【摘 要】
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目的:构建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并合成靶向PD-L1基因的5对sgRNA序列。为了进一步降低克隆背景和提高构建阳性率,
【机 构】
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郑州大学第一附属医院感染科,郑州大学第一附属医院药学部
【基金项目】
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河南省科技厅创新人才基金项目124100510010;郑州大学第一附属医院青年基金项目(2013年)
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目的:构建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并合成靶向PD-L1基因的5对sgRNA序列。为了进一步降低克隆背景和提高构建阳性率,在受体载体中引入毒性蛋白系统(Ccd)。构建p X459-Ccd B重组载体,将p X459-Ccd B载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到p X459-Ccd B骨架载体中,转化到不含Ccd A基因的宿主菌Stbl3中。酶切不完全引起的背景载体将因毒性蛋白的作用杀死宿主菌。转化后挑取阳性克隆,进行PCR和测序验证。结果与结论:经PCR和测序验证,重组质粒p X459-PD-L1-sgRNA构建成功,为下一步体内外敲除PD-L1基因和深入研究其在肿瘤免疫逃逸中的功能奠定了基础。
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