表皮干细胞和角质形成细胞之间微小RNA(micro-RNA,miRNA)表达谱的差异. 方法 (1)采用酶消化法和Ⅳ型胶原快速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞及角质形成细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫细胞化学染色法行β1整合素、角蛋白1(keratin 1,CK1)、CK10、CK19单克隆抗体检测鉴定.(2)Trizol 一步法分别提取表皮干细胞和角质形成细胞总RNA,甲醛变性胶电泳质检.mirVanaTM miRNA分离试剂盒对其进行纯化,使用miRNA标记和杂交试剂盒进行荧光标记及芯片杂交,利用FeatureExtraction(V 10.7)软件对杂交图片进行分析,GeneSpring(GX 10.0)软件进行数据归一化及差异分析,同时应用RT-PCR法验证miRNA芯片结果的可靠性.(3)预测差异表达的miRNA的靶基因. 结果 (1)快速黏附于Ⅳ型胶原的细胞群培养3d能形成明显克隆,免疫细胞化学染色显示β1整合素及CK19呈阳性表达,为表皮干细胞;不能快速黏附于Ⅳ型胶原的细胞群培养3d无明显克隆形成,CK1及CK10呈阳性表达,为已分化角质形成细胞.(2)筛选出表皮干细胞中表达上调的miRNA 31个,表达下调的miRNA 153个.其中显著上调的miRNA有hsa-miRNA-125b-3p、hsa-miRNA-197-5p、hsa-miRNA-376a-3p等;显著下调的miRNA有hsa-miRNA-203、hsa-miRNA-29b-3p、hsa-miRNA-34a-3p等.其中上调的hsa-miRNA-197-5p和下调的hsa-miRNA-29b-3p的RT-PCR验证结果与芯片检测结果具有较好的一致性.(3)部分miRNA靶基因预测提示miRNA与细胞增殖分化、凋亡衰老等生物学特性有关. 结论 人表皮干细胞与角质形成细胞的miRNA表达存在明显差异,可能与两者不同的增殖分化能力等生物学特性有关。
不同发育阶段表皮细胞微小RNA的差异表达谱分析
【摘 要】
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目的 探讨人表皮中具有未分化特性的表皮干细胞和角质形成细胞之间微小RNA(micro-RNA,miRNA)表达谱的差异. 方法 (1)采用酶消化法和Ⅳ型胶原快速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞及角质形成细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫细胞化学染色法行β1整合素、角蛋白1(keratin 1,CK1)、CK10、CK19单克隆抗体检测鉴定.(2)Trizol 一步法分别提取表皮干细
【机 构】
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330006南昌大学第一附属医院心血管科,330006南昌大学第一附属医院烧伤中心,330006南昌大学第一附属医院烧伤中心
【出 处】
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中华创伤杂志
【发表日期】
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2014年30期
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