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摘 要：以类球红细菌NM-FZ-47为出发菌株，采用紫外线和NTG2种诱变，利用叠氮钠、对羟基苯甲酸、罗红霉素及卡那霉素等抗性筛选因子，实现快速推理选育辅酶Q10高产菌株，成功构建了2个正突变库，并从库中筛选出产量提高15%以上的6株辅酶Q10突变株UV-LH-37、UV-NaN3-44、NTG-LH-28、NTG-NaN3-17、NTG-PHB-54、NTG-LN-67，作为进一步基因组改组育种的出发菌株。
关键词：诱变育种；推理选育；正突变库
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0018-03
辅酶Q10（CoQ10）又称为泛醌，作为一种重要生物活性物质，具备丰富生理功能，近年来随着人们保健意识提高，需求量不断增加[1-2]。CoQ10的生产方法一般分为直接提取法、化学合成法、微生物发酵法等[3]。微生物发酵法具有原料便宜、易分离、产物天然、无手性问题、易被人体吸收等优势，同时容易实现工业化生产，成为最有发展潜力的CoQ10生产方法。类球红细菌（Rhodobacter phaeroides）是最重要的辅酶Q10产生菌[4]，菌株的生产性能是影响发酵法生产辅酶Q10成本重要因素，本研究拟通过紫外线与NTG诱变育种的手段，结合抗性因子推理育种手段，实现快速选育高产菌株的目标，分别构建紫外线与NTG诱变正突变库，为进一步基因组改组育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种 类球红类球NM-FZ-47为本实验室保藏菌株
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法 从斜面挑取一环，进行平板划线培养（32℃、7d）；挑取平板单菌落接入种子培养基（装液量25mL/250mL三角瓶）培养（32℃、220rpm、24h），制成液体种子；接种量为20%（V/V），液体种接入发酵培养基（装液量50mL/250mL三角瓶）培养（32℃、220rpm、24h）。
1.2.2 CoQ10的检测 采用HPLC法检测CoQ10的浓度[5]。
1.2.3 紫外诱变和NTG诱变正突变库构建
1.2.3.1 紫外诱变正突变库构建 菌悬液（细胞浓度为106个/mL），经紫外线照射一定时间，然后冰浴稳定5min，在红灯下稀释涂布，32℃培养7d后，挑选突变菌落，进一步定向初筛、复筛，构建紫外线诱变正突变库。
1.2.3.2 NTG诱变剂正突变库构建 菌悬液（细胞浓度为106个/mL），经一定工作浓度NTG振荡处理18min后，稀释涂布，32℃培养7d后，挑选突变菌落，进一步定向初筛、复筛，构建NTG诱变正突变库。
1.2.4 抗性因子快速推理选育CoQ10正突变株 将紫外和NTG诱变获得突变菌落，通过罗红霉素、对羟基苯甲酸（PHB）、叠氮钠和卡那霉素4种抗性因子胁迫选择，实现定向快速筛选CoQ10高产菌株。
2 结果与分析
2.1 诱变剂量的确定
2.1.1 紫外诱变最适剂量 以照射时间作为紫外线诱变的剂量，分别改变照射时间0s，20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s，90s，获得紫外诱变致死曲线，结果如图1。当照射70s时，致死率已达到100%，由于是初次诱变，根据经验选择致死率为75%的致死剂量，由图可知紫外线照射时间为50s。
2.1.2 NTG诱变最适剂量 分别改变NTG工作浓度0，0.2，0.4，0.5，0.8mg/L，获得NTG诱变致死曲线，结果见图2。当NTG浓度为0.6mg/mL时，致死率已达99%，由于是初次诱变，根据经验选择致死率为75%的致死剂量，由图可知NTG工作浓度为0.4mg/mL。
2.2 抗性因子推理选育CoQ10正突变株 根据CoQ10的生理功能，利用抗性因子筛选作用，实现定向推理选育高产菌株。CoQ10具有清除自由基的作用，而罗红霉素易与氧分子结合发生電荷转移形成超氧阴离子，CoQ10还原性能够有效抑制卡那霉素的氧化作用，有效解毒叠氮钠对呼吸链的抑制作用，所以菌体对罗红霉素、卡那霉素、叠氮钠抗性越高，菌体合成CoQ10能力越高[5-7]。PHB[8-9]作为CoQ10生物合成的前体，如果菌体对PHB抗性越强，说明菌体解除PHB前体合成反馈抑制作用，更有利菌体合成CoQ10。因此利用4个抗性因子定向筛选作用，可实现CoQ10的高产菌株的快速筛选。
2.2.1 抗性因子胁迫浓度 初始抗性因子筛选浓度太低起不到胁迫作用，太高起不到筛选作用，通过改变平板培养基中抗性因子浓度，使出发菌株在平板上无法生长的临界浓度，作为抗性因子胁迫浓度。改变平板培养基罗红霉素、卡那霉素、PHB及叠氮钠浓度，获得抑制菌体生长的临界浓度，结果如表1，获得4种抗性因子筛选胁迫浓度。
2.2.2 抗性因子筛选效应的分析 经紫外诱变和NTG诱变后，通过4种抗性因子的定向筛选后，分析正突变率与提高幅度，用于分析2种诱变方法的诱变效应用与4种筛选因子的筛选效应，结果见表2、表3。2种诱变剂诱变效应分析，NTG诱变正突变率及最大提高幅度都比紫外线诱变高，NTG诱变的正突变率最高为39.78%，最高产量达到77.68mg/L，较出发菌株提高了27.15%。4种抗性因子筛选效应分析，叠氮钠筛选效果最明显，紫外诱变与NTG诱变中，叠氮钠的正突变率分别为32.54%和39.78%，最大提高幅度分别为22.5%和27.15%。CoQ10作为一种电子传递体，其大量合成可以有效解除叠氮钠呼吸抑制作用，基于此机理，叠氮钠作为筛选因子具有独特的优势。
将诱变育种提高15%的正突变株作为基因组改组的正突变库，进一步复筛及稳定性研究，获得UV-LH-37、UV-NaN3-44、NTG-LH-28、NTG-NaN3-17、NTG-PHB-54、NTG-LN-67这6组菌株，结果如表4。但这6组菌株诱变手段与筛选因子组合不同，因此利用这6组菌株作为基因改组育种初始菌株，提供不同类型正突变基因。
3 结论
利用紫外和NTG诱变，结合罗红霉素、卡那霉素、PHB及叠氮钠抗性因子的定向筛选，推理选育构建类球红细菌辅酶Q10正突变库，最终成功筛选出6株遗传背景不同正突变株，作为基因组改组育种的出发菌株，大大提高了辅酶Q10产量。
参考文献
[1]Jeya M，Moon H J， Lee J L，et al. Current state of coenzyme Q10 production and its applications[J]. Applied microbiology and biotechnology， 2010，85（6）：1653-1663.
[2]Kettawan A，Kunthida C，Okuno M，et al. Protective effects of coenzyme Q10 against oxidative stress induced by aerobic exercise[J]. Institute of Nutrition，2012，44：1-2.
[3]陶志杰，王改玲，李妍.辅酶Q10的制备及应用新进展[J].畜牧与饲料科学，2010，31（009）：9-11.
[4]郑毅，王娅，朱志春，等.发酵法生产辅酶Q10研究进展[J].海峡科学，2012（8）：128-130.
[5]周勇，郑毅，宋利丹，等.人工神经网络与遗传算法耦合法优化辅酶Q10发酵培养基[J].中国生物工程志.2013（9）：73-78.
[6]乔志新.基于基因组改组辅酶Q10高产菌株选育[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2009.
[7]王娅.辅酶Q10高产菌株理性选育与发酵优化[D].福州：福建师范大学，2010.
[8]李聚海.辅酶Q10高产菌株选育及发酵条件优化研究[D].咸阳：西北农林科技大学，2007.
[9]郑君.光合细菌（球形红假单胞菌）发酵产辅酶Q10的研究[D].青岛：中国海洋大学2008. （责编：王慧晴）
关键词：诱变育种；推理选育；正突变库
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0018-03
辅酶Q10（CoQ10）又称为泛醌，作为一种重要生物活性物质，具备丰富生理功能，近年来随着人们保健意识提高，需求量不断增加[1-2]。CoQ10的生产方法一般分为直接提取法、化学合成法、微生物发酵法等[3]。微生物发酵法具有原料便宜、易分离、产物天然、无手性问题、易被人体吸收等优势，同时容易实现工业化生产，成为最有发展潜力的CoQ10生产方法。类球红细菌（Rhodobacter phaeroides）是最重要的辅酶Q10产生菌[4]，菌株的生产性能是影响发酵法生产辅酶Q10成本重要因素，本研究拟通过紫外线与NTG诱变育种的手段，结合抗性因子推理育种手段，实现快速选育高产菌株的目标，分别构建紫外线与NTG诱变正突变库，为进一步基因组改组育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种 类球红类球NM-FZ-47为本实验室保藏菌株
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法 从斜面挑取一环，进行平板划线培养（32℃、7d）；挑取平板单菌落接入种子培养基（装液量25mL/250mL三角瓶）培养（32℃、220rpm、24h），制成液体种子；接种量为20%（V/V），液体种接入发酵培养基（装液量50mL/250mL三角瓶）培养（32℃、220rpm、24h）。
1.2.2 CoQ10的检测 采用HPLC法检测CoQ10的浓度[5]。
1.2.3 紫外诱变和NTG诱变正突变库构建
1.2.3.1 紫外诱变正突变库构建 菌悬液（细胞浓度为106个/mL），经紫外线照射一定时间，然后冰浴稳定5min，在红灯下稀释涂布，32℃培养7d后，挑选突变菌落，进一步定向初筛、复筛，构建紫外线诱变正突变库。
1.2.3.2 NTG诱变剂正突变库构建 菌悬液（细胞浓度为106个/mL），经一定工作浓度NTG振荡处理18min后，稀释涂布，32℃培养7d后，挑选突变菌落，进一步定向初筛、复筛，构建NTG诱变正突变库。
1.2.4 抗性因子快速推理选育CoQ10正突变株 将紫外和NTG诱变获得突变菌落，通过罗红霉素、对羟基苯甲酸（PHB）、叠氮钠和卡那霉素4种抗性因子胁迫选择，实现定向快速筛选CoQ10高产菌株。
2 结果与分析
2.1 诱变剂量的确定
2.1.1 紫外诱变最适剂量 以照射时间作为紫外线诱变的剂量，分别改变照射时间0s，20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s，90s，获得紫外诱变致死曲线，结果如图1。当照射70s时，致死率已达到100%，由于是初次诱变，根据经验选择致死率为75%的致死剂量，由图可知紫外线照射时间为50s。
2.1.2 NTG诱变最适剂量 分别改变NTG工作浓度0，0.2，0.4，0.5，0.8mg/L，获得NTG诱变致死曲线，结果见图2。当NTG浓度为0.6mg/mL时，致死率已达99%，由于是初次诱变，根据经验选择致死率为75%的致死剂量，由图可知NTG工作浓度为0.4mg/mL。
2.2 抗性因子推理选育CoQ10正突变株 根据CoQ10的生理功能，利用抗性因子筛选作用，实现定向推理选育高产菌株。CoQ10具有清除自由基的作用，而罗红霉素易与氧分子结合发生電荷转移形成超氧阴离子，CoQ10还原性能够有效抑制卡那霉素的氧化作用，有效解毒叠氮钠对呼吸链的抑制作用，所以菌体对罗红霉素、卡那霉素、叠氮钠抗性越高，菌体合成CoQ10能力越高[5-7]。PHB[8-9]作为CoQ10生物合成的前体，如果菌体对PHB抗性越强，说明菌体解除PHB前体合成反馈抑制作用，更有利菌体合成CoQ10。因此利用4个抗性因子定向筛选作用，可实现CoQ10的高产菌株的快速筛选。
2.2.1 抗性因子胁迫浓度 初始抗性因子筛选浓度太低起不到胁迫作用，太高起不到筛选作用，通过改变平板培养基中抗性因子浓度，使出发菌株在平板上无法生长的临界浓度，作为抗性因子胁迫浓度。改变平板培养基罗红霉素、卡那霉素、PHB及叠氮钠浓度，获得抑制菌体生长的临界浓度，结果如表1，获得4种抗性因子筛选胁迫浓度。
2.2.2 抗性因子筛选效应的分析 经紫外诱变和NTG诱变后，通过4种抗性因子的定向筛选后，分析正突变率与提高幅度，用于分析2种诱变方法的诱变效应用与4种筛选因子的筛选效应，结果见表2、表3。2种诱变剂诱变效应分析，NTG诱变正突变率及最大提高幅度都比紫外线诱变高，NTG诱变的正突变率最高为39.78%，最高产量达到77.68mg/L，较出发菌株提高了27.15%。4种抗性因子筛选效应分析，叠氮钠筛选效果最明显，紫外诱变与NTG诱变中，叠氮钠的正突变率分别为32.54%和39.78%，最大提高幅度分别为22.5%和27.15%。CoQ10作为一种电子传递体，其大量合成可以有效解除叠氮钠呼吸抑制作用，基于此机理，叠氮钠作为筛选因子具有独特的优势。
将诱变育种提高15%的正突变株作为基因组改组的正突变库，进一步复筛及稳定性研究，获得UV-LH-37、UV-NaN3-44、NTG-LH-28、NTG-NaN3-17、NTG-PHB-54、NTG-LN-67这6组菌株，结果如表4。但这6组菌株诱变手段与筛选因子组合不同，因此利用这6组菌株作为基因改组育种初始菌株，提供不同类型正突变基因。
3 结论
利用紫外和NTG诱变，结合罗红霉素、卡那霉素、PHB及叠氮钠抗性因子的定向筛选，推理选育构建类球红细菌辅酶Q10正突变库，最终成功筛选出6株遗传背景不同正突变株，作为基因组改组育种的出发菌株，大大提高了辅酶Q10产量。
参考文献
[1]Jeya M，Moon H J， Lee J L，et al. Current state of coenzyme Q10 production and its applications[J]. Applied microbiology and biotechnology， 2010，85（6）：1653-1663.
[2]Kettawan A，Kunthida C，Okuno M，et al. Protective effects of coenzyme Q10 against oxidative stress induced by aerobic exercise[J]. Institute of Nutrition，2012，44：1-2.
[3]陶志杰，王改玲，李妍.辅酶Q10的制备及应用新进展[J].畜牧与饲料科学，2010，31（009）：9-11.
[4]郑毅，王娅，朱志春，等.发酵法生产辅酶Q10研究进展[J].海峡科学，2012（8）：128-130.
[5]周勇，郑毅，宋利丹，等.人工神经网络与遗传算法耦合法优化辅酶Q10发酵培养基[J].中国生物工程志.2013（9）：73-78.
[6]乔志新.基于基因组改组辅酶Q10高产菌株选育[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2009.
[7]王娅.辅酶Q10高产菌株理性选育与发酵优化[D].福州：福建师范大学，2010.
[8]李聚海.辅酶Q10高产菌株选育及发酵条件优化研究[D].咸阳：西北农林科技大学，2007.
[9]郑君.光合细菌（球形红假单胞菌）发酵产辅酶Q10的研究[D].青岛：中国海洋大学2008. （责编：王慧晴）