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摘 要：采用硝普钠（Sodium nitroprusride，SNP）作为外源一氧化氮（nitric oxide，NO）供体，研究一氧化氮对灵芝产量、木质素和灵芝多糖含量的影响。结果表明，5mmol/L SNP处理促进灵芝子实体生长，并显著提高灵芝多糖含量，降低木质素含量；当SNP处理浓度达到20mmol/L时，将抑制灵芝多糖的积累。
关键词：灵芝；一氧化氮；木质素；灵芝多糖
中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）14-19-02
灵芝是一种药食兼用真菌，在我国有着悠久的应用历史。灵芝子实体具有抑制肿瘤、抗血栓形成、防止动脉硬化、提高人体免疫力、镇痛及延迟细胞衰老等功效[1-3]，其主要含有多糖和灵芝酸等其他有效化学成分[4]。与猴头菇、灰树花、姬松茸等肉质化的食药用真菌子实体相比，灵芝子实体含有高达70%以上的纤维素和木质素，使得其不能直接食用，只能通过适当的提取工艺提取多糖和灵芝酸等有效药用成分。然而，提取过程复杂，且有效成分有损失、提取不完全，从而大大限制了子实体的药用价值和灵芝产业发展。因此，如何降低灵芝木质素含量一直是灵芝产业所关注的重要课题。本文采用生物信号分子一氧化氮（NO）供体硝普钠作为灵芝子实体生长过程中次生代谢产物调节剂，研究一氧化氮对灵芝木质素和多糖含量的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 灵芝菌种（Ganoderma lucidum）由上海农科院食用所提供。蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、乙醇、蛋白胨、葡萄糖、硝普钠（Sodium nitroprusride，SNP，购自Sigma公司）、氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸、浓硫酸、琼脂、苯酚、酒石酸钾钠、无水硫酸钠。
1.2 仪器与设备 JA2003N型电子分析天平、756-MC型可见分光光度计、YXQ-LS50S11立式压力蒸汽灭菌器、HZ-300L恒温摇床、HH·B11·420-S电热恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、HH-6恒温水浴锅，SW-CJ-2FD双人单面净化工作台、XHF-D高速分散器、北京博医讯冷冻干燥机。
1.3 方法
1.3.1 灵芝栽培与处理 采用棉籽壳44%，杂木屑44%，麸皮5%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏粉1%配方配制培养基。选用500mL罐头瓶栽培，每瓶装干料150g，常规灭菌接种后，于25℃左右条件下培养，经20d发菌培养，当菌丝长至1/2瓶时，可以除去封口纸，搬至子实体发生室。此时控温25～28℃，相对湿度增至90%～95%，保持空气清新，增强漫射光。待长出菇蕾时每隔4d用0、0.5、1、5、10、20mmol/L浓度的硝普钠（NO供体）进行表面喷施，每组重复10瓶，共处理10次。在弹孢期后采收子实体，并测定相关指标。
1.3.2 木质素含量测定 子实体于60℃烘箱烘干后粉碎，过40目筛后，用于测定灵芝木质素含量。木质素含量的测定参照鞠志国等的方法[5]。按1∶10（W/V）加入沸水，冷却后加入86%硫酸25mL，室温下充分搅拌4h，加入250mL dH2O煮沸1h，冷却后用烘干至恒重的砂芯滤斗抽滤，用60℃热dH2O洗涤至洗液与10%BaCl2反应时不出现沉淀为止，砂芯滤斗烘干后称重。按以下式计算木质素含量：
木质素（%）=[（抽滤后漏斗重-抽滤前漏斗重）/样品重]×100
1.3.3 灵芝多糖提取与含量测定 （1）灵芝多糖提取。采集子实体，60℃烘箱烘干后粉碎，过40目筛后，用于测定灵芝多糖含量。称取0.100g，加入5mL1mol/L NaOH，60℃水浴1h，然后6 000rpm离心10min，取上清液，得多糖样品粗提液。再用Sevag法除去蛋白，在4℃用去离子水透析24h、60℃旋转蒸发器浓缩、-45℃真空冷冻干燥36h。（2）灵芝多糖含量的测定。称取标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至250mL制成40μg/mL葡萄糖标准液。取试管分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液，用ddH2O补齐至2.0mL；加入6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%浓硫酸5.0mL。混匀后于485nm测定光密度值。以葡萄糖含量（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y），作出葡萄糖标准曲线y=0.009 1x-0.006 7，R2=0.993 6。取0.1mL多糖提取液，加入1.9mL ddH2O、6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%浓硫酸5.0mL，混匀后于485nm测定光密度值。按标准曲线计算多糖含量。
1.3.4 灵芝产量测定 在弹孢期后采收，用电子天平称取子实体质量。
1.3.5 数据统计 本实验各处理重复3次，试验结果均以平均数±标准偏差表示，各样品组间差异显著性采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行分析处理，两均数间差异显著性采用双尾t检验。所用统计软件为SPSS10。（下转22页）（上兿19页）2 结果与分析
2.1 不同浓度SNP对灵芝产量的影响 0～20mmol/L SNP处理对灵芝子实体产量变化情况如图1所示。0.5、10和20mmol/L SNP处理组子实体干物质积累与对照无显著差异（P>0.05）。当SNP浓度达到1和5mmol/L时则显著促进灵芝菌丝生长（P<0.05），5mmol/L时子实体干重达到峰值，为对照组的1.11倍，生物学效率为112%。
图1 不同浓度SNP对灵芝子实体产量的影响
2.2 不同浓度SNP对灵芝木质素含量的影响 0.5、1、10和20mmol/L SNP处理组子实体木质素含量与对照无显著差异（P>0.05）。当SNP浓度达到5mmol/L时子实体木质素含量最低，为灵芝子实体干重的10.6%，显著低于对照组的113.6%（P<0.05）。
图2 不同浓度SNP对灵芝子实体木质素含量的影响
图3 不同浓度SNP对灵芝子实体多糖含量的影响
2.3 不同浓度SNP对灵芝多糖含量的影响 0.5和10mmol/L SNP处理组子实体灵芝多糖含量与对照无显著差异（P>0.05）。当SNP浓度达到1和5mmol/L时多糖含量显著高于对照组（P<0.05），分别比对照组高23.3%和34.5%。当SNP处理浓度为10mmol/L，子实体灵芝多糖含量则显著低于对照组（P<0.05）。
3 讨论
一氧化氮（NO）是一种气体生物信号分子，广泛参与真菌生长发育过程和环境因子胁迫条件下次生代谢产物的积累[6-8]。Zheng等[9]的研究发现，一定浓度的NO能够诱导桦褐孔菌酚类化合物的积累。Kong等[10]报道，37℃热胁迫刺激深层发酵白灵菇菌丝体NO的产生，外源NO供体硝普钠能诱导白灵菇菌丝细胞内海藻糖生物合成相关酶基因的表达而降低细胞内膜脂过氧化产物丙二醛含量，从而增强耐热性。本研究发现，5mmol/L SNP能显著提灵芝子实体产量、提高灵芝多糖含量，降低木质素含量；当SNP处理浓度达到20mmol/L时，将抑制灵芝多糖的积累。有关NO降低灵芝木质素含量而诱导灵芝多糖合成的生物化学机理正在进一步研究之中。
参考文献
[1]林志彬.灵芝的现代研究[M].3版.北京：北京大学医学出版社，2007，1-359.
[2]Tang YJ ，Zhong JJ.Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J].Enzyme and Microbial Technology，2002，31（1）： 20-28.
[3]李明春，雷林生，王庆彪.灵芝多糖对小鼠T细胞胞浆游离Ca2+浓度和胞内pH的影响[J].中国药理学通报，2001，17（2）：167-170.
[4]蔺丽，方能虎，吴旦.灵芝的主要生物活性研究概况[J].中国食用菌，2002，21（3）：38-40.
[5]鞠志国，刘成兵，原永兵.莱阳仕梨酚类物质合成的调节及其对果实品质的影响[J].中国农业科学，1993，26（4）：44-48.
[6]You BJ，Chang W，Chung KR.Effect of solid-medium coupled with reactive oxygen species on ganoderic acid biosynthesis and MAP kinase phosphorylation in Ganoderma lucidum[J].Food research int，2012，49： 634-640.
[7]Jayashree T，Subramanyam C.Oxidative stress as a prerequisite for aflatoxin production by Aspergillus parasiticus[J].Free radical biology medicine，2000，29（10）： 981-985.
[8]Aguirre J，Hansberg W，Navarro R.Fungal responses to reactive oxygen species [J].Medical Mycology，2006，44： 101-107.
[9]Zheng WF，Liu YB，Pan SY，Yuan WH.Involvements of S-nitrosylation and denitrosylation in the production of polyphenols by Inonotus obliquus[J].Appl Microbiol Biotechnol，2011，90： 1 763-1 772.
[10]Kong WW，Huang CY，Chen Q，Zou YJ，Zhang JX.Nitric oxide alleviates heat stress-induced oxidative damage in Pleurotus eryngii var tuoliensis[J].Fungal Genet Biol，2012，49： 15-20.
关键词：灵芝；一氧化氮；木质素；灵芝多糖
中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）14-19-02
灵芝是一种药食兼用真菌，在我国有着悠久的应用历史。灵芝子实体具有抑制肿瘤、抗血栓形成、防止动脉硬化、提高人体免疫力、镇痛及延迟细胞衰老等功效[1-3]，其主要含有多糖和灵芝酸等其他有效化学成分[4]。与猴头菇、灰树花、姬松茸等肉质化的食药用真菌子实体相比，灵芝子实体含有高达70%以上的纤维素和木质素，使得其不能直接食用，只能通过适当的提取工艺提取多糖和灵芝酸等有效药用成分。然而，提取过程复杂，且有效成分有损失、提取不完全，从而大大限制了子实体的药用价值和灵芝产业发展。因此，如何降低灵芝木质素含量一直是灵芝产业所关注的重要课题。本文采用生物信号分子一氧化氮（NO）供体硝普钠作为灵芝子实体生长过程中次生代谢产物调节剂，研究一氧化氮对灵芝木质素和多糖含量的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 灵芝菌种（Ganoderma lucidum）由上海农科院食用所提供。蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、乙醇、蛋白胨、葡萄糖、硝普钠（Sodium nitroprusride，SNP，购自Sigma公司）、氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸、浓硫酸、琼脂、苯酚、酒石酸钾钠、无水硫酸钠。
1.2 仪器与设备 JA2003N型电子分析天平、756-MC型可见分光光度计、YXQ-LS50S11立式压力蒸汽灭菌器、HZ-300L恒温摇床、HH·B11·420-S电热恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、HH-6恒温水浴锅，SW-CJ-2FD双人单面净化工作台、XHF-D高速分散器、北京博医讯冷冻干燥机。
1.3 方法
1.3.1 灵芝栽培与处理 采用棉籽壳44%，杂木屑44%，麸皮5%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏粉1%配方配制培养基。选用500mL罐头瓶栽培，每瓶装干料150g，常规灭菌接种后，于25℃左右条件下培养，经20d发菌培养，当菌丝长至1/2瓶时，可以除去封口纸，搬至子实体发生室。此时控温25～28℃，相对湿度增至90%～95%，保持空气清新，增强漫射光。待长出菇蕾时每隔4d用0、0.5、1、5、10、20mmol/L浓度的硝普钠（NO供体）进行表面喷施，每组重复10瓶，共处理10次。在弹孢期后采收子实体，并测定相关指标。
1.3.2 木质素含量测定 子实体于60℃烘箱烘干后粉碎，过40目筛后，用于测定灵芝木质素含量。木质素含量的测定参照鞠志国等的方法[5]。按1∶10（W/V）加入沸水，冷却后加入86%硫酸25mL，室温下充分搅拌4h，加入250mL dH2O煮沸1h，冷却后用烘干至恒重的砂芯滤斗抽滤，用60℃热dH2O洗涤至洗液与10%BaCl2反应时不出现沉淀为止，砂芯滤斗烘干后称重。按以下式计算木质素含量：
木质素（%）=[（抽滤后漏斗重-抽滤前漏斗重）/样品重]×100
1.3.3 灵芝多糖提取与含量测定 （1）灵芝多糖提取。采集子实体，60℃烘箱烘干后粉碎，过40目筛后，用于测定灵芝多糖含量。称取0.100g，加入5mL1mol/L NaOH，60℃水浴1h，然后6 000rpm离心10min，取上清液，得多糖样品粗提液。再用Sevag法除去蛋白，在4℃用去离子水透析24h、60℃旋转蒸发器浓缩、-45℃真空冷冻干燥36h。（2）灵芝多糖含量的测定。称取标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至250mL制成40μg/mL葡萄糖标准液。取试管分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液，用ddH2O补齐至2.0mL；加入6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%浓硫酸5.0mL。混匀后于485nm测定光密度值。以葡萄糖含量（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y），作出葡萄糖标准曲线y=0.009 1x-0.006 7，R2=0.993 6。取0.1mL多糖提取液，加入1.9mL ddH2O、6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%浓硫酸5.0mL，混匀后于485nm测定光密度值。按标准曲线计算多糖含量。
1.3.4 灵芝产量测定 在弹孢期后采收，用电子天平称取子实体质量。
1.3.5 数据统计 本实验各处理重复3次，试验结果均以平均数±标准偏差表示，各样品组间差异显著性采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行分析处理，两均数间差异显著性采用双尾t检验。所用统计软件为SPSS10。（下转22页）（上兿19页）2 结果与分析
2.1 不同浓度SNP对灵芝产量的影响 0～20mmol/L SNP处理对灵芝子实体产量变化情况如图1所示。0.5、10和20mmol/L SNP处理组子实体干物质积累与对照无显著差异（P>0.05）。当SNP浓度达到1和5mmol/L时则显著促进灵芝菌丝生长（P<0.05），5mmol/L时子实体干重达到峰值，为对照组的1.11倍，生物学效率为112%。
图1 不同浓度SNP对灵芝子实体产量的影响
2.2 不同浓度SNP对灵芝木质素含量的影响 0.5、1、10和20mmol/L SNP处理组子实体木质素含量与对照无显著差异（P>0.05）。当SNP浓度达到5mmol/L时子实体木质素含量最低，为灵芝子实体干重的10.6%，显著低于对照组的113.6%（P<0.05）。
图2 不同浓度SNP对灵芝子实体木质素含量的影响
图3 不同浓度SNP对灵芝子实体多糖含量的影响
2.3 不同浓度SNP对灵芝多糖含量的影响 0.5和10mmol/L SNP处理组子实体灵芝多糖含量与对照无显著差异（P>0.05）。当SNP浓度达到1和5mmol/L时多糖含量显著高于对照组（P<0.05），分别比对照组高23.3%和34.5%。当SNP处理浓度为10mmol/L，子实体灵芝多糖含量则显著低于对照组（P<0.05）。
3 讨论
一氧化氮（NO）是一种气体生物信号分子，广泛参与真菌生长发育过程和环境因子胁迫条件下次生代谢产物的积累[6-8]。Zheng等[9]的研究发现，一定浓度的NO能够诱导桦褐孔菌酚类化合物的积累。Kong等[10]报道，37℃热胁迫刺激深层发酵白灵菇菌丝体NO的产生，外源NO供体硝普钠能诱导白灵菇菌丝细胞内海藻糖生物合成相关酶基因的表达而降低细胞内膜脂过氧化产物丙二醛含量，从而增强耐热性。本研究发现，5mmol/L SNP能显著提灵芝子实体产量、提高灵芝多糖含量，降低木质素含量；当SNP处理浓度达到20mmol/L时，将抑制灵芝多糖的积累。有关NO降低灵芝木质素含量而诱导灵芝多糖合成的生物化学机理正在进一步研究之中。
参考文献
[1]林志彬.灵芝的现代研究[M].3版.北京：北京大学医学出版社，2007，1-359.
[2]Tang YJ ，Zhong JJ.Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J].Enzyme and Microbial Technology，2002，31（1）： 20-28.
[3]李明春，雷林生，王庆彪.灵芝多糖对小鼠T细胞胞浆游离Ca2+浓度和胞内pH的影响[J].中国药理学通报，2001，17（2）：167-170.
[4]蔺丽，方能虎，吴旦.灵芝的主要生物活性研究概况[J].中国食用菌，2002，21（3）：38-40.
[5]鞠志国，刘成兵，原永兵.莱阳仕梨酚类物质合成的调节及其对果实品质的影响[J].中国农业科学，1993，26（4）：44-48.
[6]You BJ，Chang W，Chung KR.Effect of solid-medium coupled with reactive oxygen species on ganoderic acid biosynthesis and MAP kinase phosphorylation in Ganoderma lucidum[J].Food research int，2012，49： 634-640.
[7]Jayashree T，Subramanyam C.Oxidative stress as a prerequisite for aflatoxin production by Aspergillus parasiticus[J].Free radical biology medicine，2000，29（10）： 981-985.
[8]Aguirre J，Hansberg W，Navarro R.Fungal responses to reactive oxygen species [J].Medical Mycology，2006，44： 101-107.
[9]Zheng WF，Liu YB，Pan SY，Yuan WH.Involvements of S-nitrosylation and denitrosylation in the production of polyphenols by Inonotus obliquus[J].Appl Microbiol Biotechnol，2011，90： 1 763-1 772.
[10]Kong WW，Huang CY，Chen Q，Zou YJ，Zhang JX.Nitric oxide alleviates heat stress-induced oxidative damage in Pleurotus eryngii var tuoliensis[J].Fungal Genet Biol，2012，49： 15-20.