【目的】对限制性位点扩增多态性(Restriction site amplified polymorphism,RSAP)标记技术进行改进,并优化了其反应体系。【方法】遵循引物设计原则,使限制性位点序列位于中间,在其3′端增加3个选择性碱基,5′端设计为10~12个碱基的随机序列,设计了14条长为19 bp的限制性位点扩增多态性(RSAP)新引物。以大白菜、紫菜薹自交系及其F1、F2的DNA为模板,对新引物的反应体系进行了优化,并对其重复性和适用性进行了检验。【结果】新设计引物PCR扩增的前5个循环退火温度为35℃,后35个循环为52℃;在25μL优化反应体系中,模板DNA用量为2.0μL(20.0 ng/μL)、Mg2+3.0μL(25 mmol/L)、Taq酶(5 U/μL)1.5 U、dNTPs 2.0μL(2.5 mmol/L)、引物各0.6μL(10μmol/L);新引物扩增出的谱带较原引物更多,多态性更好;只改变选择性碱基,新设计引物就能扩增出新的谱带;新设计引物的重复性、稳定性好,在荞麦和小麦品系,以及紫菜薹、大白菜及其F1、F2中,新引物均能扩增出清晰谱带。【结论】新引物适用性和重复性好,可广泛应用于其他作物的基因组DNA分析。