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摘 要 对甘蔗与河八王属间杂种F1、BC1和BC2及其亲本材料的根尖体细胞染色体数目进行观察及传递分析，以探讨甘蔗与河八王染色体在不同世代的传递方式。采用根尖分生区细胞酶解去壁低渗法制片，每个世代选择5个子代进行染色体计数及传递分析。结果表明，广西河八王1号（GXN1）的染色体为30条，其他亲本和子代数目存在2～5条变幅。甘蔗与河八王染色体在F1代以n+2n方式进行传递，部分材料的染色体略有增加；在BC1和BC2代中均以n+n方式进行传递。研究结果为河八王在甘蔗育种中的进一步利用提供了细胞学参考。
关键词 甘蔗；河八王；染色体传递
中图分类号 S566.1 文献标识码 A
Abstract To explore the chromosome transmission of parents in different generations，the somatic cell chromosomes of root-tips of the parents and F1， BC1 and BC2 progeny from the distant crossing between sugarcane（Saccharum spp.）× Narenga porphyrocoma（Hance）Bor were analyzed. Chromosomes were prepared following the wall degradation hypotonic method， five hybrids each generation were selected for chromosome counting and transmission analysis. Results showed that the somatic chromosome number of GXN1 was 30， while that for other accessions were non-constant and the amplitude was 2-5. The chromosomes of the parents were transmitted by n+2n in F1 progenies， but more than n+2n existed in some materials， and by n+n in BC1 and BC2 progenies， respectively. The results would provide a cytological reference for further utilization of the N. porphyrocoma （Hance）Bor in sugarcane breeding.
Key words Sugarcane； Narenga porphyrocoma（Hance）Bor； Chromosome transmission
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.001
河八王[Narenga porphyrocoma （Hance） Bor]是甘蔗近缘属河八王属（Narenga Bor）的一个种。具有较多甘蔗需要的经济性状，如早熟，分蘖力强，直立抗倒，抗赤腐病、花叶病和黑穗病[1]。利用甘蔗与河八王杂交获得的F1，植株直立、高大，茎径、锤度介于双亲之间；其抗逆性、宿根性等方面都超越母本甘蔗。因此，河八王在甘蔗遗传改良中具有重要的价值[2]。
国内外对河八王的研究不多。在杂交利用方面，仅见获得F1的报道[2-5]。近年来，刘昔辉等[6-7]利用SSR标记对甘蔗与广西河八王杂种F1后代进行真实性鉴定，并利用AFLP标记结合毛细管电泳对15份广西河八王无性系进行遗传多样性分析及分子身份证构建。罗霆等[8]研究表明河八王及其F1后代材料比桂糖系列新品种、ROC22、斑茅、割手密以及甘蔗与斑割复合体杂交后代等表现出更高的固氮能力，河八王F1杂种固氮率达到36.13%。
本课题利用甘蔗与广西河八王进行杂交，获得了一批真实杂种F1、BC1及BC2无性系材料，但甘蔗与河八王双亲染色体在不同世代中的传递情况目前尚未明确，限制了进一步杂交利用。本研究对甘蔗与广西河八王1号（GXN1）属间杂种F1、BC1和BC2进行染色体数目观察和传递分析，初步研究甘蔗与河八王染色体在不同世代的遗传特点，为提高河八王在甘蔗育种中的利用效率提供细胞学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为广西河八王1号（GXN1）与甘蔗杂交获得的F1、BC1、BC2无性系及其双亲共19个材料（见表1）。所有试验材料种植于广西农业科学院甘蔗种质资源圃。
1.2 试验材料真杂种鉴定
取试验材料幼嫩叶片，SDS法[9]提取基因组DNA。杂种F1真实性鉴定PCR引物mSSCIR198；BC1鉴定引物mSSCIR41；BC2鉴定引物mSSCIR190；mSSCIR43（見表2）。
PCR反应总体积20.0 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，模板DNA30 ng，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 nmol/L dNTPs 0.4 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，用蒸馏水补充体积至20.0 μL。反应程序，95 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物用7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
1.3 根尖细胞染色体观察及计数
根尖处理及染色体玻片制备参考黄玉新等[10]的方法，略有修改。2016年11～12月，将健康粗壮蔗茎（河八王用蔗兜），置于28 ℃恒温培养箱中，保湿沙培发根。每天上午10 ： 30～11 ： 00，剪取0.5～1 cm幼嫩根尖置于饱和对二氯苯水溶液室温预处理4 h，经0.075 mol/L KCl低渗1 h，现配的固定液（甲醛 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）4 ℃固定12 h以上后，70%酒精保存，置于4 ℃冰箱备用。 切取根尖分生区部位进行酶解，制备染色体玻片。先用0.25 mol/L HCl酸解10 min，再转入3.5%纤维素酶和1.75%果胶酶混合液，37 ℃恒温酶解8 h左右。酶解好的根尖，去离子水低渗30 min后，取2～3个根尖轻轻涂抹于干净的载玻片中，酒精灯上干燥。制好的玻片用改良苯酚卡宝品红染色20 min，于尼康正立荧光显微镜Ni下观察，选择15～20个分散完整的染色体拍照，取众数进行染色体计数。
2 结果与分析
2.1 河八王F1、BC1、BC2材料真实性鉴定
河八王F1代，桂糖05-3256做母本，河八王1号做父本，经SSR杂种鉴定，参试的5个材料都是真杂种（见图1）；BC1代，F1 10-6-33做母本，桂糖91-116做父本，经杂种鉴定参试材料都为真杂种（见图2）；BC2代，桂糖05-120做母本，BC114-53-4做父本，经杂种鉴定参试材料都为真杂种（见图3、4）。
2.2 河八王F1、BC1、BC2材料染色体观察
甘蔗与广西河八王1号属间杂交，其亲本和子代的染色体如图5和表3所示。由表3可知，GXN1染色体为30，其他亲本和子代的染色体数目不恒定，变幅在2～5条之间。在F1组合中，子代SNF110-6-11和SNF110-6-18的染色体均为84，SNF110-6-33为81，SNF110-6-12和SNF110-6-21分别为96和93。由此推断，SNF110-6-11、SNF110-6-18、SNF110-6-33基本遗传了母本GT05-3256 n配子（53）染色体，父本GXN1 2n配子（30）染色体。SNF110-6-12和SNF110-6-21则超过母本n配子（53）和父本2n配子（30）染色体之和（83）。以上分析表明，甘蔗与河八王杂交，F1染色体的遗传方式为n+2n，部分后代染色体发生加倍，超过亲本n+2n之和。
BC1组合中，以F1杂种SNF110-6-33为母本，其染色体为81，则n配子数为40或41，父本GT91-116的染色体为108，则n配子数为54，两亲本的配子数之和为94或95。BC1子代中，SNBC114-53-9和SNBC114-53-13染色体为94，SNBC114-53-7和SNBC114-53-23染色体为97，SNBC114-53-4染色体为98。由此推测，河八王F1与甘蔗杂交，染色体基本按“n+n”方式传递给BC1。
BC2组合中，甘蔗品系GT05-120为母本，染色体为104，BC1杂种SNBC114-53-4为父本，染色体为98，母本雌配子（52）与父本雄配子（49）数目之和为101。4个BC2的染色体数为106、102、102、106，由此推测，甘蔗与河八王BC1杂交，染色体基本按“n+n”方式传递给BC2。
3 讨论
甘蔗野生种质资源是甘蔗创新和遗传育种重要基础和优异性状的基因库。近年来国内外积极开展野生资源的收集、鉴定、评价与光周期诱导杂交利用等工作[11-15]。广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场主要对斑茅进行研究，目前已获一批含斑茅血缘的优良抗性亲本[15-17]。黄永吉等[18]和吴嘉云等[19]研究表明，斑茅染色体在不同世代遗传方式不同，F1、BC2、BC3为“n+n”的遗传方式，BC1则以“n+n”和“2n+n”的遗传方式，同时发现斑茅染色体在传递时发生易位，易位的染色体能稳定遗传。云南甘蔗研究所（含瑞丽育种站）侧重于滇蔗茅的杂交利用，滇蔗茅高抗锈病，是甘蔗抗锈病育种的理想抗源材料[14]。林秀琴等[20-21]的研究结果表明甘蔗与滇蔗茅杂交，F1和BC1的染色体遗传方式分别为n+n和2n+n。广西甘蔗研究所主要开展斑茅割手密复合体以及河八王的研究利用[7-8， 22]。黄玉新等[10， 23]的研究結果表明广西斑茅割手密复合体GXAS 07-6-1与甘蔗杂交，其F1、BC1和BC2的染色体遗传方式均为n+n。国外Lekshmi等[24]通过GISH分析，发现斑茅割手密复合体CYM 04-420与甘蔗杂交，其F1、BC2的染色体传递为n+n，而BC1为2n+n。
本研究中，广西河八王1号染色体为30，与前人报道一致[2-3]。观察的5个F1杂种体细胞染色体数目差异较大。SNF110-6-11、SNF110-6-18、SNF110-6-33染色体数为81～84，基本等于母本n配子和父本2n配子之和（83），而SNF110-6-12和SNF110-6-21染色体为93～96，超过亲本n+2n的遗传。F1形成两种不同类型的染色体，有可能是河八王染色体导入后影响了甘蔗同源染色体以及部分同源染色体的重组和分离，减数分裂过程产生不均等配子。Raghavan利用S. officinarum var. Vellai（2n=80）与Narenga（2n=30）杂交，获得2n=95和2n=55两种类型的F1后代，由此表明，热带种与河八王杂交，F1的染色体遗传为n+n和2n+n[3]。文颖[22]曾报道，大茎野生种（2n=84）与河八王属杂交，大部分杂种的染色体为2n=57，少数为2n=60和62，染色体基本按n+n方式传递；而割手密（2n=40）与河八王属杂交，染色体遗传方式为n+n，割手密（2n=64）与河八王属杂交，染色体遗传方式为2n+n。本研究结果与前人的研究结果不一致，有可能是选择的亲本不同。在BC1和BC2过程，子代的染色体数分别为94～98和102～106，双亲的单倍配子体数目之和分别为94/95和101，由此表明，BC1和BC2的染色体基本按n+n方式进行传递。
本研究从体细胞染色体观察计数研究了河八王染色体的遗传特点，推断了亲本染色体的遗传方式，但对于后代染色体的组成以及染色体传递过程中是否有易位染色体都尚未明确。下一步应该利用基因组原位杂交（GISH）技术，鉴定子代中双亲染色体的组成。 参考文献
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关键词 甘蔗；河八王；染色体传递
中图分类号 S566.1 文献标识码 A
Abstract To explore the chromosome transmission of parents in different generations，the somatic cell chromosomes of root-tips of the parents and F1， BC1 and BC2 progeny from the distant crossing between sugarcane（Saccharum spp.）× Narenga porphyrocoma（Hance）Bor were analyzed. Chromosomes were prepared following the wall degradation hypotonic method， five hybrids each generation were selected for chromosome counting and transmission analysis. Results showed that the somatic chromosome number of GXN1 was 30， while that for other accessions were non-constant and the amplitude was 2-5. The chromosomes of the parents were transmitted by n+2n in F1 progenies， but more than n+2n existed in some materials， and by n+n in BC1 and BC2 progenies， respectively. The results would provide a cytological reference for further utilization of the N. porphyrocoma （Hance）Bor in sugarcane breeding.
Key words Sugarcane； Narenga porphyrocoma（Hance）Bor； Chromosome transmission
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.001
河八王[Narenga porphyrocoma （Hance） Bor]是甘蔗近缘属河八王属（Narenga Bor）的一个种。具有较多甘蔗需要的经济性状，如早熟，分蘖力强，直立抗倒，抗赤腐病、花叶病和黑穗病[1]。利用甘蔗与河八王杂交获得的F1，植株直立、高大，茎径、锤度介于双亲之间；其抗逆性、宿根性等方面都超越母本甘蔗。因此，河八王在甘蔗遗传改良中具有重要的价值[2]。
国内外对河八王的研究不多。在杂交利用方面，仅见获得F1的报道[2-5]。近年来，刘昔辉等[6-7]利用SSR标记对甘蔗与广西河八王杂种F1后代进行真实性鉴定，并利用AFLP标记结合毛细管电泳对15份广西河八王无性系进行遗传多样性分析及分子身份证构建。罗霆等[8]研究表明河八王及其F1后代材料比桂糖系列新品种、ROC22、斑茅、割手密以及甘蔗与斑割复合体杂交后代等表现出更高的固氮能力，河八王F1杂种固氮率达到36.13%。
本课题利用甘蔗与广西河八王进行杂交，获得了一批真实杂种F1、BC1及BC2无性系材料，但甘蔗与河八王双亲染色体在不同世代中的传递情况目前尚未明确，限制了进一步杂交利用。本研究对甘蔗与广西河八王1号（GXN1）属间杂种F1、BC1和BC2进行染色体数目观察和传递分析，初步研究甘蔗与河八王染色体在不同世代的遗传特点，为提高河八王在甘蔗育种中的利用效率提供细胞学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为广西河八王1号（GXN1）与甘蔗杂交获得的F1、BC1、BC2无性系及其双亲共19个材料（见表1）。所有试验材料种植于广西农业科学院甘蔗种质资源圃。
1.2 试验材料真杂种鉴定
取试验材料幼嫩叶片，SDS法[9]提取基因组DNA。杂种F1真实性鉴定PCR引物mSSCIR198；BC1鉴定引物mSSCIR41；BC2鉴定引物mSSCIR190；mSSCIR43（見表2）。
PCR反应总体积20.0 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，模板DNA30 ng，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 nmol/L dNTPs 0.4 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，用蒸馏水补充体积至20.0 μL。反应程序，95 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物用7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
1.3 根尖细胞染色体观察及计数
根尖处理及染色体玻片制备参考黄玉新等[10]的方法，略有修改。2016年11～12月，将健康粗壮蔗茎（河八王用蔗兜），置于28 ℃恒温培养箱中，保湿沙培发根。每天上午10 ： 30～11 ： 00，剪取0.5～1 cm幼嫩根尖置于饱和对二氯苯水溶液室温预处理4 h，经0.075 mol/L KCl低渗1 h，现配的固定液（甲醛 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）4 ℃固定12 h以上后，70%酒精保存，置于4 ℃冰箱备用。 切取根尖分生区部位进行酶解，制备染色体玻片。先用0.25 mol/L HCl酸解10 min，再转入3.5%纤维素酶和1.75%果胶酶混合液，37 ℃恒温酶解8 h左右。酶解好的根尖，去离子水低渗30 min后，取2～3个根尖轻轻涂抹于干净的载玻片中，酒精灯上干燥。制好的玻片用改良苯酚卡宝品红染色20 min，于尼康正立荧光显微镜Ni下观察，选择15～20个分散完整的染色体拍照，取众数进行染色体计数。
2 结果与分析
2.1 河八王F1、BC1、BC2材料真实性鉴定
河八王F1代，桂糖05-3256做母本，河八王1号做父本，经SSR杂种鉴定，参试的5个材料都是真杂种（见图1）；BC1代，F1 10-6-33做母本，桂糖91-116做父本，经杂种鉴定参试材料都为真杂种（见图2）；BC2代，桂糖05-120做母本，BC114-53-4做父本，经杂种鉴定参试材料都为真杂种（见图3、4）。
2.2 河八王F1、BC1、BC2材料染色体观察
甘蔗与广西河八王1号属间杂交，其亲本和子代的染色体如图5和表3所示。由表3可知，GXN1染色体为30，其他亲本和子代的染色体数目不恒定，变幅在2～5条之间。在F1组合中，子代SNF110-6-11和SNF110-6-18的染色体均为84，SNF110-6-33为81，SNF110-6-12和SNF110-6-21分别为96和93。由此推断，SNF110-6-11、SNF110-6-18、SNF110-6-33基本遗传了母本GT05-3256 n配子（53）染色体，父本GXN1 2n配子（30）染色体。SNF110-6-12和SNF110-6-21则超过母本n配子（53）和父本2n配子（30）染色体之和（83）。以上分析表明，甘蔗与河八王杂交，F1染色体的遗传方式为n+2n，部分后代染色体发生加倍，超过亲本n+2n之和。
BC1组合中，以F1杂种SNF110-6-33为母本，其染色体为81，则n配子数为40或41，父本GT91-116的染色体为108，则n配子数为54，两亲本的配子数之和为94或95。BC1子代中，SNBC114-53-9和SNBC114-53-13染色体为94，SNBC114-53-7和SNBC114-53-23染色体为97，SNBC114-53-4染色体为98。由此推测，河八王F1与甘蔗杂交，染色体基本按“n+n”方式传递给BC1。
BC2组合中，甘蔗品系GT05-120为母本，染色体为104，BC1杂种SNBC114-53-4为父本，染色体为98，母本雌配子（52）与父本雄配子（49）数目之和为101。4个BC2的染色体数为106、102、102、106，由此推测，甘蔗与河八王BC1杂交，染色体基本按“n+n”方式传递给BC2。
3 讨论
甘蔗野生种质资源是甘蔗创新和遗传育种重要基础和优异性状的基因库。近年来国内外积极开展野生资源的收集、鉴定、评价与光周期诱导杂交利用等工作[11-15]。广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场主要对斑茅进行研究，目前已获一批含斑茅血缘的优良抗性亲本[15-17]。黄永吉等[18]和吴嘉云等[19]研究表明，斑茅染色体在不同世代遗传方式不同，F1、BC2、BC3为“n+n”的遗传方式，BC1则以“n+n”和“2n+n”的遗传方式，同时发现斑茅染色体在传递时发生易位，易位的染色体能稳定遗传。云南甘蔗研究所（含瑞丽育种站）侧重于滇蔗茅的杂交利用，滇蔗茅高抗锈病，是甘蔗抗锈病育种的理想抗源材料[14]。林秀琴等[20-21]的研究结果表明甘蔗与滇蔗茅杂交，F1和BC1的染色体遗传方式分别为n+n和2n+n。广西甘蔗研究所主要开展斑茅割手密复合体以及河八王的研究利用[7-8， 22]。黄玉新等[10， 23]的研究結果表明广西斑茅割手密复合体GXAS 07-6-1与甘蔗杂交，其F1、BC1和BC2的染色体遗传方式均为n+n。国外Lekshmi等[24]通过GISH分析，发现斑茅割手密复合体CYM 04-420与甘蔗杂交，其F1、BC2的染色体传递为n+n，而BC1为2n+n。
本研究中，广西河八王1号染色体为30，与前人报道一致[2-3]。观察的5个F1杂种体细胞染色体数目差异较大。SNF110-6-11、SNF110-6-18、SNF110-6-33染色体数为81～84，基本等于母本n配子和父本2n配子之和（83），而SNF110-6-12和SNF110-6-21染色体为93～96，超过亲本n+2n的遗传。F1形成两种不同类型的染色体，有可能是河八王染色体导入后影响了甘蔗同源染色体以及部分同源染色体的重组和分离，减数分裂过程产生不均等配子。Raghavan利用S. officinarum var. Vellai（2n=80）与Narenga（2n=30）杂交，获得2n=95和2n=55两种类型的F1后代，由此表明，热带种与河八王杂交，F1的染色体遗传为n+n和2n+n[3]。文颖[22]曾报道，大茎野生种（2n=84）与河八王属杂交，大部分杂种的染色体为2n=57，少数为2n=60和62，染色体基本按n+n方式传递；而割手密（2n=40）与河八王属杂交，染色体遗传方式为n+n，割手密（2n=64）与河八王属杂交，染色体遗传方式为2n+n。本研究结果与前人的研究结果不一致，有可能是选择的亲本不同。在BC1和BC2过程，子代的染色体数分别为94～98和102～106，双亲的单倍配子体数目之和分别为94/95和101，由此表明，BC1和BC2的染色体基本按n+n方式进行传递。
本研究从体细胞染色体观察计数研究了河八王染色体的遗传特点，推断了亲本染色体的遗传方式，但对于后代染色体的组成以及染色体传递过程中是否有易位染色体都尚未明确。下一步应该利用基因组原位杂交（GISH）技术，鉴定子代中双亲染色体的组成。 参考文献
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