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摘要：茉莉酸（Jasmonate， JA）为植物病虫害抗性反应中重要的信号分子，茉莉酸类物质生物合成途径中的关键酶为丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase， AOS）。已知水稻AOS基因家族包括4个成员，OsAOS1～OsAOS4。已有研究表明，水稻OsAOS2基因的过量表达提高了内源PR1基因的表达、增强了水稻对稻瘟病的抗性。本研究分析了OsAOS1基因表达的组织和器官特异性以及外源JA处理对OsAOS1基因表达的影响，同时利用转基因技术研究了OsAOS1基因在调控内源PR1基因表达中的作用。研究结果表明：OsAOS1基因表达的组织和器官特异性不同于OsAOS2基因；外源JA处理诱导OsAOS1基因的瞬时表达，然而OsAOS2基因的诱导表达延迟； OsAOS1过量表达抑制烟草中内源PR1基因的表达。据此推测OsAOS1基因可能不参与依赖于PR1的抗病反应。
关键词：水稻； 茉莉酸； 丙二烯氧化物合成酶； 转基因； PR1基因
中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0001-05
最早从真菌Lasiodiplodia theobromae培养液中分离得到茉莉酸（Jasmonate， JA）[1]，后来的研究表明JA在植物的生长发育以及抗性方面均具有重要作用，例如JA在种子的萌发、根的生长、植物的育性和衰老等重要的生理过程中起作用[2～7]。近几年来，越来越多的研究表明JA作为一种防卫信号分子起作用，参与双子叶植物病虫害抗性反应[8～11]。
虽然JA在单子叶植物抗性反应中的功能远不如双子叶植物中了解的清楚，但是仍有一些证据间接表明了JA在水稻抗病反应中具有重要作用。外源JA处理能够诱导水稻PR1基因（PR1a和PR1b）的表达[12～14]。JA生物合成抑制剂处理水稻能够降低内源JA的含量，同时也降低了病原菌诱导的PR1蛋白的积累水平[15]。
JA的生物合成途径也称类十八烷生物合成途径：亚麻酸经脂氧合酶（Lipoxygenase， LOX）催化合成13（S）-氢过氧化亚麻酸（13-hydroperoxylinolenic， 13-HPOT），13-HPOT在丙二烯氧化物合成酶（Allene Oxide Synthase， AOS）、丙二烯氧化物环化酶（Allene Oxide Cyclase， AOC）等酶类的催化下生成10，11-二氢-12-氧植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid， OPDA）[16]。OPDA再经过三次β氧化后生成JA[17]，另外，JA还可以被广泛地修饰。
可见，AOS是JA生物合成途径中的一个关键酶。亚麻（Linum usitatissimum）AOS基因在马铃薯中过量表达可提高转基因植株中JA含量[18]；而拟南芥AOS基因的过量表达却不能提高转基因拟南芥和烟草中JA水平，除非受到机械损伤诱导[19]。水稻基因组中含有4个AOS基因[20，21]。其中，OsAOS1基因编码的产物具有叶绿体转运肽，其表达受伤处理快速瞬时诱导，这种结构特征以及表达特征都与双子叶植物AOS基因相似，而不同于单子叶植物中AOS基因。Mei等（2006）[24]的报道表明，水稻OsAOS2基因过量表达能够提高水稻内源JA含量、诱导PR基因表达以及增强对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抗性[22]。为了研究OsAOS1在水稻生长发育中的作用，我们分析了OsAOS1基因表达的器官特异性、对外源JA处理应答反应。此外，我们还构建了OsAOS1基因的过量表达载体并转化烟草，为进一步研究OsAOS1基因的功能奠定基础。
1材料与方法
11植物材料
试验中所用的水稻材料为日本晴品种（Oryza sativa L cv Nipponbare），所用烟草材料为SR品种（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR）。
12植物材料的培育
日本晴水稻种子表面消毒后，播种于04%（W/V）的琼脂培养基中，在光照培养箱（宁波江南）中培养7天，然后移栽至温室土壤中（白天，28℃/夜晚，23℃）继续培养至六叶一心期。
13OsAOS基因表达的器官特异性分析
日本晴水稻在温室中长至六叶一心期时，从土壤中拔出，把根部清洗干净。分别取根部（10个植株）、茎部（20个植株）、叶片（3个植株），液氮中速冻，然后置于-70℃低温冰箱中保存，用于2个AOS基因的表达分析。茎部取材时尽量去除叶子；叶片为第六叶。
14外源JA处理
茉莉酸（购于Sigma公司）溶于甲醇，配成100 mmol/L的储存液，使用时用灭菌蒸馏水稀释为100 μmol/L的工作液。Mock处理使用1‰的甲醇水溶液。分别利用上述溶液喷洒六叶一心期野生型水稻，直至叶片有水珠滴落为止，分别在0、2、6、24和48 h时取第六片叶，在液氮中速冻，然后置于-70℃低温冰箱中保存，用于AOS基因表达水平分析。每个时间点取3个植株叶片混合物作为样品。
15OsAOS1基因表达载体的构建
根据OsAOS1（AK068620）基因的核苷酸序列设计PCR引物对：fFw：5′TAGGTCTAGATCATCGGATCAAGGG3′/fRv：5′GACTCGAGGGCGCCGGAGACTTTG3′（其中下划线序列分别是Xba Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶的识别序列），利用TaKaRa高保真酶（PrimerSTAT HS DNA Polymerase）从水稻基因组中扩增OsAOS1基因，克隆到pMD18-T载体（TaKaRa），筛选阳性克隆，并通过测序确认核苷酸序列的正确性。通过Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将OsAOS1基因克隆到双元表达载体pPZP2Ha3 （+）的35S启动子（P35S）和Tnos之间，构建35S∶OsAOS1表达载体。 16烟草转化
将上述OsAOS1基因表达载体通过热激法转化农杆菌EHA105[22]。采用叶盘法[23]转化烟草。
17OsAOS1基因和PR1基因在转基因植株中的表达情况
在转基因烟草种子成熟阶段取上部幼嫩叶片，液氮冻存。用于分析OsAOS1、NtPR1a和NtPRB1b的表达情况。
18RNA分析
RNA的提取按照TaKaRa RNAisoTM plus（TaKaRa）说明书进行操作，利用RNase-free DNase Ⅰ（TaKaRa）除去RNA中的DNA，按EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书（全式金）进行逆转录反应。本研究中所用引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，所扩增基因在GenBank/EMBL 数据库中的序列号和PCR扩增条件如表1所示。利用20%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用Gel-Pro Analyzer 40 software （Media Cybernetics， USA）分析PCR条带的信号强度，并计算目的基因与内标基因（OsActin、OsUBQ和NtActin基因）的相对值。
2结果与分析
21OsAOS1和OsAOS2基因在水稻不同器官中的表达
通过比较2个水稻AOS基因在根、茎和叶片中的表达水平，可以看出OsAOS1和OsAOS2基因表达的器官特异性相似，但这两个基因相对表达量差距较大。OsAOS1和OsAOS2基因在根、茎和叶片中的表达都依次降低，OsAOS1基因在这些器官中的相对表达量差异比较小，而OsAOS2基因在这些器官中的相对表达量差异较大（图1）。据此推测，OsAOS1基因在水稻生长发育中的作用可能不同于OsAOS2基因。
A：利用RT-PCR分析OsAOS1和OsAOS2基因在水稻根、茎和叶子中的转录本水平；B：OsAOS1和OsAOS2基因相对OsActin的表达分析
图1OsAOS基因在六叶期水稻植株不同器官中的表达
22外源JA对OsAOS1基因和OsAOS2基因表达的影响
外源JA处理2 h，叶片中OsAOS1基因的表达被明显诱导，随后OsAOS1基因的表达逐渐降低。而OsAOS2基因的诱导表达出现在JA处理后24 h，然后持续表达（图2）。这个结果表明，OsAOS1和OsAOS2基因都参与了JA依赖的反应，但是反应机制不同。值得注意的是Mock处理对OsAOS2的表达有一定的影响，这可能是由于喷洒甲醇溶液时，气流对叶子产生一种机械作用所导致，而OsAOS1基因可能不参与该途径。
A：利用RT-PCR分析外源JA处理后不同时间点OsAOS1和OsAOS2基因的表达水平；B：OsAOS1基因和OsAOS2基因相对OsUBQ的表达分析
图2外源JA处理对水稻叶片OsAOS1基因和
OsAOS2基因表达水平的影响
23OsAOS1转基因烟草抑制NtPR1基因的基础表达
已有研究表明，烟草的NtPR1a和NtPRB1b与烟草的抗病性直接相关[25，26]。因此，我们构建了OsAOS1基因的过量表达载体（图3A），转化至烟草中，分析了T2代转基因烟草中OsAOS1基因的表达水平与NtPR1a基因和NtPRB1b基因的表达水平之间的关系。如图3B和3C所示，转基因烟草不同株系中OsAOS1基因的表达水平均高于非转基因烟草。与此相反，NtPR1a和NtPRB1b的表达水平明显低于非转基因烟草植株。这些结果表明OsAOS1基因在烟草中的过量表达抑制了烟草PR1基因的表达。
注：15-2、19-2、20-3和22-1是4个不同的转基因烟草株系， SR是野生型烟草。
A：转OsAOS1基因表达载体示意图；B：利用RT-PCR分析OsAOS1转基因烟草中OsAOS1和NtPR1基因的表达情况；C：OsAOS1和NtPR1基因相对于NtActin的表达分析
图3转基因烟草中OsAOS1的过量表达抑制NtPR1基因的表达水平
3讨论
本研究发现，OsAOS1和OsAOS2基因表达的器官特异性和对外源JA处理的应答反应均不同。此外，有报道表明伤处理诱导OsAOS1基因快速瞬时表达[21]，而OsAOS2基因不受伤处理的诱导[24]。Haga和Iino（2004）构建的AOS蛋白系统进化树显示OsAOS1在进化树上的位置相对其他单子叶AOS蛋白更接近于双子叶植物AOS[21]。这些表达和结构上的不同可能决定了OsAOS1和OsAOS2功能上的差异。
OsAOS2基因过量表达激活了JA应答的OsPR1a和OsPR1b的表达[22]。然而在OsAOS1基因过量表达的转基因烟草，内源PR1基因的表达均被抑制。通过对转基因烟草中PR1基因的表达情况分析，我们推断OsAOS1基因可能是负调控JA应答反应中PR1基因的表达。我们做了如下假设：在转基因烟草中，外源AOS基因和内源AOS基因的底物相同，当OsAOS1基因过表达后，通过该条途径的JA反应会明显增强，OsAOS1调控的JA反应可能不直接影响PR1基因的表达。但是如此一来，因为底物的限制，通过烟草内源的、与PR1基因表达相关的AOS基因所调控的JA反应就会减弱，导致烟草内源PR1基因的表达降低。我们需要更多直接证据来验证这个假设。
此外，外源JA、SA和稻瘟病能够诱导水稻PR1a和PR1b基因的表达，所以 PR1a和PR1b基因被认为与水稻抗病反应相关[27，28]。OsAOS1基因的过量表达抑制了NtPR1a和NtPRB1b基因的表达，因此OsAOS1基因可能不参与水稻抗病反应。Haga 和 Iino （2004）的研究表明，OsAOS1基因参与调控光敏色素介导的水稻胚芽鞘延伸，因为在OsAOS1基因缺失的突变体cpm1中，光敏色素介导的胚芽鞘生长抑制现象明显小于野生型[21]。OsAOS1基因在水稻生长发育中的其它作用，还需要我们进一步分析AOS1转基因水稻和烟草植株的生理、生化特征及对各种生物胁迫和非生物胁迫的反应。 参考文献：
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关键词：水稻； 茉莉酸； 丙二烯氧化物合成酶； 转基因； PR1基因
中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0001-05
最早从真菌Lasiodiplodia theobromae培养液中分离得到茉莉酸（Jasmonate， JA）[1]，后来的研究表明JA在植物的生长发育以及抗性方面均具有重要作用，例如JA在种子的萌发、根的生长、植物的育性和衰老等重要的生理过程中起作用[2～7]。近几年来，越来越多的研究表明JA作为一种防卫信号分子起作用，参与双子叶植物病虫害抗性反应[8～11]。
虽然JA在单子叶植物抗性反应中的功能远不如双子叶植物中了解的清楚，但是仍有一些证据间接表明了JA在水稻抗病反应中具有重要作用。外源JA处理能够诱导水稻PR1基因（PR1a和PR1b）的表达[12～14]。JA生物合成抑制剂处理水稻能够降低内源JA的含量，同时也降低了病原菌诱导的PR1蛋白的积累水平[15]。
JA的生物合成途径也称类十八烷生物合成途径：亚麻酸经脂氧合酶（Lipoxygenase， LOX）催化合成13（S）-氢过氧化亚麻酸（13-hydroperoxylinolenic， 13-HPOT），13-HPOT在丙二烯氧化物合成酶（Allene Oxide Synthase， AOS）、丙二烯氧化物环化酶（Allene Oxide Cyclase， AOC）等酶类的催化下生成10，11-二氢-12-氧植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid， OPDA）[16]。OPDA再经过三次β氧化后生成JA[17]，另外，JA还可以被广泛地修饰。
可见，AOS是JA生物合成途径中的一个关键酶。亚麻（Linum usitatissimum）AOS基因在马铃薯中过量表达可提高转基因植株中JA含量[18]；而拟南芥AOS基因的过量表达却不能提高转基因拟南芥和烟草中JA水平，除非受到机械损伤诱导[19]。水稻基因组中含有4个AOS基因[20，21]。其中，OsAOS1基因编码的产物具有叶绿体转运肽，其表达受伤处理快速瞬时诱导，这种结构特征以及表达特征都与双子叶植物AOS基因相似，而不同于单子叶植物中AOS基因。Mei等（2006）[24]的报道表明，水稻OsAOS2基因过量表达能够提高水稻内源JA含量、诱导PR基因表达以及增强对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抗性[22]。为了研究OsAOS1在水稻生长发育中的作用，我们分析了OsAOS1基因表达的器官特异性、对外源JA处理应答反应。此外，我们还构建了OsAOS1基因的过量表达载体并转化烟草，为进一步研究OsAOS1基因的功能奠定基础。
1材料与方法
11植物材料
试验中所用的水稻材料为日本晴品种（Oryza sativa L cv Nipponbare），所用烟草材料为SR品种（Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR）。
12植物材料的培育
日本晴水稻种子表面消毒后，播种于04%（W/V）的琼脂培养基中，在光照培养箱（宁波江南）中培养7天，然后移栽至温室土壤中（白天，28℃/夜晚，23℃）继续培养至六叶一心期。
13OsAOS基因表达的器官特异性分析
日本晴水稻在温室中长至六叶一心期时，从土壤中拔出，把根部清洗干净。分别取根部（10个植株）、茎部（20个植株）、叶片（3个植株），液氮中速冻，然后置于-70℃低温冰箱中保存，用于2个AOS基因的表达分析。茎部取材时尽量去除叶子；叶片为第六叶。
14外源JA处理
茉莉酸（购于Sigma公司）溶于甲醇，配成100 mmol/L的储存液，使用时用灭菌蒸馏水稀释为100 μmol/L的工作液。Mock处理使用1‰的甲醇水溶液。分别利用上述溶液喷洒六叶一心期野生型水稻，直至叶片有水珠滴落为止，分别在0、2、6、24和48 h时取第六片叶，在液氮中速冻，然后置于-70℃低温冰箱中保存，用于AOS基因表达水平分析。每个时间点取3个植株叶片混合物作为样品。
15OsAOS1基因表达载体的构建
根据OsAOS1（AK068620）基因的核苷酸序列设计PCR引物对：fFw：5′TAGGTCTAGATCATCGGATCAAGGG3′/fRv：5′GACTCGAGGGCGCCGGAGACTTTG3′（其中下划线序列分别是Xba Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶的识别序列），利用TaKaRa高保真酶（PrimerSTAT HS DNA Polymerase）从水稻基因组中扩增OsAOS1基因，克隆到pMD18-T载体（TaKaRa），筛选阳性克隆，并通过测序确认核苷酸序列的正确性。通过Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将OsAOS1基因克隆到双元表达载体pPZP2Ha3 （+）的35S启动子（P35S）和Tnos之间，构建35S∶OsAOS1表达载体。 16烟草转化
将上述OsAOS1基因表达载体通过热激法转化农杆菌EHA105[22]。采用叶盘法[23]转化烟草。
17OsAOS1基因和PR1基因在转基因植株中的表达情况
在转基因烟草种子成熟阶段取上部幼嫩叶片，液氮冻存。用于分析OsAOS1、NtPR1a和NtPRB1b的表达情况。
18RNA分析
RNA的提取按照TaKaRa RNAisoTM plus（TaKaRa）说明书进行操作，利用RNase-free DNase Ⅰ（TaKaRa）除去RNA中的DNA，按EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书（全式金）进行逆转录反应。本研究中所用引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，所扩增基因在GenBank/EMBL 数据库中的序列号和PCR扩增条件如表1所示。利用20%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用Gel-Pro Analyzer 40 software （Media Cybernetics， USA）分析PCR条带的信号强度，并计算目的基因与内标基因（OsActin、OsUBQ和NtActin基因）的相对值。
2结果与分析
21OsAOS1和OsAOS2基因在水稻不同器官中的表达
通过比较2个水稻AOS基因在根、茎和叶片中的表达水平，可以看出OsAOS1和OsAOS2基因表达的器官特异性相似，但这两个基因相对表达量差距较大。OsAOS1和OsAOS2基因在根、茎和叶片中的表达都依次降低，OsAOS1基因在这些器官中的相对表达量差异比较小，而OsAOS2基因在这些器官中的相对表达量差异较大（图1）。据此推测，OsAOS1基因在水稻生长发育中的作用可能不同于OsAOS2基因。
A：利用RT-PCR分析OsAOS1和OsAOS2基因在水稻根、茎和叶子中的转录本水平；B：OsAOS1和OsAOS2基因相对OsActin的表达分析
图1OsAOS基因在六叶期水稻植株不同器官中的表达
22外源JA对OsAOS1基因和OsAOS2基因表达的影响
外源JA处理2 h，叶片中OsAOS1基因的表达被明显诱导，随后OsAOS1基因的表达逐渐降低。而OsAOS2基因的诱导表达出现在JA处理后24 h，然后持续表达（图2）。这个结果表明，OsAOS1和OsAOS2基因都参与了JA依赖的反应，但是反应机制不同。值得注意的是Mock处理对OsAOS2的表达有一定的影响，这可能是由于喷洒甲醇溶液时，气流对叶子产生一种机械作用所导致，而OsAOS1基因可能不参与该途径。
A：利用RT-PCR分析外源JA处理后不同时间点OsAOS1和OsAOS2基因的表达水平；B：OsAOS1基因和OsAOS2基因相对OsUBQ的表达分析
图2外源JA处理对水稻叶片OsAOS1基因和
OsAOS2基因表达水平的影响
23OsAOS1转基因烟草抑制NtPR1基因的基础表达
已有研究表明，烟草的NtPR1a和NtPRB1b与烟草的抗病性直接相关[25，26]。因此，我们构建了OsAOS1基因的过量表达载体（图3A），转化至烟草中，分析了T2代转基因烟草中OsAOS1基因的表达水平与NtPR1a基因和NtPRB1b基因的表达水平之间的关系。如图3B和3C所示，转基因烟草不同株系中OsAOS1基因的表达水平均高于非转基因烟草。与此相反，NtPR1a和NtPRB1b的表达水平明显低于非转基因烟草植株。这些结果表明OsAOS1基因在烟草中的过量表达抑制了烟草PR1基因的表达。
注：15-2、19-2、20-3和22-1是4个不同的转基因烟草株系， SR是野生型烟草。
A：转OsAOS1基因表达载体示意图；B：利用RT-PCR分析OsAOS1转基因烟草中OsAOS1和NtPR1基因的表达情况；C：OsAOS1和NtPR1基因相对于NtActin的表达分析
图3转基因烟草中OsAOS1的过量表达抑制NtPR1基因的表达水平
3讨论
本研究发现，OsAOS1和OsAOS2基因表达的器官特异性和对外源JA处理的应答反应均不同。此外，有报道表明伤处理诱导OsAOS1基因快速瞬时表达[21]，而OsAOS2基因不受伤处理的诱导[24]。Haga和Iino（2004）构建的AOS蛋白系统进化树显示OsAOS1在进化树上的位置相对其他单子叶AOS蛋白更接近于双子叶植物AOS[21]。这些表达和结构上的不同可能决定了OsAOS1和OsAOS2功能上的差异。
OsAOS2基因过量表达激活了JA应答的OsPR1a和OsPR1b的表达[22]。然而在OsAOS1基因过量表达的转基因烟草，内源PR1基因的表达均被抑制。通过对转基因烟草中PR1基因的表达情况分析，我们推断OsAOS1基因可能是负调控JA应答反应中PR1基因的表达。我们做了如下假设：在转基因烟草中，外源AOS基因和内源AOS基因的底物相同，当OsAOS1基因过表达后，通过该条途径的JA反应会明显增强，OsAOS1调控的JA反应可能不直接影响PR1基因的表达。但是如此一来，因为底物的限制，通过烟草内源的、与PR1基因表达相关的AOS基因所调控的JA反应就会减弱，导致烟草内源PR1基因的表达降低。我们需要更多直接证据来验证这个假设。
此外，外源JA、SA和稻瘟病能够诱导水稻PR1a和PR1b基因的表达，所以 PR1a和PR1b基因被认为与水稻抗病反应相关[27，28]。OsAOS1基因的过量表达抑制了NtPR1a和NtPRB1b基因的表达，因此OsAOS1基因可能不参与水稻抗病反应。Haga 和 Iino （2004）的研究表明，OsAOS1基因参与调控光敏色素介导的水稻胚芽鞘延伸，因为在OsAOS1基因缺失的突变体cpm1中，光敏色素介导的胚芽鞘生长抑制现象明显小于野生型[21]。OsAOS1基因在水稻生长发育中的其它作用，还需要我们进一步分析AOS1转基因水稻和烟草植株的生理、生化特征及对各种生物胁迫和非生物胁迫的反应。 参考文献：
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