论文部分内容阅读
摘要：目的 建立养血生发合剂的质量标准。方法 采用TLC对本品中当归、补骨脂进行定性鉴别。采用HPLC对本品中大黄素进行含量测定。采用单因素试验法，对含量测定中供试品溶液的前处理方法进行考察。结果 可检出当归和补骨脂且阴性无干扰。大黄素在6.17～79.35 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y=34.43x+5.31（R2=0.999 8），平均加样回收率为103.42%（RSD=2.16%，n=6），其余方法学考察项均合格。结论 所建立的质量标准可以用于养血生发合剂的质量控制。
关键词：养血生发合剂;质量标准;薄层鉴别;含量测定;大黄素
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）03-0072-04
养血生发合剂是昆明市中医医院的院内制剂，运用于临床长达30余年。该制剂由制何首乌、当归、补骨脂（盐）、菟丝子（盐）、牛膝、茯苓共6味药经提取后制备而成，具有养血生发、乌须发的功效，用于肾气不足、气血亏虚所致的须发脱落、早白。方中制何首乌为君药，具有补肝肾、强筋骨、益精血、乌须发的功效，所含蒽醌类成分大黄素具有抗衰老、保护肝肾、增强免疫力等作用[1-3]，其余当归、补骨脂（盐）、菟丝子（盐）等药材亦具有保肝强肾、抗衰老、抗氧化、增强免疫功能等效果[4-6]。
由于该合剂现行质量标准内容过于简单，检查项目专属性不强，且没有含量测定项，很难实现对该制剂的质量控制。因此，本研究采用TLC法对方中各药味进行定性鉴别研究，以建立快速、灵敏、专属性强的定性鉴别方法;同时，采用单因素试验法，对含量测定中供试品溶液的制备条件进行考察，以确定适宜的供试品溶液制备方法，并采用HPLC法建立养血生发合剂中主要有效成分大黄素的含量测定方法，为养血生发合剂的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 1100系列高效液相色谱仪（Agilent公司）;T-1000型电子天平（美国双杰兄弟有限公司）;Diamonsil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm，迪马科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）;硅胶G板（青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司）;点样毛细管（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2 试药 当归对照药材（批号：120927-201617），补骨脂对照药材（批号：121056-201605），大黄素对照品（批号：110756-201512，含量以98.7%计）均购自中国食品药品检定研究院。养血生发合剂（批号：180811、180812、180813，由昆明市中医医院提供）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1 当归的薄层鉴别 取本品20 mL，浓缩至约10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加無水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[7]。取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取不含当归的阴性样品溶液，按上述供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》（四部）通则0502进行试验，以硅胶G板为吸附剂，对照药材溶液、供试品溶液、阴性对照溶液点样量各5、10、10 μL，以正己烷-乙酸乙酯（7：1）为展开剂，展开，待晾干后于365 nm紫外光灯下检视。结果显示，供试品色谱与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。结果见图1。
2.1.2 补骨脂的鉴别 取本品20 mL，浓缩至约10 mL，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液[8]。取补骨脂对照药材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL超声提取10 min，滤过，料液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取不含补骨脂的阴性样品溶液，按上述供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》（四部）通则0502进行试验，以硅胶G板为吸附剂，各溶液点样量均为10 μl。以正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，待晾干后，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，于365 nm紫外光灯下检视。结果显示，供试品色谱与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。结果见图1。
2.2 大黄素含量测定
2.2.1 色谱条件及系统适应性 以Diamonsil C18为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（79：21）为流动相，254 nm为检测波长，在30℃柱温，10 μl进样量，1.0 mL/min流速条件下检测。理论板数按大黄素峰计算不低于5000，大黄素峰对称因子在0.95～1.05内，且该峰与附近峰分离度≥1.57，阴性对照无干扰。结果见图2。
2.2.2 对照品溶液的制备 取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密移取本品30 mL，水浴蒸干，取8%盐酸溶液20 mL分次加入蒸发皿中，溶解残渣并洗涤蒸发皿，溶解液合并洗涤液，移置圆底烧瓶中，加三氯甲烷20 mL，水浴加热回流3 h，取出，冷却。用分液漏斗分取三氯甲烷层（取10 mL三氯甲烷分次洗涤烧瓶，洗液并入分液漏斗中），剩余盐酸溶液再用三氯甲烷液萃取3次，每次15 mL，合并上述所有三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解定容至5 mL，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 取不含制何首乌的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 线性关系及范围考察 精密称取大黄素对照品（含量以98.7%计）0.01005 g，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取该溶液1mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，得浓度为79.35 μg/mL的溶液，取该溶液3mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，依次稀释，得浓度为28.56，17.14，10.28，6.17 μg/mL的对照品溶液。分别吸取上述各溶液，按照“2.2.1”项下的条件检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=34.43x+5.31（R2=0.999 8）。 2.2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下对照品溶液和“2.2.3”项下供试品溶液，按“2.2.1”项下条件，分别在0，4，8，12，16 h测定大黄素的峰面积，计算得对照品溶液峰面积的RSD=0.69%，供试品溶液峰面积得RSD=1.56%，表明二者的稳定性符合方法学要求。
2.2.7 重复性试验 取同一批次养血生发合剂6份，每份30mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下条件检测，计算得大黄素平均含量为6.34 μg/mL，RSD=1.87%（n=6），表明该方法重复性好。
2.2.8 准确度试验 取同一批次养血生发合剂（含量为6.34 μg/mL）6份，每份15 mL，分别加入浓度为44.29 μg/mL的大黄素对照品溶液各2 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按”2.2.1”项下方法进样测定，得平均加样回收率是103.42%，RSD=2.16%（n=6），表明所建方法符合含量测定要求。结果见表1。
2.2.9 含量测定 取3批次养血生发合剂（批号见表2），每批次取2份药液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下方法检测，计算大黄素含量。结果显示，3批次养血生发合剂中大黄素平均含量为6.33 μg/mL，RSD =1.32%。结果见表2。
3 讨论
本研究建立了养血生发合剂中当归、补骨脂的TLC鉴别方法。同时，由于薄层鉴别常受点样量、温度、湿度、薄层板厂家、样品批次等因素的影响，本研究依据《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则（试行）》对2药的鉴别进行了方法学考察。结果表明，在15℃～25℃，50%～90%湿度，两个不同厂家（青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司）薄层版条件下，3个批次养血生发合剂均可鉴别出当归和补骨脂。方中其余4药的TLC鉴别中，菟丝子、牛膝、茯苓均存在阴性干扰，何首乌中的大黄素已作为定量指标，故本研究并未建立何首乌及上述3味药的TLC鉴别方法。
本文对含量测定中供试品溶液的前处理方法进行了较系统的研究。结果表明，是否进行水解、水解所用酸的种类、所用酸的用量、水解时间、水解后酸液的萃取次数、水解所用酸的浓度对大黄素的检测均有影响，其中前4项影响较大，其余则影响较小。
本研究对当归中的阿魏酸进行了含量测定研究，发现其存在阴性干扰且含量偏低。在对菟丝子中的金丝桃苷进行测定时，未能检出金丝桃苷，推测可能与金丝桃苷在本合剂中的稳定性不佳有关。同时，补骨脂中的补骨脂素亦存在阴性干扰，而异补骨脂则未能检测到。牛膝中的β-蜕皮甾酮在原药材中的含量较低（2015年版中国药典规定应≥0.030%），考虑到处方药材制备为口服液后所含含量更低，故不宜作为定量指标。剩余的茯苓在药典中则无“含量测定”项，故本研究建立了何首乌中大黄素的含量测定方法。
参考文献：
[1]王亭，龚千锋.何首乌炮制后化学成分及药理作用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（2）：220-226.
[2]高任龙，王会肖，李晓娜，等.何首乌的药理毒理研究进展[J].河北医药，2015，37（2）：269-271.
[3]林艳，肖榕，李春，等.生/制/发酵何首乌化学成分、药理作用及肝毒性研究进展[J].中药新药与临床药理，2018，29（5）：661-672.
[4]李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2013，36（6）：1023-1028.
[5]魯亚奇，张晓，王金金，等.补骨脂化学成分及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（3）：180-189.
[6]张伟，陈素红，吕圭源.菟丝子功效性味归经与现代药理学的相关性研究[J].时珍国医国药，2010，21（4）：808-811.
[7]赵文静，菅原颖，王艳宏，等.仙鹿消癖胶囊中淫羊藿、浙贝母、当归的薄层鉴别研究[J].中医药信息，2011，28（4）：62-63.
[8]袁旭江，吴燕红.益肾养元合剂薄层色谱鉴别研究[J].中国实验方剂学杂志，2008（1）：10-11.
（收稿日期：2020-09-17）
关键词：养血生发合剂;质量标准;薄层鉴别;含量测定;大黄素
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）03-0072-04
养血生发合剂是昆明市中医医院的院内制剂，运用于临床长达30余年。该制剂由制何首乌、当归、补骨脂（盐）、菟丝子（盐）、牛膝、茯苓共6味药经提取后制备而成，具有养血生发、乌须发的功效，用于肾气不足、气血亏虚所致的须发脱落、早白。方中制何首乌为君药，具有补肝肾、强筋骨、益精血、乌须发的功效，所含蒽醌类成分大黄素具有抗衰老、保护肝肾、增强免疫力等作用[1-3]，其余当归、补骨脂（盐）、菟丝子（盐）等药材亦具有保肝强肾、抗衰老、抗氧化、增强免疫功能等效果[4-6]。
由于该合剂现行质量标准内容过于简单，检查项目专属性不强，且没有含量测定项，很难实现对该制剂的质量控制。因此，本研究采用TLC法对方中各药味进行定性鉴别研究，以建立快速、灵敏、专属性强的定性鉴别方法;同时，采用单因素试验法，对含量测定中供试品溶液的制备条件进行考察，以确定适宜的供试品溶液制备方法，并采用HPLC法建立养血生发合剂中主要有效成分大黄素的含量测定方法，为养血生发合剂的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 1100系列高效液相色谱仪（Agilent公司）;T-1000型电子天平（美国双杰兄弟有限公司）;Diamonsil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm，迪马科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）;硅胶G板（青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司）;点样毛细管（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2 试药 当归对照药材（批号：120927-201617），补骨脂对照药材（批号：121056-201605），大黄素对照品（批号：110756-201512，含量以98.7%计）均购自中国食品药品检定研究院。养血生发合剂（批号：180811、180812、180813，由昆明市中医医院提供）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别
2.1.1 当归的薄层鉴别 取本品20 mL，浓缩至约10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加無水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[7]。取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取不含当归的阴性样品溶液，按上述供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》（四部）通则0502进行试验，以硅胶G板为吸附剂，对照药材溶液、供试品溶液、阴性对照溶液点样量各5、10、10 μL，以正己烷-乙酸乙酯（7：1）为展开剂，展开，待晾干后于365 nm紫外光灯下检视。结果显示，供试品色谱与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。结果见图1。
2.1.2 补骨脂的鉴别 取本品20 mL，浓缩至约10 mL，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液[8]。取补骨脂对照药材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL超声提取10 min，滤过，料液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取不含补骨脂的阴性样品溶液，按上述供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》（四部）通则0502进行试验，以硅胶G板为吸附剂，各溶液点样量均为10 μl。以正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，待晾干后，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，于365 nm紫外光灯下检视。结果显示，供试品色谱与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。结果见图1。
2.2 大黄素含量测定
2.2.1 色谱条件及系统适应性 以Diamonsil C18为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（79：21）为流动相，254 nm为检测波长，在30℃柱温，10 μl进样量，1.0 mL/min流速条件下检测。理论板数按大黄素峰计算不低于5000，大黄素峰对称因子在0.95～1.05内，且该峰与附近峰分离度≥1.57，阴性对照无干扰。结果见图2。
2.2.2 对照品溶液的制备 取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密移取本品30 mL，水浴蒸干，取8%盐酸溶液20 mL分次加入蒸发皿中，溶解残渣并洗涤蒸发皿，溶解液合并洗涤液，移置圆底烧瓶中，加三氯甲烷20 mL，水浴加热回流3 h，取出，冷却。用分液漏斗分取三氯甲烷层（取10 mL三氯甲烷分次洗涤烧瓶，洗液并入分液漏斗中），剩余盐酸溶液再用三氯甲烷液萃取3次，每次15 mL，合并上述所有三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解定容至5 mL，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 取不含制何首乌的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 线性关系及范围考察 精密称取大黄素对照品（含量以98.7%计）0.01005 g，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取该溶液1mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，得浓度为79.35 μg/mL的溶液，取该溶液3mL，移至5mL量瓶中加甲醇定容，依次稀释，得浓度为28.56，17.14，10.28，6.17 μg/mL的对照品溶液。分别吸取上述各溶液，按照“2.2.1”项下的条件检测。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=34.43x+5.31（R2=0.999 8）。 2.2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下对照品溶液和“2.2.3”项下供试品溶液，按“2.2.1”项下条件，分别在0，4，8，12，16 h测定大黄素的峰面积，计算得对照品溶液峰面积的RSD=0.69%，供试品溶液峰面积得RSD=1.56%，表明二者的稳定性符合方法学要求。
2.2.7 重复性试验 取同一批次养血生发合剂6份，每份30mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下条件检测，计算得大黄素平均含量为6.34 μg/mL，RSD=1.87%（n=6），表明该方法重复性好。
2.2.8 准确度试验 取同一批次养血生发合剂（含量为6.34 μg/mL）6份，每份15 mL，分别加入浓度为44.29 μg/mL的大黄素对照品溶液各2 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按”2.2.1”项下方法进样测定，得平均加样回收率是103.42%，RSD=2.16%（n=6），表明所建方法符合含量测定要求。结果见表1。
2.2.9 含量测定 取3批次养血生发合剂（批号见表2），每批次取2份药液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下方法检测，计算大黄素含量。结果显示，3批次养血生发合剂中大黄素平均含量为6.33 μg/mL，RSD =1.32%。结果见表2。
3 讨论
本研究建立了养血生发合剂中当归、补骨脂的TLC鉴别方法。同时，由于薄层鉴别常受点样量、温度、湿度、薄层板厂家、样品批次等因素的影响，本研究依据《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则（试行）》对2药的鉴别进行了方法学考察。结果表明，在15℃～25℃，50%～90%湿度，两个不同厂家（青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司）薄层版条件下，3个批次养血生发合剂均可鉴别出当归和补骨脂。方中其余4药的TLC鉴别中，菟丝子、牛膝、茯苓均存在阴性干扰，何首乌中的大黄素已作为定量指标，故本研究并未建立何首乌及上述3味药的TLC鉴别方法。
本文对含量测定中供试品溶液的前处理方法进行了较系统的研究。结果表明，是否进行水解、水解所用酸的种类、所用酸的用量、水解时间、水解后酸液的萃取次数、水解所用酸的浓度对大黄素的检测均有影响，其中前4项影响较大，其余则影响较小。
本研究对当归中的阿魏酸进行了含量测定研究，发现其存在阴性干扰且含量偏低。在对菟丝子中的金丝桃苷进行测定时，未能检出金丝桃苷，推测可能与金丝桃苷在本合剂中的稳定性不佳有关。同时，补骨脂中的补骨脂素亦存在阴性干扰，而异补骨脂则未能检测到。牛膝中的β-蜕皮甾酮在原药材中的含量较低（2015年版中国药典规定应≥0.030%），考虑到处方药材制备为口服液后所含含量更低，故不宜作为定量指标。剩余的茯苓在药典中则无“含量测定”项，故本研究建立了何首乌中大黄素的含量测定方法。
参考文献：
[1]王亭，龚千锋.何首乌炮制后化学成分及药理作用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（2）：220-226.
[2]高任龙，王会肖，李晓娜，等.何首乌的药理毒理研究进展[J].河北医药，2015，37（2）：269-271.
[3]林艳，肖榕，李春，等.生/制/发酵何首乌化学成分、药理作用及肝毒性研究进展[J].中药新药与临床药理，2018，29（5）：661-672.
[4]李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2013，36（6）：1023-1028.
[5]魯亚奇，张晓，王金金，等.补骨脂化学成分及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（3）：180-189.
[6]张伟，陈素红，吕圭源.菟丝子功效性味归经与现代药理学的相关性研究[J].时珍国医国药，2010，21（4）：808-811.
[7]赵文静，菅原颖，王艳宏，等.仙鹿消癖胶囊中淫羊藿、浙贝母、当归的薄层鉴别研究[J].中医药信息，2011，28（4）：62-63.
[8]袁旭江，吴燕红.益肾养元合剂薄层色谱鉴别研究[J].中国实验方剂学杂志，2008（1）：10-11.
（收稿日期：2020-09-17）