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摘 要：采用组培培养技术探讨昌感秋海棠最佳培养条件。结果表明：选用叶片作为组培外植体更佳，初代、继代、生根培养的最佳培养基依次为MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA、MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA、1/2MS+0.2mg/L NAA，最佳炼苗基质为珍珠岩∶蛭石∶泥炭藓=1∶1∶2。
关键词：昌感秋海棠;组培;生根培养;炼苗
中图分类号 S661.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）15-0039-03
Study on Tissue Culture and Strong Seedling Stress of Begonia Cavaleriei
MA Jinghua et al.
（Guizhou Botanical Garden， Guiyang， Guiyang 550004， China）
Abstract： The study was focused on the best conditions of tissue culture of Begonia Cavaleriei. The results showed that the best explants for tissue culture came to be the leaves， and the best medium for primary culture， subculture and rooting culture were MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA， MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA， 1/2MS+0.2mg/L NAA， respectively. The best seedling substrate was perlite+vermiculite+sphagnum（1∶1∶2）.
Key words： Begonia cavaleriei; Tissue culture; Rooting; Seedling stress
昌感秋海棠（Begonia cavaleriei Levl）是秋海棠科秋海棠属的多年生草本植物，叶片翠绿，盾形，厚纸质;白色至粉红色花朵，聚伞状，娇小可爱，可作观赏。昌感秋海棠为中国特有种，分布在贵州、广西、云南等地[1]，野生昌感秋海棠生于山沟岩壁或石缝隙、山脚荫密林下等荫湿处，生境较脆弱。另外，昌感秋海棠也是传统的中药材，全草可入药，有抗炎止痛等功效，是我国少数民族常用中草药[2]。由此可见，昌感秋海棠是重要的野生花卉资源，且有药用功效，具有较好的开发利用价值，但其生境面临一定威胁。秋海棠常见的繁殖方式包括种子繁殖、珠芽繁殖、块茎繁殖、叶片扦插、组织培养等。种子繁殖的后代易产生變异;珠芽繁殖受到叶片和珠芽数量的限制;扦插需要较多叶片且受季节影响，无法实现快速高效繁殖;组培可以在短时间内获得大量后代，且很好地保持品种的优良性能，已有多种秋海棠属植物组培成功[3-6]。为此，笔者开展昌感秋海棠的组培再生体系研究，为保护秋海棠种质资源提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料 昌感秋海棠于2017年采自贵州施秉，带土移栽于贵州省植物园。引种栽培1年后，昌感秋海棠已完全适应本地环境，在植物园内生长良好[7]，已经进行大量繁殖。于天气晴朗时选取生长健壮的植株，取其叶片和叶柄作为外植体。
1.2 外植体处理 将昌感秋海棠连同叶柄剪下，带回实验室用自来水冲洗10min后转移至超净工作台，将叶片和叶柄分离，叶柄剪成5cm左右小段，叶片剪5cm×5cm的小片，然后用75%酒精浸泡10s，无菌水冲洗4次，10%NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，然后将外植体置于无菌滤纸片上吸干水分，叶片剪成1cm2左右的小块，叶柄剪成1cm左右的小段，接种于事先准备好的灭菌培养基中。
1.3 愈伤组织诱导 将消毒好的外植体接种到初代培养基中，以MS为基本培养基，设计细胞分裂素6-BA和生长素NAA不同浓度组合：6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，6-BA 3mg/L+NAA 0.4mg/L，6-BA 4mg/L+NAA 0.5mg/L。每处理接种6瓶，每瓶5个外植体，一定时间后统计愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率（%）=形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体数
1.4 丛生芽诱导分化 以MS为基本培养基，设计6-BA、NAA和赤霉素GA不同浓度组合：6-BA（1mg/L，2mg/L）+NAA（0.2mg/L，0.3mg/L）+GA（0.4mg/L，0.5mg/L），接种愈伤组织，设8个处理，每处理接种5瓶，每瓶4个外植体，每隔7d观察愈伤组织分化为丛生芽的数量，一定时间后统计丛生芽分化率。
芽分化率（%）=愈伤组织再分化成芽的外植体数/接种的外植体数
1.5 壮苗与生根诱导 以1/2或1/3MS为基本培养基，添加IAA或NAA，共6个处理，将较大的丛生芽剪切为数个大小合适的芽接种到培养基中。每处理接种4瓶，每瓶2～3个丛生芽，一定时间后统计生根数和生根率，对比各处理苗的生长状况。生根率为长根丛生芽占总接种丛生芽的数量比率;平均根数以丛生苗为基数，统计每株丛生苗生发的根数，计算平均值。
1.6 无菌组培苗炼苗 将生根的无菌组培苗取出，清洗根部培养基，适当修剪根长，在50%多菌灵溶液中蘸取2次以对根部进行杀菌，将组培苗接种于4种不同组合的基质中。基质组合为：珍珠岩+蛭石（1∶1）、珍珠岩+蛭石+泥炭藓（1∶1∶2）、珍珠岩+蛭石+水苔+树皮（1∶1∶1∶1）、水苔+泥炭藓（1∶2）。移栽初期每3d适量浇水，植株适应基质后进行4周的湿润训练，每2d充足浇水1次，之后进行4周的干旱训练，每周1次充足浇水，其余时间不补水。每处理16株组培苗，观察并统计移栽苗的生长情况。 1.7 培养条件 愈伤组织诱导至不定芽生根，所有培养过程在光照培养箱中进行，培养条件为日间模式14h（光照强度1200lx、25℃），夜间模式10h、20℃。炼苗在温室中进行，自然光照及温度。
2 结果与分析
2.1 不同外植体和激素组合对愈伤组织诱导的影响 外植体接种到初代培养基15d后，各处理外植体边缘开始膨大形成愈伤组织。接种30d后统计愈伤组织分化率。由表1可知，各组合下外植体开始分化的时间不同，且以叶片较早。较低激素浓度组合下，外植体几乎没有玻璃化现象发生，当浓度达到3mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA时，叶柄出现一定玻璃化，浓度再增加时叶片也开始玻璃化，但总体玻璃化程度较轻，在10%以内。褐化现象与玻璃化趋势相反，在较低激素浓度组合时褐化较严重，达到20%，随着浓度升高，褐化减轻，低至3.3%。外植体的分化率总体较高，MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 组合下叶柄分化率大于叶片，为86.7%，其他激素组合分化率均在90%以上，且叶片分化率更高，在MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的组合下达到100%。由此可见，叶片和叶柄均可诱导形成愈伤组织，但综合考虑试验时间和愈伤组织诱导率，选用叶片作为组培外植体更佳，且以2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的激素组合最适于外植体分化。
2.2 不同激素组合对丛生芽诱导分化的影响 愈伤组织转接到继代培养基后继续培养，诱导丛生芽的分化，约2周后开始分化形成丛生芽，30d后统计结果，形成丛生芽的外植体数占总接种外植体的比例为增殖率，丛生芽高度大于0.5cm的外植体占形成丛生芽的外植体的比例为大芽比率。由表2可知，所有激素组合中，昌感秋海棠愈伤组织在继代培养中没有玻璃化，但有不同程度的褐化现象发生;总体增殖率在60%以上，受6-BA含量影响较大，6-BA含量较高时增殖率较高;丛生芽高度多数在0.5cm以下，仅2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA组合有50%以上丛生芽高度超过0.5cm，因此继代培养以该激素组合为最佳组合，能在较短时间内得到较多、较为理想的丛生芽。
2.3 不同培养基和激素组合对生根壮苗诱导的影响 36d后，各处理组培苗叶片明显长大，且均明显生根，已长成为正常形态的植株。由表3可知，各组合对昌感秋海棠无菌苗诱导生根的能力均较强，生根率在90%以上，但生根数量有所不同，且根与植株长势因培养基有所差异。总体而言，1/2MS作为基础培养基优于1/3MS。组培苗平均根数量方面，以1/2MS为基础培养基时植株生根数量在5.3以上，1/3MS时在5.8以下，前者更有利于生发更多新根;根形态方面，以1/2MS为基础培养基时植株根系较粗，健康茁壮，而1/3MS时根系细弱，不利于根系吸收养分为地上部供给养分;植株长势与根系形态关系密切，以1/2MS为基础培养基时植株总体长势较好，而1/3MS时植株矮小。其中，1/2MS+0.2mg/L NAA的组合生根壮苗效果最好，生根率达到100%，且生根数量适中，根系发达，植株健壮，叶片翠绿茂密，总体更加有生机。
2.4 不同基质对组培苗生长的影响 各炼苗基质对无菌组培苗的影响不同。由表4可知，适应2周后，绝大多数组培苗生长良好，尤以珍珠岩+蛭石+泥炭藓（1∶1∶2）和水苔+泥炭藓（1∶2）的基质配比为佳，成苗率达100%;植株适应基质后进行为期30d的湿润训练，每2d充足浇水1次，此时珍珠岩+蛭石+水苔+树皮（1∶1∶1∶1）的基质因为疏水透气较好而保持较高的成苗率;之后进行为期30d的干旱训练，每周仅充足浇水1次，此时珍珠岩+蛭石（1∶1）和珍珠岩+蛭石+水苔+树皮（1∶1∶1∶1）的基质因保水能力差而死苗严重，达100%，而珍珠岩+蛭石+泥炭土（1∶1∶2）和水苔+泥炭藓（1∶2）因其持水保水能力强而维持较好的成苗率，前者成苗率达70%。由此可见，珍珠岩+蛭石+泥炭土的基质组合能同时达到理想的疏水和保水能力，有利于昌感秋海棠的生长。
3 结论与讨论
试验结果表明：昌感秋海棠组培繁育时，选用叶片作为组培外植体，培养基中添加2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，初代培养效果最佳;培养基中添加2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA有助于丛生芽的形成与生长，继代培养效果最理想;以1/2MS为基础培养基，添加0.2mg/L NAA，生根壮苗效果最好，生根率100%，且植株长势旺盛，根叶繁茂;选用珍珠岩∶蛭石∶泥炭藓=1∶1∶2的基质进行炼苗可以达到最佳效果，此时组培苗既能适应湿润的多水环境，又能承受较为长期的干旱环境。试验过程中应注意控制培养基的湿度和培养条件，降低玻璃化与褐化现象的发生几率。本研究成果可在短时间内繁殖大量秋海棠无菌组培苗，为昌感秋海棠物种保护和繁育提供技术交换。
参考文献
[1]中国植物志编纂委员会.中国植物志第52卷第1分册[M].北京：科学出版社，2001：1.
[2]杨亮，何顺志.中国秋海棠属的研究进展[J].时珍国医国药，2008，19（12）：2979-2981.
[3]颜宁，杨小凤.四季秋海棠的离体培养及植株再生[J].邵阳学院学报（自然科学版），2004（01）：107-109.
[4]司徒琳莉，张小军，宗宪春，等.帝王秋海棠愈伤组织的诱导和植株再生[J].植物生理学通讯，2007（01）：117.
[5]唐凤鸾，黄宁珍，蒋能，等.突脉秋海棠组织培养及快速繁殖研究[J].西南农业学报，2013，26（02）：762-765.
[6]李丹，吴海红，岳玲，等.蟆叶秋海棠组培快繁技术研究[J].辽宁农业科学，2020（04）：79-80.
[7]欧明烛，任启飞，马菁华，等.昌感秋海棠引种扦插繁殖技术研究[J].耕作与栽培，2020，40（05）：5-8.
（责编：徐世红）
基金项目：贵州科学院省级科研专项资金项目“贵州喀斯特植物资源保育平台建设”黔科院科专合字[2019]07号;贵州科学院基金“秋海棠属植物种质资源收集及利用评价”黔科院字[2017]02号。
作者简介：马菁华（1991—），女，河南焦作人，硕士，研究实习员，从事植物資源收集与保护工作。
通讯作者 收稿日期：2021-06-03
关键词：昌感秋海棠;组培;生根培养;炼苗
中图分类号 S661.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）15-0039-03
Study on Tissue Culture and Strong Seedling Stress of Begonia Cavaleriei
MA Jinghua et al.
（Guizhou Botanical Garden， Guiyang， Guiyang 550004， China）
Abstract： The study was focused on the best conditions of tissue culture of Begonia Cavaleriei. The results showed that the best explants for tissue culture came to be the leaves， and the best medium for primary culture， subculture and rooting culture were MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA， MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA， 1/2MS+0.2mg/L NAA， respectively. The best seedling substrate was perlite+vermiculite+sphagnum（1∶1∶2）.
Key words： Begonia cavaleriei; Tissue culture; Rooting; Seedling stress
昌感秋海棠（Begonia cavaleriei Levl）是秋海棠科秋海棠属的多年生草本植物，叶片翠绿，盾形，厚纸质;白色至粉红色花朵，聚伞状，娇小可爱，可作观赏。昌感秋海棠为中国特有种，分布在贵州、广西、云南等地[1]，野生昌感秋海棠生于山沟岩壁或石缝隙、山脚荫密林下等荫湿处，生境较脆弱。另外，昌感秋海棠也是传统的中药材，全草可入药，有抗炎止痛等功效，是我国少数民族常用中草药[2]。由此可见，昌感秋海棠是重要的野生花卉资源，且有药用功效，具有较好的开发利用价值，但其生境面临一定威胁。秋海棠常见的繁殖方式包括种子繁殖、珠芽繁殖、块茎繁殖、叶片扦插、组织培养等。种子繁殖的后代易产生變异;珠芽繁殖受到叶片和珠芽数量的限制;扦插需要较多叶片且受季节影响，无法实现快速高效繁殖;组培可以在短时间内获得大量后代，且很好地保持品种的优良性能，已有多种秋海棠属植物组培成功[3-6]。为此，笔者开展昌感秋海棠的组培再生体系研究，为保护秋海棠种质资源提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料 昌感秋海棠于2017年采自贵州施秉，带土移栽于贵州省植物园。引种栽培1年后，昌感秋海棠已完全适应本地环境，在植物园内生长良好[7]，已经进行大量繁殖。于天气晴朗时选取生长健壮的植株，取其叶片和叶柄作为外植体。
1.2 外植体处理 将昌感秋海棠连同叶柄剪下，带回实验室用自来水冲洗10min后转移至超净工作台，将叶片和叶柄分离，叶柄剪成5cm左右小段，叶片剪5cm×5cm的小片，然后用75%酒精浸泡10s，无菌水冲洗4次，10%NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，然后将外植体置于无菌滤纸片上吸干水分，叶片剪成1cm2左右的小块，叶柄剪成1cm左右的小段，接种于事先准备好的灭菌培养基中。
1.3 愈伤组织诱导 将消毒好的外植体接种到初代培养基中，以MS为基本培养基，设计细胞分裂素6-BA和生长素NAA不同浓度组合：6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，6-BA 3mg/L+NAA 0.4mg/L，6-BA 4mg/L+NAA 0.5mg/L。每处理接种6瓶，每瓶5个外植体，一定时间后统计愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率（%）=形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体数
1.4 丛生芽诱导分化 以MS为基本培养基，设计6-BA、NAA和赤霉素GA不同浓度组合：6-BA（1mg/L，2mg/L）+NAA（0.2mg/L，0.3mg/L）+GA（0.4mg/L，0.5mg/L），接种愈伤组织，设8个处理，每处理接种5瓶，每瓶4个外植体，每隔7d观察愈伤组织分化为丛生芽的数量，一定时间后统计丛生芽分化率。
芽分化率（%）=愈伤组织再分化成芽的外植体数/接种的外植体数
1.5 壮苗与生根诱导 以1/2或1/3MS为基本培养基，添加IAA或NAA，共6个处理，将较大的丛生芽剪切为数个大小合适的芽接种到培养基中。每处理接种4瓶，每瓶2～3个丛生芽，一定时间后统计生根数和生根率，对比各处理苗的生长状况。生根率为长根丛生芽占总接种丛生芽的数量比率;平均根数以丛生苗为基数，统计每株丛生苗生发的根数，计算平均值。
1.6 无菌组培苗炼苗 将生根的无菌组培苗取出，清洗根部培养基，适当修剪根长，在50%多菌灵溶液中蘸取2次以对根部进行杀菌，将组培苗接种于4种不同组合的基质中。基质组合为：珍珠岩+蛭石（1∶1）、珍珠岩+蛭石+泥炭藓（1∶1∶2）、珍珠岩+蛭石+水苔+树皮（1∶1∶1∶1）、水苔+泥炭藓（1∶2）。移栽初期每3d适量浇水，植株适应基质后进行4周的湿润训练，每2d充足浇水1次，之后进行4周的干旱训练，每周1次充足浇水，其余时间不补水。每处理16株组培苗，观察并统计移栽苗的生长情况。 1.7 培养条件 愈伤组织诱导至不定芽生根，所有培养过程在光照培养箱中进行，培养条件为日间模式14h（光照强度1200lx、25℃），夜间模式10h、20℃。炼苗在温室中进行，自然光照及温度。
2 结果与分析
2.1 不同外植体和激素组合对愈伤组织诱导的影响 外植体接种到初代培养基15d后，各处理外植体边缘开始膨大形成愈伤组织。接种30d后统计愈伤组织分化率。由表1可知，各组合下外植体开始分化的时间不同，且以叶片较早。较低激素浓度组合下，外植体几乎没有玻璃化现象发生，当浓度达到3mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA时，叶柄出现一定玻璃化，浓度再增加时叶片也开始玻璃化，但总体玻璃化程度较轻，在10%以内。褐化现象与玻璃化趋势相反，在较低激素浓度组合时褐化较严重，达到20%，随着浓度升高，褐化减轻，低至3.3%。外植体的分化率总体较高，MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 组合下叶柄分化率大于叶片，为86.7%，其他激素组合分化率均在90%以上，且叶片分化率更高，在MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的组合下达到100%。由此可见，叶片和叶柄均可诱导形成愈伤组织，但综合考虑试验时间和愈伤组织诱导率，选用叶片作为组培外植体更佳，且以2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的激素组合最适于外植体分化。
2.2 不同激素组合对丛生芽诱导分化的影响 愈伤组织转接到继代培养基后继续培养，诱导丛生芽的分化，约2周后开始分化形成丛生芽，30d后统计结果，形成丛生芽的外植体数占总接种外植体的比例为增殖率，丛生芽高度大于0.5cm的外植体占形成丛生芽的外植体的比例为大芽比率。由表2可知，所有激素组合中，昌感秋海棠愈伤组织在继代培养中没有玻璃化，但有不同程度的褐化现象发生;总体增殖率在60%以上，受6-BA含量影响较大，6-BA含量较高时增殖率较高;丛生芽高度多数在0.5cm以下，仅2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA组合有50%以上丛生芽高度超过0.5cm，因此继代培养以该激素组合为最佳组合，能在较短时间内得到较多、较为理想的丛生芽。
2.3 不同培养基和激素组合对生根壮苗诱导的影响 36d后，各处理组培苗叶片明显长大，且均明显生根，已长成为正常形态的植株。由表3可知，各组合对昌感秋海棠无菌苗诱导生根的能力均较强，生根率在90%以上，但生根数量有所不同，且根与植株长势因培养基有所差异。总体而言，1/2MS作为基础培养基优于1/3MS。组培苗平均根数量方面，以1/2MS为基础培养基时植株生根数量在5.3以上，1/3MS时在5.8以下，前者更有利于生发更多新根;根形态方面，以1/2MS为基础培养基时植株根系较粗，健康茁壮，而1/3MS时根系细弱，不利于根系吸收养分为地上部供给养分;植株长势与根系形态关系密切，以1/2MS为基础培养基时植株总体长势较好，而1/3MS时植株矮小。其中，1/2MS+0.2mg/L NAA的组合生根壮苗效果最好，生根率达到100%，且生根数量适中，根系发达，植株健壮，叶片翠绿茂密，总体更加有生机。
2.4 不同基质对组培苗生长的影响 各炼苗基质对无菌组培苗的影响不同。由表4可知，适应2周后，绝大多数组培苗生长良好，尤以珍珠岩+蛭石+泥炭藓（1∶1∶2）和水苔+泥炭藓（1∶2）的基质配比为佳，成苗率达100%;植株适应基质后进行为期30d的湿润训练，每2d充足浇水1次，此时珍珠岩+蛭石+水苔+树皮（1∶1∶1∶1）的基质因为疏水透气较好而保持较高的成苗率;之后进行为期30d的干旱训练，每周仅充足浇水1次，此时珍珠岩+蛭石（1∶1）和珍珠岩+蛭石+水苔+树皮（1∶1∶1∶1）的基质因保水能力差而死苗严重，达100%，而珍珠岩+蛭石+泥炭土（1∶1∶2）和水苔+泥炭藓（1∶2）因其持水保水能力强而维持较好的成苗率，前者成苗率达70%。由此可见，珍珠岩+蛭石+泥炭土的基质组合能同时达到理想的疏水和保水能力，有利于昌感秋海棠的生长。
3 结论与讨论
试验结果表明：昌感秋海棠组培繁育时，选用叶片作为组培外植体，培养基中添加2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，初代培养效果最佳;培养基中添加2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA有助于丛生芽的形成与生长，继代培养效果最理想;以1/2MS为基础培养基，添加0.2mg/L NAA，生根壮苗效果最好，生根率100%，且植株长势旺盛，根叶繁茂;选用珍珠岩∶蛭石∶泥炭藓=1∶1∶2的基质进行炼苗可以达到最佳效果，此时组培苗既能适应湿润的多水环境，又能承受较为长期的干旱环境。试验过程中应注意控制培养基的湿度和培养条件，降低玻璃化与褐化现象的发生几率。本研究成果可在短时间内繁殖大量秋海棠无菌组培苗，为昌感秋海棠物种保护和繁育提供技术交换。
参考文献
[1]中国植物志编纂委员会.中国植物志第52卷第1分册[M].北京：科学出版社，2001：1.
[2]杨亮，何顺志.中国秋海棠属的研究进展[J].时珍国医国药，2008，19（12）：2979-2981.
[3]颜宁，杨小凤.四季秋海棠的离体培养及植株再生[J].邵阳学院学报（自然科学版），2004（01）：107-109.
[4]司徒琳莉，张小军，宗宪春，等.帝王秋海棠愈伤组织的诱导和植株再生[J].植物生理学通讯，2007（01）：117.
[5]唐凤鸾，黄宁珍，蒋能，等.突脉秋海棠组织培养及快速繁殖研究[J].西南农业学报，2013，26（02）：762-765.
[6]李丹，吴海红，岳玲，等.蟆叶秋海棠组培快繁技术研究[J].辽宁农业科学，2020（04）：79-80.
[7]欧明烛，任启飞，马菁华，等.昌感秋海棠引种扦插繁殖技术研究[J].耕作与栽培，2020，40（05）：5-8.
（责编：徐世红）
基金项目：贵州科学院省级科研专项资金项目“贵州喀斯特植物资源保育平台建设”黔科院科专合字[2019]07号;贵州科学院基金“秋海棠属植物种质资源收集及利用评价”黔科院字[2017]02号。
作者简介：马菁华（1991—），女，河南焦作人，硕士，研究实习员，从事植物資源收集与保护工作。
通讯作者 收稿日期：2021-06-03