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[摘要] 目的 探讨干扰素-γ、白介素-32和白细胞介素-1β在原因不明习惯性流产中的表达及临床意义。 方法 ELISA法检测URSA组、正常妊娠组和健康对照组血清中IFN-γ、IL-32和IL-1β的浓度，并进行统计学分析。 结果 URSA组IFN-γ、IL-32和IL-1β的血清浓度水平显著高于健康对照组和正常妊娠组（Ｐ ＜ ０．０１）；正常妊娠组较健康对照组的IFN-γ、IL-32和IL-1β血清浓度水平均显著下降（Ｐ均＜０．０１）。 结论 IFN-γ、IL-1β、IL-32反馈环可能参与了URSA的发生，对其血清浓度的检测可作为监测URSA病人治疗效果和再次妊娠结局的指标。
[关键词] URSA；干扰素-γ；白介素-32；白细胞介素-1β
[中图分类号] R741.21[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）10-0082-02
Clinical significance of IFN-γ、IL-32、IL-1β in unexplained recurrent spontaneous abortion
SUN Congcong LIANG Yujie CHEN Qian ZHU Dan ZHU Yanle ZHENG Keqiong YAN Luoyuan
Department of Gynaecology and Obstetrics，the Affiliated Yueqing Hospital of Wenzhou Medical College，Yueqing 325600， China
[Abstract] Objective To explore the expression and the clinical significance of IFN-γ，IL-32 and IL-1β in Unexplained recurrent spontaneous abortion. Methods In method of ELISA to detect the serum level of IFN-γ， IL-32 and IL-1β in healthy control group， URSA group， pathological pregnancy group. Results The serum level of IFN-γ，IL-32 and IL-1β in URSA group are significantly increased as compared with healthy control group and pathological pregnancy group(P ＜0.01). The serum level of IFN-γ、IL-32 and IL-1β are significantly lower in pathological pregnancy group than in the healthy control group (P ＜ 0.05). Conclusion The IFN-γ，IL-32，IL-1βfeedback loop maybe involved in Unexplained recurrent spontaneous abortion.
[Key words] Unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA); IFN-γ; IL-32; IL-1β
原因不明复发性流产（uｎｅｘplained recurrent spontaneous abortion， URSA）是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上自然流产，且不存在染色体、解剖、内分泌和自身免疫功能异常以及生殖道感染等病因。生殖免疫学观点认为，正常妊娠的维持有赖于妊娠妇女对胚胎半同种抗原的免疫耐受，一旦这种母胎免疫耐受被打破，将导致流产的发生。正常妊娠过程中，Th1/Th2型细胞因子保持一定的平衡，其中Th2型细胞因子占优势[1]，母体内IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路应受到抑制，可确保母婴免疫耐受。一旦此正反馈环失去控制，无限放大Th1模式，最终可能导致URSA的发生[2]。本研究通过检测IFN-γ、IL-32和IL-1β在原因不明习惯性流产中的血清浓度水平，以探讨IFN-γ、IL-32、IL-1β反馈环在原因不明习惯性流产中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
URSA组60例，均为本院妇产科门诊患者，所有病例均经过详细询问病史及体格检查，同时具备以下条件：①连续发生 3 次或 3 次以上原发性早期自然流产（３~６次），最后一次发生在 1 年以内；②夫妇双方染色体检查正常；③女方生殖道检查无解剖学畸形；④生殖内分泌激素水平测定及诊断性刮宫检查排除内分泌因素；⑤对宫颈分泌物进行PCR 检查排除生殖系统感染；⑥抗磷脂抗体等自身免疫性抗体检查结果显示阴性；⑦未进行过主动免疫治疗；⑧男方精液行常规检查结果显示正常。正常妊娠组30例，为同期妊娠 12周以内的正常妊娠女性，年龄 21～30岁，平均（25.40±2.95）岁，无自然流产史、无死胎死产史，无合并感染及自身免疫性疾病。本次妊娠期间无阴道流血及下腹疼痛等先兆流产的症状和体征；B 超显示胚胎发育正常。正常非孕妇女组（对照组）22例，为同期健康已正常生育妇女，既往无不良孕产史，有一胎及以上正常足月分娩史，年龄25 ~ 35岁，平均（２９．１２±２．３２）岁。对三组对象的一般资料进行比较，差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。
1.2 血清IL-32、IFN-γ和IL-1β测定方法
三组对象均空腹采集外周静脉自凝血5 mL，血液凝固后3 000 r/min离心5 min，分离血清置Eppendorf管中，-20℃冻存备测。采用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-32、IL-1β的水平。IL-1β ELISA试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供，产品货号H1025；IFN-γ ELISA试剂盒由上海亨代劳商贸有限公司提供，产品货号Y10033A；IL-32 ELISA试剂盒由上海亚培生物科技有限公司提供，产品编号E1802h。严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.3 统计学处理
所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。实验数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间不同指标间差异采用单因素方差分析，两两比较，方差齐时采用LSD法，不齐时采用Dunnett’s T3法。
2 结果
将三组研究对象血清IFN-γ、IL-32、IL-1β的浓度进行比较可以看出：①IFN-γ浓度：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降；②IL-32：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组亦均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降；③IL-1β：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组亦均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降。
3 讨论
在生理妊娠过程中，母体和胚胎间免疫双向调节维持在一个动态平衡水平是妊娠成功的关键。怀孕期间母体内存在着复杂的免疫调节机制，主要表现为免疫耐受或免疫抑制增强，而免疫排斥减弱，一旦这种平衡状态被打破，就会导致病理性妊娠，甚至发生流产[3]。
正常妊娠表现为一种特殊的Th2现象，Th1处于抑制状态，各种 Th1型的细胞因子表达水平降低甚至消失，Thl/Th2 间的平衡始终保持在最有利于维持妊娠的向 Th2 型细胞因子的偏移。Th1 细胞主要分泌 IL-2、IFN-γ 和 TNF-β 等，参与细胞免疫、迟发型超敏反应和急性移植排斥反应，具有抗胞内病原体感染、抗病毒、抗肿瘤及妊娠中免疫排斥作用；而 Th2 细胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10 等，主要功能是介导体液免疫，刺激 B 细胞增殖并产生抗体，对同种移植产生免疫耐受。因此当Th1型细胞因子过度表达时，将导致反复自然流产（URSA）的发生[4-6]。IFN-γ是由Thl细胞所分泌的特征性细胞因子，能激活T细胞和吞噬细胞，而被激活的T细胞和吞噬细胞能够转录合成IL-32； IL-32通过活化NF-κB和p38 MAPK途径刺激T细胞和吞噬细胞释放IL-1β；IL-1β又可以正反馈作用于T细胞和吞噬细胞等，使之表达的IFN-γ受体明显增多，引发更多的IFN-γ活化[7]，形成了IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路，以T细胞和吞噬细胞为中心，不断放大Th1炎症免疫模式。
从本实验的研究结果可以看出IFN-γ、IL-32和IL-1β三种细胞因子在三组实验对象血清中的浓度变化表现出一致性。通过本结果我们可以作如下分析和推断：①反复发生自然流产的患者IFN-γ、IL-32、IL-1β的血清浓度明显升高，反映出IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制，IFN-γ受体越来越多，呈现出过度活化状态。IFN-γ是 Th1细胞因子，促进 Th1 细胞并抑制 Th2 型细胞的分化及分泌功能，降低 IL-4、IL-10的活性。这样，不明原因自然流产患者体内Thl/Th2的平衡状态被打破，从而导致了流产的发生。②正常妊娠组IFN-γ浓度比对照组显著下降，表明Th1处于抑制状态，使Thl/Th2 间的平衡始终保持在最有利于维持妊娠的 Th2 型细胞因子偏移。至此我们认为以T淋巴细胞亚群为中心，IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制，导致了Th1 细胞的过度表达，同时也可能抑制了Th2 型细胞的分化及分泌功能（有待进一步的研究证实），也就是说IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制是打破Thl/Th2的平衡状态的因素之一，从而引起了URSA疾病的发生。③在正常妊娠组IL-32和IL-1β的血清浓度比正常对照组显著下降。可能是因为 IL-32主要由 IFN-γ诱导产生且IL-32 mRNA在免疫组织中的表达高于其它组织中的表达[8]。而IL-1β浓度的下降可能与IL-32浓度的下降有关，因为IL-32能通过活化NF-κB和p38 MAPK途径刺激T细胞和吞噬细胞释放IL-1β[7]。但是IL-32和IL-1β除了在IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路中对Thl/Th2平衡起作用，其血清浓度的变化对生理性妊娠过程是否存在影响尚有待进一步的研究得出结论。通过本试验我们可以得出结论——对IFN-γ、IL-32、IL-1β血清浓度的检测不仅可作为监测URSA患者治疗效果和再次妊娠结局的指标，也为进一步研究URSA的治疗方法和发病机制提供了新思路。而这些指标参与URSA发生的具体机制还有待更加深入地研究。
[参考文献]
[1]Raghupathy R，Makhseed M，Azizieh F，et al. Maternal Thl- and Th2-type reactivity to placental antigens in normal human pregnancy and unexplained recurrent spontaneous abortions[J]. Cell Immunol，1999，196（２）：１２２－３０．
[2]Calabrese F，Baraldo S，Bazzan E，et al. IL-32，a novel proin flammatory cytokine in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２００８，１７８（９）：８９４－９０１．
[3]Beydoun H，Saftlas AF. Association of human leucocyte antigen sharing with recurrent spontaneous abortions[J]. Tissue Antigens，2005，６５（２）： 123-135.
[4]Le Bouteiller P，Piccinni MP． Human NK cells in pregnant uterus：why there?[J]． Am J Reprod Immunol，2008，５９（５）：４０１－４０６．
[5]Schafer-Somi S． Cytokines during early pregnancy of mammals：a review[J]．Anim Reprod Sci，2003，75(1/2)：73-94．
[6]Athanassakis I，Vassiliadis S. Interplay between T helper type 1 and type 2 cytokines and soluble major histocompatibility complex molecules：a paradigmin pregnancy[J]. Immunology，２００２，１０７（３）：２８１－２８７．
[7]Netea MG，Azam T，Lewis EC，et al. Mycobacterium tuberculosis induces interleukin-32 production through a caspase-1/IL-18/interferon-Y dependent mechanism[J]. PLos Med，２００６，３（８）：１３１０－１３１９．
[8]Kim SH，Han SY，Azam T，et al. Interleukin-32：A Cytokine and inｄｕｃｅｒ ｏｆ ＴＮＦ-α[Ｊ]． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００５，２２（１）：１３１－１４２．
（收稿日期：2011-12-09）
[关键词] URSA；干扰素-γ；白介素-32；白细胞介素-1β
[中图分类号] R741.21[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）10-0082-02
Clinical significance of IFN-γ、IL-32、IL-1β in unexplained recurrent spontaneous abortion
SUN Congcong LIANG Yujie CHEN Qian ZHU Dan ZHU Yanle ZHENG Keqiong YAN Luoyuan
Department of Gynaecology and Obstetrics，the Affiliated Yueqing Hospital of Wenzhou Medical College，Yueqing 325600， China
[Abstract] Objective To explore the expression and the clinical significance of IFN-γ，IL-32 and IL-1β in Unexplained recurrent spontaneous abortion. Methods In method of ELISA to detect the serum level of IFN-γ， IL-32 and IL-1β in healthy control group， URSA group， pathological pregnancy group. Results The serum level of IFN-γ，IL-32 and IL-1β in URSA group are significantly increased as compared with healthy control group and pathological pregnancy group(P ＜0.01). The serum level of IFN-γ、IL-32 and IL-1β are significantly lower in pathological pregnancy group than in the healthy control group (P ＜ 0.05). Conclusion The IFN-γ，IL-32，IL-1βfeedback loop maybe involved in Unexplained recurrent spontaneous abortion.
[Key words] Unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA); IFN-γ; IL-32; IL-1β
原因不明复发性流产（uｎｅｘplained recurrent spontaneous abortion， URSA）是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上自然流产，且不存在染色体、解剖、内分泌和自身免疫功能异常以及生殖道感染等病因。生殖免疫学观点认为，正常妊娠的维持有赖于妊娠妇女对胚胎半同种抗原的免疫耐受，一旦这种母胎免疫耐受被打破，将导致流产的发生。正常妊娠过程中，Th1/Th2型细胞因子保持一定的平衡，其中Th2型细胞因子占优势[1]，母体内IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路应受到抑制，可确保母婴免疫耐受。一旦此正反馈环失去控制，无限放大Th1模式，最终可能导致URSA的发生[2]。本研究通过检测IFN-γ、IL-32和IL-1β在原因不明习惯性流产中的血清浓度水平，以探讨IFN-γ、IL-32、IL-1β反馈环在原因不明习惯性流产中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
URSA组60例，均为本院妇产科门诊患者，所有病例均经过详细询问病史及体格检查，同时具备以下条件：①连续发生 3 次或 3 次以上原发性早期自然流产（３~６次），最后一次发生在 1 年以内；②夫妇双方染色体检查正常；③女方生殖道检查无解剖学畸形；④生殖内分泌激素水平测定及诊断性刮宫检查排除内分泌因素；⑤对宫颈分泌物进行PCR 检查排除生殖系统感染；⑥抗磷脂抗体等自身免疫性抗体检查结果显示阴性；⑦未进行过主动免疫治疗；⑧男方精液行常规检查结果显示正常。正常妊娠组30例，为同期妊娠 12周以内的正常妊娠女性，年龄 21～30岁，平均（25.40±2.95）岁，无自然流产史、无死胎死产史，无合并感染及自身免疫性疾病。本次妊娠期间无阴道流血及下腹疼痛等先兆流产的症状和体征；B 超显示胚胎发育正常。正常非孕妇女组（对照组）22例，为同期健康已正常生育妇女，既往无不良孕产史，有一胎及以上正常足月分娩史，年龄25 ~ 35岁，平均（２９．１２±２．３２）岁。对三组对象的一般资料进行比较，差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。
1.2 血清IL-32、IFN-γ和IL-1β测定方法
三组对象均空腹采集外周静脉自凝血5 mL，血液凝固后3 000 r/min离心5 min，分离血清置Eppendorf管中，-20℃冻存备测。采用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-32、IL-1β的水平。IL-1β ELISA试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供，产品货号H1025；IFN-γ ELISA试剂盒由上海亨代劳商贸有限公司提供，产品货号Y10033A；IL-32 ELISA试剂盒由上海亚培生物科技有限公司提供，产品编号E1802h。严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.3 统计学处理
所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。实验数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间不同指标间差异采用单因素方差分析，两两比较，方差齐时采用LSD法，不齐时采用Dunnett’s T3法。
2 结果
将三组研究对象血清IFN-γ、IL-32、IL-1β的浓度进行比较可以看出：①IFN-γ浓度：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降；②IL-32：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组亦均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降；③IL-1β：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组亦均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降。
3 讨论
在生理妊娠过程中，母体和胚胎间免疫双向调节维持在一个动态平衡水平是妊娠成功的关键。怀孕期间母体内存在着复杂的免疫调节机制，主要表现为免疫耐受或免疫抑制增强，而免疫排斥减弱，一旦这种平衡状态被打破，就会导致病理性妊娠，甚至发生流产[3]。
正常妊娠表现为一种特殊的Th2现象，Th1处于抑制状态，各种 Th1型的细胞因子表达水平降低甚至消失，Thl/Th2 间的平衡始终保持在最有利于维持妊娠的向 Th2 型细胞因子的偏移。Th1 细胞主要分泌 IL-2、IFN-γ 和 TNF-β 等，参与细胞免疫、迟发型超敏反应和急性移植排斥反应，具有抗胞内病原体感染、抗病毒、抗肿瘤及妊娠中免疫排斥作用；而 Th2 细胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10 等，主要功能是介导体液免疫，刺激 B 细胞增殖并产生抗体，对同种移植产生免疫耐受。因此当Th1型细胞因子过度表达时，将导致反复自然流产（URSA）的发生[4-6]。IFN-γ是由Thl细胞所分泌的特征性细胞因子，能激活T细胞和吞噬细胞，而被激活的T细胞和吞噬细胞能够转录合成IL-32； IL-32通过活化NF-κB和p38 MAPK途径刺激T细胞和吞噬细胞释放IL-1β；IL-1β又可以正反馈作用于T细胞和吞噬细胞等，使之表达的IFN-γ受体明显增多，引发更多的IFN-γ活化[7]，形成了IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路，以T细胞和吞噬细胞为中心，不断放大Th1炎症免疫模式。
从本实验的研究结果可以看出IFN-γ、IL-32和IL-1β三种细胞因子在三组实验对象血清中的浓度变化表现出一致性。通过本结果我们可以作如下分析和推断：①反复发生自然流产的患者IFN-γ、IL-32、IL-1β的血清浓度明显升高，反映出IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制，IFN-γ受体越来越多，呈现出过度活化状态。IFN-γ是 Th1细胞因子，促进 Th1 细胞并抑制 Th2 型细胞的分化及分泌功能，降低 IL-4、IL-10的活性。这样，不明原因自然流产患者体内Thl/Th2的平衡状态被打破，从而导致了流产的发生。②正常妊娠组IFN-γ浓度比对照组显著下降，表明Th1处于抑制状态，使Thl/Th2 间的平衡始终保持在最有利于维持妊娠的 Th2 型细胞因子偏移。至此我们认为以T淋巴细胞亚群为中心，IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制，导致了Th1 细胞的过度表达，同时也可能抑制了Th2 型细胞的分化及分泌功能（有待进一步的研究证实），也就是说IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制是打破Thl/Th2的平衡状态的因素之一，从而引起了URSA疾病的发生。③在正常妊娠组IL-32和IL-1β的血清浓度比正常对照组显著下降。可能是因为 IL-32主要由 IFN-γ诱导产生且IL-32 mRNA在免疫组织中的表达高于其它组织中的表达[8]。而IL-1β浓度的下降可能与IL-32浓度的下降有关，因为IL-32能通过活化NF-κB和p38 MAPK途径刺激T细胞和吞噬细胞释放IL-1β[7]。但是IL-32和IL-1β除了在IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路中对Thl/Th2平衡起作用，其血清浓度的变化对生理性妊娠过程是否存在影响尚有待进一步的研究得出结论。通过本试验我们可以得出结论——对IFN-γ、IL-32、IL-1β血清浓度的检测不仅可作为监测URSA患者治疗效果和再次妊娠结局的指标，也为进一步研究URSA的治疗方法和发病机制提供了新思路。而这些指标参与URSA发生的具体机制还有待更加深入地研究。
[参考文献]
[1]Raghupathy R，Makhseed M，Azizieh F，et al. Maternal Thl- and Th2-type reactivity to placental antigens in normal human pregnancy and unexplained recurrent spontaneous abortions[J]. Cell Immunol，1999，196（２）：１２２－３０．
[2]Calabrese F，Baraldo S，Bazzan E，et al. IL-32，a novel proin flammatory cytokine in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２００８，１７８（９）：８９４－９０１．
[3]Beydoun H，Saftlas AF. Association of human leucocyte antigen sharing with recurrent spontaneous abortions[J]. Tissue Antigens，2005，６５（２）： 123-135.
[4]Le Bouteiller P，Piccinni MP． Human NK cells in pregnant uterus：why there?[J]． Am J Reprod Immunol，2008，５９（５）：４０１－４０６．
[5]Schafer-Somi S． Cytokines during early pregnancy of mammals：a review[J]．Anim Reprod Sci，2003，75(1/2)：73-94．
[6]Athanassakis I，Vassiliadis S. Interplay between T helper type 1 and type 2 cytokines and soluble major histocompatibility complex molecules：a paradigmin pregnancy[J]. Immunology，２００２，１０７（３）：２８１－２８７．
[7]Netea MG，Azam T，Lewis EC，et al. Mycobacterium tuberculosis induces interleukin-32 production through a caspase-1/IL-18/interferon-Y dependent mechanism[J]. PLos Med，２００６，３（８）：１３１０－１３１９．
[8]Kim SH，Han SY，Azam T，et al. Interleukin-32：A Cytokine and inｄｕｃｅｒ ｏｆ ＴＮＦ-α[Ｊ]． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００５，２２（１）：１３１－１４２．
（收稿日期：2011-12-09）