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摘要[目的]为提高微生物法发酵合成共轭亚油酸（CLA）的产量，优化嗜酸乳杆菌生产共轭亚油酸的发酵条件。[方法]试验以亚油酸为底物，利用嗜酸乳杆菌合成共轭亚油酸，选取对CLA的生成量影响显著的几个因素：底物浓度、接种量、pH、发酵时间、发酵温度进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验优化发酵条件。 [结果]单因素试验得到的最优发酵条件为底物浓度1.0 mg/ml、接种量4%、初始pH 5.5、发酵时间48 h、发酵温度37 ℃。正交试验发现，底物浓度、发酵时间、发酵温度显著影响CLA的合成产量。最终得到的最优发酵条件为底物浓度为1.5 mg/ml、接种量2%、初始pH 5.5、发酵时间36 h、发酵温度33 ℃。用气质联用法对产物进行定性分析，证明产物是c9，t11 CLA。此时，CLA的产量为91.54 μg/ml。[结论]试验优化了共轭亚油酸的发酵条件，为更有效率地利用嗜酸乳杆菌生产共轭亚油酸提供了理论依据。
关键词共轭亚油酸；嗜酸乳酸杆菌；发酵条件
中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-272-04
共轭亚油酸（CLA）是亚油酸的同分异构体，是普遍存在于动物和人体内的天然活性营养物质[1]。作为一种营养物质，CLA从抗癌、减肥到防止动脉硬化、防治糖尿病等方面，都有广泛的应用，具有广阔的应用前景[2-7]。目前，CLA的合成方法主要有化学合成法、酶催化合成法、微生物合成法，目前合成CLA的最常用的方法是碱性异构化的化学方法，但化学合成的CLA的各种不同的异构体混杂在一起，这导致后期CLA的分离纯化变得尤其复杂和困难，为工业化生产带来很多不便。与之相比，CLA的微生物合成法由于亚油酸异构酶具有专一性，将亚油酸专一地转化成CLA（c9，t11），便于分离纯化。特别是乳酸菌，菌种易于获得且不容易被杂菌污染，易于培养，产CLA的能力与其他菌种相比相对较高，而且乳酸菌还是人体益生菌。相比于微生物合成法，酶催化合成法需要更高的生产成本。从分离工艺难易程度和经济学效应两方面比较，用乳酸菌合成共轭亚油酸具有更好的发展前景[8-12]。
笔者以嗜酸乳杆菌为试验菌种，以亚油酸为反应底物，采用MRS液体培养基培养菌种，分别探究底物浓度、接种量、初始pH、培养时间和培养温度对CLA产量的影响。根据单因素结果采用正交试验，通过方差分析法，得到了最优发酵培养条件。发酵液中的CLA经有机溶剂萃取后，用气质联用法进行定性分析，确定产物成分为c9，t11。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种与培养基。选择嗜酸乳杆菌为试验菌种，菌种由山东大学提供，试验之前先对菌种进行活化。
MRS培养基（W/V）：葡萄糖2%，柠檬酸三铵0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%，蛋白胨1.0%，乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.2%，酵母粉0.5%，牛肉膏1.0%，吐温80 0.1%（V/V）。亚油酸乳化后，再过滤除菌，根据需要加入培养基。
1.1.2主要试剂。蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、亚油酸等，国药集团化学试剂有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司；浓硫酸，无锡市展望化工试剂有限公司。
1.1.3主要仪器。TU1901型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；气质联用仪，江苏万科科教仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；恒温培养箱，上海制成分析仪器制造有限公司。
1.2方法
1.2.1发酵液中CLA生成量的测定。该试验以最终发酵产物中CLA的产量为评价指标，采用紫外检测法测定CLA的含量[13]。用正己烷将CLA纯品稀释成不同的浓度，然后以正己烷为空白对照，测定不同浓度CLA在波长233 nm处的吸光值，并绘制成标准曲线（图1），得到线性回归方程为y=0.127 9x+0.025 6，R2=0.999 7。
图1CLA紫外吸收标准曲线发酵结束之后，将发酵液倒入50 ml的离心管中，在5 000 r/min的条件下离心5 min。离心后将上清液倒入250 ml的分液漏斗中，加入25 ml的正己烷萃取，之后静置分层，下层丢弃，上层用蒸馏水水洗2次，将水层弃去后用无水硫酸钠将上层干燥。之后将上清液取出定容到25 ml。随后从中吸取1 ml，并用正己烷定容到15 ml，以正己烷为参比，测定其在波长233 nm处的紫外吸光值。
由CLA紫外吸收曲线可知，CLA的浓度为：c=A-0.0250.127，发酵液中CLA的生成量为c×15×2530 μg/ml。
1.2.2单因素试验。
1.2.2.1底物浓度对CLA产量的影响。接种量为2%，培养温度37 ℃，发酵24 h，初始pH为6.8，底物浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ml，其他条件均相同，考察底物浓度对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的底物浓度。
1.2.2.2接种量对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量分别为0%、2%、4%、6%、8%，培养温度37 ℃，发酵24 h，初始pH为6.8，其他条件均相同，考察接种量对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的接种量。
1.2.2.3初始pH对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量采用“1.2.2.2”得出的最佳接种量，培养温度37 ℃，发酵24 h，初始pH分别为50、5.5、6.0、6.5、7.0，其他条件均相同，考察初始pH对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的初始pH。 1.2.2.4培养时间对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量采用“1.2.2.2”得出的最佳接种量，培养温度37 ℃，初始pH采用“1.2.2.3”得出的最佳初始pH，发酵时间分别为12、24、36、48、60 h，其他条件均相同，考察培养时间对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的培养时间。
1.2.2.5培养温度对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量采用“1.2.2.2”得出的最佳接种量，初始pH采用“1.2.2.3”得出的最佳初始pH，发酵时间采用“1.2.2.4”得出的最佳发酵时间，培养温度分别为25、29、33、37、41 ℃，其他条件均相同，考察培养温度对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的培养温度。
1.2.3正交试验。根据单因素试验的结果，选择合适的正交表进行正交试验，每组试验进行3次重复，并对正交试验的结果进行方差分析，得出最优发酵条件[14]。
1.2.4气质联用法定性分析。在最佳培养条件下发酵合成CLA，将发酵液与200 ml的氯仿甲醇（2∶1）溶液混合，均质5 min，再用冷冻离心机在4 ℃，5 000 r/min条件下离心5 min，弃去上层，下层用无水硫酸钠干燥，之后将干燥好的溶液转移到旋转蒸发仪中蒸发，在30 ℃条件下蒸去大多数溶剂，剩余部分转移到离心管中用氮气将剩余溶剂吹走。向剩余的物质中加入1 ml 1 mol/L的硫酸甲醇溶液，并在60 ℃条件下水浴30 min，水浴结束后自然冷却。然后加入1 ml的正己烷，振荡30 s，用冷冻离心机在4 ℃、5 000 r/min条件下离心5 min，用GCMS进行定性分析，亚油酸标品经相同处理后作对照。选用CPSil88（100 m×0.25 mm×0.25 μm）强极性色谱柱，升温程序：色谱柱的初温140 ℃，在此温度下维持5 min，然后再以7 ℃/min的速度将温度上升至175 ℃，在此温度下维持5 min，再以5 ℃/min的速度将温度上升至200 ℃，最后再以0.3 ℃/min的速度将温度上升至210 ℃，维持15 min。载气为氦气，进样口的温度为220 ℃，流速为1.0 ml/min，进样量为1.0 μl，分流比为30∶1，检测器的温度为220 ℃。选用EI离子源，其温度为220 ℃，连接口的温度为250 ℃，扫描质量数的范围设为100～350。
安徽农业科学2015年2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1底物浓度对CLA产量的影响。根据“1.2.2.1”的试验条件，进行底物浓度对CLA产量的影响试验。由图2可知，底物浓度在0～1.0 mg/ml范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在底物浓度为1.0 mg/ml的时候达到最高值。但当底物浓度大于1.0 mg/ml时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为亚油酸对细胞有毒害作用，它的浓度过高会抑制细胞和酶的活性，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，底物浓度控制在1.0 mg/ml左右比较合适。
图2底物浓度对CLA产量的影响2.1.2接种量对CLA产量的影响。根据“1.2.2.2”的试验条件，进行接种量对CLA产量影响的试验，试验结果如图 3所示。接种量在0～4%范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在接种量为4%的时候达到最高值。但当接种量大于4%时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为接种量过多时培养液中的营养物质相对不足，微生物活性不高，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，接种量应控制在4%左右比较合适。
图3接种量对CLA产量的影响2.1.3初始pH对CLA产量的影响。根据“1.2.2.3”的试验条件，进行初始pH对CLA产量影响的试验。紫外检测结果如图4所示，初始pH在5.0～5.5范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在初始pH为5.5的时候达到最高值。但当初始pH大于5.5时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为每种微生物都有适合自己生长的最适pH，培养液pH过高或过低都会影响微生物的活性，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，初始pH应控制在5.5左右比较合适。
图4初始pH对CLA产量的影响2.1.4培养时间对CLA产量的影响。根据“1.2.2.4”的试验条件，进行培养时间对CLA产量影响的试验。结果如表5所示，培养时间在12～48 h范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在培养时间为48 h的时候达到最高值。但当培养时间大于48 h时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为一方面，随时间的延长微生物生长进入衰退期，活性降低，产CLA的能力下降；另一方面，随时间的延长，部分已生成的CLA可能逐渐发生硬脂化，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，培养时间应控制在48 h左右比较合适。
图5培养时间对CLA产量的影响2.1.5培养温度对CLA产量的影响。根据试验“1.2.2.5”的试验条件，进行培养温度对CLA产量影响的试验。结果如图6所示，培养温度在25～37 ℃范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在培养温度为37 ℃的时候达到最高值。但当培养温度大于37 ℃时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为亚油酸受到亚油酸异构酶的催化从而转化生成为CLA，而每种酶都有最适温度，环境的温度太高或太低都会影响酶活，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，培养温度为37 ℃左右时有利于CLA的合成。
图6培养温度对CLA产量的影响2.2正交试验结果根据单因素试验结果结合相关文献资料，选取对CLA的生成量影响显著的4个因素：底物浓度、接种量、培养时间、培养温度进行正交试验，各因素水平如表1所示，选择L9（34）正交表进行正交试验，试验方案及试验结果如表2所示。 结果表明，A3B1C1D1为最优组合条件，在此条件下，CLA的生成量经计算为91.54 μg/ml。最终得到的最优发酵条件为底物浓度为1.5 mg/ml，接种量2%，初始pH为5.5，培养时间36 h，培养温度33 ℃。
2.3气质联用定性分析结果根据试验“1.2.4”的试验条件，用气质联用法对产物进行定性分析，结果如图7所示。由图7可以看出，与亚麻酸标品色谱图（图7a）相比，产物色谱图（图7b）中生成了一种新的物质，这种物质的化学结构经质谱分析结构如图8所示，为c9，t11CLA，得出亚油酸在试验所给条件下，转化生成了c9，t11CLA。
图7发酵产物成分检测图8发酵产物结构分析3结论
以最终发酵产物中CLA的产量为评价指标，通过单因素和正交试验优化了嗜酸乳杆菌合成共轭亚油酸的工艺条件。单因素试验确定了较优发酵条件分别为底物浓度10 mg/ml、接种量 4%、初始pH 5.5、培养时间48 h和培养温度37 ℃。根据单因素试验结果结合相关文献资料，采用正交试验进一步研究了底物浓度、接种量、培养时间、培养温度对CLA的产量的影响，最终得到的最优发酵条件为底物浓度为1.5 mg/ml、接种量2%、初始pH为5.5、培养时间36 h和培养温度33 ℃。并用气质联用法对发酵产物成分进行了分析，证明产物是c9，t11CLA，此时，CLA的产量为91.54 μg/ml。
参考文献
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关键词共轭亚油酸；嗜酸乳酸杆菌；发酵条件
中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-272-04
共轭亚油酸（CLA）是亚油酸的同分异构体，是普遍存在于动物和人体内的天然活性营养物质[1]。作为一种营养物质，CLA从抗癌、减肥到防止动脉硬化、防治糖尿病等方面，都有广泛的应用，具有广阔的应用前景[2-7]。目前，CLA的合成方法主要有化学合成法、酶催化合成法、微生物合成法，目前合成CLA的最常用的方法是碱性异构化的化学方法，但化学合成的CLA的各种不同的异构体混杂在一起，这导致后期CLA的分离纯化变得尤其复杂和困难，为工业化生产带来很多不便。与之相比，CLA的微生物合成法由于亚油酸异构酶具有专一性，将亚油酸专一地转化成CLA（c9，t11），便于分离纯化。特别是乳酸菌，菌种易于获得且不容易被杂菌污染，易于培养，产CLA的能力与其他菌种相比相对较高，而且乳酸菌还是人体益生菌。相比于微生物合成法，酶催化合成法需要更高的生产成本。从分离工艺难易程度和经济学效应两方面比较，用乳酸菌合成共轭亚油酸具有更好的发展前景[8-12]。
笔者以嗜酸乳杆菌为试验菌种，以亚油酸为反应底物，采用MRS液体培养基培养菌种，分别探究底物浓度、接种量、初始pH、培养时间和培养温度对CLA产量的影响。根据单因素结果采用正交试验，通过方差分析法，得到了最优发酵培养条件。发酵液中的CLA经有机溶剂萃取后，用气质联用法进行定性分析，确定产物成分为c9，t11。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种与培养基。选择嗜酸乳杆菌为试验菌种，菌种由山东大学提供，试验之前先对菌种进行活化。
MRS培养基（W/V）：葡萄糖2%，柠檬酸三铵0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%，蛋白胨1.0%，乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.2%，酵母粉0.5%，牛肉膏1.0%，吐温80 0.1%（V/V）。亚油酸乳化后，再过滤除菌，根据需要加入培养基。
1.1.2主要试剂。蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、亚油酸等，国药集团化学试剂有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司；浓硫酸，无锡市展望化工试剂有限公司。
1.1.3主要仪器。TU1901型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；气质联用仪，江苏万科科教仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；恒温培养箱，上海制成分析仪器制造有限公司。
1.2方法
1.2.1发酵液中CLA生成量的测定。该试验以最终发酵产物中CLA的产量为评价指标，采用紫外检测法测定CLA的含量[13]。用正己烷将CLA纯品稀释成不同的浓度，然后以正己烷为空白对照，测定不同浓度CLA在波长233 nm处的吸光值，并绘制成标准曲线（图1），得到线性回归方程为y=0.127 9x+0.025 6，R2=0.999 7。
图1CLA紫外吸收标准曲线发酵结束之后，将发酵液倒入50 ml的离心管中，在5 000 r/min的条件下离心5 min。离心后将上清液倒入250 ml的分液漏斗中，加入25 ml的正己烷萃取，之后静置分层，下层丢弃，上层用蒸馏水水洗2次，将水层弃去后用无水硫酸钠将上层干燥。之后将上清液取出定容到25 ml。随后从中吸取1 ml，并用正己烷定容到15 ml，以正己烷为参比，测定其在波长233 nm处的紫外吸光值。
由CLA紫外吸收曲线可知，CLA的浓度为：c=A-0.0250.127，发酵液中CLA的生成量为c×15×2530 μg/ml。
1.2.2单因素试验。
1.2.2.1底物浓度对CLA产量的影响。接种量为2%，培养温度37 ℃，发酵24 h，初始pH为6.8，底物浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ml，其他条件均相同，考察底物浓度对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的底物浓度。
1.2.2.2接种量对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量分别为0%、2%、4%、6%、8%，培养温度37 ℃，发酵24 h，初始pH为6.8，其他条件均相同，考察接种量对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的接种量。
1.2.2.3初始pH对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量采用“1.2.2.2”得出的最佳接种量，培养温度37 ℃，发酵24 h，初始pH分别为50、5.5、6.0、6.5、7.0，其他条件均相同，考察初始pH对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的初始pH。 1.2.2.4培养时间对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量采用“1.2.2.2”得出的最佳接种量，培养温度37 ℃，初始pH采用“1.2.2.3”得出的最佳初始pH，发酵时间分别为12、24、36、48、60 h，其他条件均相同，考察培养时间对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的培养时间。
1.2.2.5培养温度对CLA产量的影响。底物浓度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物浓度，接种量采用“1.2.2.2”得出的最佳接种量，初始pH采用“1.2.2.3”得出的最佳初始pH，发酵时间采用“1.2.2.4”得出的最佳发酵时间，培养温度分别为25、29、33、37、41 ℃，其他条件均相同，考察培养温度对CLA产量的影响。每组试验进行3次重复，结果取其平均值，选取较为适宜的培养温度。
1.2.3正交试验。根据单因素试验的结果，选择合适的正交表进行正交试验，每组试验进行3次重复，并对正交试验的结果进行方差分析，得出最优发酵条件[14]。
1.2.4气质联用法定性分析。在最佳培养条件下发酵合成CLA，将发酵液与200 ml的氯仿甲醇（2∶1）溶液混合，均质5 min，再用冷冻离心机在4 ℃，5 000 r/min条件下离心5 min，弃去上层，下层用无水硫酸钠干燥，之后将干燥好的溶液转移到旋转蒸发仪中蒸发，在30 ℃条件下蒸去大多数溶剂，剩余部分转移到离心管中用氮气将剩余溶剂吹走。向剩余的物质中加入1 ml 1 mol/L的硫酸甲醇溶液，并在60 ℃条件下水浴30 min，水浴结束后自然冷却。然后加入1 ml的正己烷，振荡30 s，用冷冻离心机在4 ℃、5 000 r/min条件下离心5 min，用GCMS进行定性分析，亚油酸标品经相同处理后作对照。选用CPSil88（100 m×0.25 mm×0.25 μm）强极性色谱柱，升温程序：色谱柱的初温140 ℃，在此温度下维持5 min，然后再以7 ℃/min的速度将温度上升至175 ℃，在此温度下维持5 min，再以5 ℃/min的速度将温度上升至200 ℃，最后再以0.3 ℃/min的速度将温度上升至210 ℃，维持15 min。载气为氦气，进样口的温度为220 ℃，流速为1.0 ml/min，进样量为1.0 μl，分流比为30∶1，检测器的温度为220 ℃。选用EI离子源，其温度为220 ℃，连接口的温度为250 ℃，扫描质量数的范围设为100～350。
安徽农业科学2015年2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1底物浓度对CLA产量的影响。根据“1.2.2.1”的试验条件，进行底物浓度对CLA产量的影响试验。由图2可知，底物浓度在0～1.0 mg/ml范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在底物浓度为1.0 mg/ml的时候达到最高值。但当底物浓度大于1.0 mg/ml时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为亚油酸对细胞有毒害作用，它的浓度过高会抑制细胞和酶的活性，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，底物浓度控制在1.0 mg/ml左右比较合适。
图2底物浓度对CLA产量的影响2.1.2接种量对CLA产量的影响。根据“1.2.2.2”的试验条件，进行接种量对CLA产量影响的试验，试验结果如图 3所示。接种量在0～4%范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在接种量为4%的时候达到最高值。但当接种量大于4%时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为接种量过多时培养液中的营养物质相对不足，微生物活性不高，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，接种量应控制在4%左右比较合适。
图3接种量对CLA产量的影响2.1.3初始pH对CLA产量的影响。根据“1.2.2.3”的试验条件，进行初始pH对CLA产量影响的试验。紫外检测结果如图4所示，初始pH在5.0～5.5范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在初始pH为5.5的时候达到最高值。但当初始pH大于5.5时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为每种微生物都有适合自己生长的最适pH，培养液pH过高或过低都会影响微生物的活性，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，初始pH应控制在5.5左右比较合适。
图4初始pH对CLA产量的影响2.1.4培养时间对CLA产量的影响。根据“1.2.2.4”的试验条件，进行培养时间对CLA产量影响的试验。结果如表5所示，培养时间在12～48 h范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在培养时间为48 h的时候达到最高值。但当培养时间大于48 h时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为一方面，随时间的延长微生物生长进入衰退期，活性降低，产CLA的能力下降；另一方面，随时间的延长，部分已生成的CLA可能逐渐发生硬脂化，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，培养时间应控制在48 h左右比较合适。
图5培养时间对CLA产量的影响2.1.5培养温度对CLA产量的影响。根据试验“1.2.2.5”的试验条件，进行培养温度对CLA产量影响的试验。结果如图6所示，培养温度在25～37 ℃范围内，CLA的生成量呈上升趋势，并且在培养温度为37 ℃的时候达到最高值。但当培养温度大于37 ℃时，CLA的生成量反而减少。这可能是因为亚油酸受到亚油酸异构酶的催化从而转化生成为CLA，而每种酶都有最适温度，环境的温度太高或太低都会影响酶活，从而导致CLA的生成量降低。综合考虑，培养温度为37 ℃左右时有利于CLA的合成。
图6培养温度对CLA产量的影响2.2正交试验结果根据单因素试验结果结合相关文献资料，选取对CLA的生成量影响显著的4个因素：底物浓度、接种量、培养时间、培养温度进行正交试验，各因素水平如表1所示，选择L9（34）正交表进行正交试验，试验方案及试验结果如表2所示。 结果表明，A3B1C1D1为最优组合条件，在此条件下，CLA的生成量经计算为91.54 μg/ml。最终得到的最优发酵条件为底物浓度为1.5 mg/ml，接种量2%，初始pH为5.5，培养时间36 h，培养温度33 ℃。
2.3气质联用定性分析结果根据试验“1.2.4”的试验条件，用气质联用法对产物进行定性分析，结果如图7所示。由图7可以看出，与亚麻酸标品色谱图（图7a）相比，产物色谱图（图7b）中生成了一种新的物质，这种物质的化学结构经质谱分析结构如图8所示，为c9，t11CLA，得出亚油酸在试验所给条件下，转化生成了c9，t11CLA。
图7发酵产物成分检测图8发酵产物结构分析3结论
以最终发酵产物中CLA的产量为评价指标，通过单因素和正交试验优化了嗜酸乳杆菌合成共轭亚油酸的工艺条件。单因素试验确定了较优发酵条件分别为底物浓度10 mg/ml、接种量 4%、初始pH 5.5、培养时间48 h和培养温度37 ℃。根据单因素试验结果结合相关文献资料，采用正交试验进一步研究了底物浓度、接种量、培养时间、培养温度对CLA的产量的影响，最终得到的最优发酵条件为底物浓度为1.5 mg/ml、接种量2%、初始pH为5.5、培养时间36 h和培养温度33 ℃。并用气质联用法对发酵产物成分进行了分析，证明产物是c9，t11CLA，此时，CLA的产量为91.54 μg/ml。
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